预防动物口蹄疫病毒的感染的重组蛋白疫苗及其用途

摘要

本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白；这种重组蛋白疫苗的氨基酸序列及其编码核苷酸序列；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全编码区的核苷酸序列；含有卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白的编码核苷酸的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，以及该重组蛋白疫苗的制备方法。本发明的融合蛋白在应用于动物后可有效地预防口蹄疫病毒的感染。

说明书

发明领域

本发明涉及一种基因工程领域，具体地涉及基因工程重组蛋白疫苗(下文有时也称为“基因工程重组蛋白”)，特别是涉及一种预防动物口蹄疫病毒感染的由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重组蛋白疫苗；编码这种重组蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有时也称为“基因”)；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全编码区的核苷酸序列；卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白的融合方式；含有编码由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重组蛋白疫苗的核苷酸的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，以及该重组蛋白疫苗的制备方法；本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。

发明背景

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病，FMDV最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等。患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状，恶性口蹄疫还会导致病畜心脏麻痹并迅速死亡。此病传染范围大，速度快，一旦爆发，必须迅速捕杀病畜及可疑感染动物，并对疫区进行彻底消毒。口蹄疫的每次爆发流行，都意味着巨大的经济损失。例如，1951-1952年在英法爆发的口蹄疫造成的损失竟高达1.43亿英镑。因此，世界各国都将其列为一类传染病而认真对待，并采取积极措施防止发生。

口蹄疫的病原体是口蹄疫病毒，它是一种滤性小核糖核酸(ssRNA)病毒。口蹄疫病毒一般可分7种类型：A、C、O、亚洲一型和南非一至三型。每一型之中又分出很多亚型。一般认为，各型口蹄疫病毒之间不能诱生交互免疫。

FMD病毒的基因组约有7500-8000个碱基，病毒的核衣壳蛋白(亦称壳蛋白，viral capsid protein VP)分四部分，依次为VP4、VP2、VP3、VP1。其中，VP1蛋白可诱导保护性的体液免疫应答，其中的由第135-158位氨基酸构成的肽段具有较强的免疫原性，可以诱发出高水平的蛋白抗体和病毒中和抗体；第141-159之间的肽段被认为是B细胞和T细胞识别的强抗原决定簇。在1982年，Pfaff E，Mussgay M，Bohm HO等第一次证明，根据FMDV的VP1壳蛋白上的一段序列人工合成的小肽能够产生具有保护作用的抗口蹄疫病毒的中和性抗体(Pfaff E，Mussgay M，BohmHO，Antibodies against a preselected peptide recognize andneutralize foot and mouth disease virus，EMBO J 1982；1(7)：869-74)。其后，在豚鼠、猪、羊的实验中还发现，仅在FMDV的VP1蛋白的141-160位氨基酸N末端融合了β-半乳糖甘酶的肽段并不能产生持久的免疫原性，然而，通过将VP1蛋白的141-160位氨基酸以某种融合蛋白(例如：与乙型肝炎核心抗体)的方式表达于一些载体上(如KLH)，可以明显提高这段小肽的免疫原性。VP1基因编码的重组蛋白在动物体内诱导机体产生全方位的免疫应答(表现为产生特异性的中和抗体、细胞毒T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)，对口蹄疫病毒具有预防作用。

伴侣蛋白10(Chaperonin 10)是分子伴侣大家族的一个成员。人、牛、鼠的伴侣蛋白10氨基酸序列具有近100％的同源性。实验发现卡介苗伴侣蛋白10在豚鼠体内可以诱导出针对“O1Lausanne”型口蹄疫病毒的抗体。这种伴侣蛋白10肽段的C-末端的组蛋白结构与“O”性口蹄疫病毒的表位相似，这可能是伴侣蛋白10诱发机体对口蹄疫病毒保护性免疫反应的一种机理(Amadori M，Archetti IL，Scaccaglia P，Chaperonin 10 ofmycobacterium tuberculosis induces a protective immune response tofoot-and-mouth disease virus).Arch Virol 1999；144(5)：905-19)。

发明内容

本发明的一方面是提供一种基因工程重组疫苗，它是将卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合在一起而生产的，并且对动物的口蹄疫病毒感染有预防作用。

本发明的另一方面是提供一种编码“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的全结构基因序列和由其编码的蛋白质的氨基酸的序列。

本发明的另一方面是提供一种编码这种重组蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。

本发明的另一方面是提供一种含有该核苷酸序列的表达载体。

本发明的另一方面是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的另一方面是提供一种用卡介苗伴侣蛋白10基因融合口蹄疫病毒VP1基因生产预防口蹄疫病毒感染的基因工程疫苗的方法。

本发明的另一方面涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物的口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途。

本发明的又一方面涉及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。

因此，正是本发明人经过长期的大量的研究，解决了现有技术中的技术难题，首次开拓性地将卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原相连形成了全新的基因工程重组蛋白，从而提供了全新的用于预防动物的口蹄疫病毒感染的疫苗。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和其它具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

附图简要说明附图1：本发明的重组蛋白疫苗的制备过程流程图解。附图2：口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原核苷酸琼脂糖电泳图，其中泳道

   1是Mark，TaKaRa Code No：A1022，DL 2000；泳道2是FMDV-

   VP1(639bp)。附图3：融合蛋白的表达及纯化SDS-PAGE电泳图(34.5kDa)，其中泳道

   1是纯化后的目的蛋白，泳道2是空白对照，泳道3是Mark，

   TaKaRa Code No：C302，泳道4是目的基因的表达蛋白。附图4：Chaperonin10核苷酸琼脂糖电泳图，其中泳道1是Mark，TaKaRa

   Code No：A1022，DL 2000；泳道2是caperonin(303bp)。附图5：融合蛋白基因核苷酸酶切琼脂糖电泳图，其中泳道1是PET28+VP1

   酶切片段(片段大小约650 bp)，泳道2是Mark，TaKaRa Code No：

   A1033，DL 1500。附图6：融合基因表达载体的构建图，其中图6(1)为表达载体上目的基因

   插入片段的部位及酶切位点，图6(2)为表达载体构建成功后的质粒

   图谱。

具体实施方式

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

重组蛋白疫苗：利用基因工程技术，将具有较强免疫原性的一个或多个基因片段克隆到原核或真核细胞的表达载体上，将表达载体转入细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)，利用此细菌或真核细胞生产的具有较强免疫原性的一个或多个基因片段编码的蛋白质称为重组蛋白疫苗。这种疫苗在应用于机体后可诱导机体产生抗原特异性的记忆性淋巴细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)，这些记忆性的淋巴细胞在接触到相应的病原体后可迅速增殖、反应，通过产生抗体的方式或特异性杀伤细胞的方式抑制或该杀伤病原体。

伴侣蛋白10(Chaperonin10)：是一种从卡介苗中分离出来的分子量为10kDa的热激蛋白，它具有如SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列，SEQ IDNO 15所示的氨基酸序列。

口蹄疫病毒VP1抗原：是FMD病毒壳蛋白的一部分，它可诱导机体产生具有保护作用的口蹄疫病毒中和抗体。在本发明中，它具有SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

动物的口蹄疫病毒(FMDV)感染：是由FMDV引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、羊、鹿等。FMDV是一种滤性小核糖核酸(ssRNA)病毒，病毒颗粒基因组约包含7500-8000个碱基。FMDV主要以唾液的方式传播，传播的速度很快、易形成大面积的流行。

本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白，其中卡介苗伴侣蛋白10可以位于该融合蛋白的氨基端，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原位于该融合蛋白的羧基端。本发明的重组蛋白疫苗中，所述的“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的编码基因优选地具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该“O”型口蹄疫病毒VP1抗原优选地具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而卡介苗伴侣蛋白10优选地具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。本发明的重组蛋白疫苗优选地具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，而其编码基因优选地具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明的重组蛋白疫苗具有选自如下的任一氨基酸序列：

1)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列，该核苷酸序列可以具有选自如下的任一序列：

1)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与1)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

“O”型口蹄疫病毒来自中国内蒙古金宇集团生物制药厂，其VP1抗原的核苷酸序列由我们自行设计的引物通过逆转录反应及DNA聚合酶链式反应获得(序列如SEQ ID NO：5-11所示)。卡介苗伴侣蛋白10是一种来源于卡介苗的基因片段，它在和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原形成融合蛋白后(其基因编码序列和氨基酸序列可以分别如SEQ ID NO：3，4所示)，可以诱发机体产生针对FMDV的中和性抗体。

本发明的重组蛋白疫苗可通过本领域已知的方法，例如参考文献Nilsson C，Sutter G，Walther-Jallow L，et al.Immunization with recombinantmodified vaccinia virus Ankara can modify mucosal simian immunodeficiencyvirus infection and delay disease progression in macaques(重组修饰的安卡拉病毒疫苗可以控制恒和猴黏膜免疫缺陷性病毒的感染及延迟疾病的进展)。J Gen Virol 2002 Apr；83(Pt 4)：807-18.所述进行生产，以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的重组蛋白疫苗的方法。

因此，本发明还提供了含有上述编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，其可以为本领域常规的各种原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞；以及该重组蛋白疫苗的基因工程制备方法。

另外，本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。本领域技术人员可以理解的是，这些疫苗制品可用本领域周知的各种常规方法制备。

本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给动物接种，接种的剂量为100-500μg。为了加强效果，可在第一次免疫后14或21天进行1次加强免疫。

下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)所述的方法。

实施例1获取卡介苗伴侣蛋白10的编码基因

卡介苗来源于长春生物制品研究所。采用马铃薯培养基(StarchPotato Code No：C250-1，Sigma分装北京鼎国生物)培养卡介苗，培养的温度为37-39℃，生长出的卡介苗呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜，从中提取卡介苗基因组DNA。

提取卡介苗基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，从哺乳动物分离高分子量DNA(Isolat ion of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。

采用PCR方法自卡介苗分离伴侣蛋白10结构基因。采用的5’端引物序列为5’CCATGGCGAAGGTGAACATCAA 3’(SEQ ID NO：12)，3’端引物序列为5’CTAGAATTCCTTGGAAACGACGGCCAGC 3’(SEQ ID NO：13)。

所述PCR操作程序是：在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

模板cDNA                            5μl(mmol/L)

10×PCR缓冲液                       5μl

(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，

15mmol/L MgCl₂)

dNTPs(10mmol/L)                     1μl

5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各      0.5μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl)               0.25μl

加去离子水至终体积                  50μl

混合后加入矿物油                    3滴

反应条件：94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。序列如SEQ ID No：14所示。实例2：采用TA克隆方法克隆PCR产物

TA克隆的载体为PMD18-TVector(pMD 18-TVector Code No：D504A，TaKaRa)。方法如下：一DNA的回收：(下列回收试剂均来自中国大连宝生物工程有限公司，TaKaRa-DNA回收试剂盒Code No：D301)1将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳(1xTAE，150-200mA，20分钟)；2从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中；3加入3倍体积的溶胶液B，45-55°水浴10min使胶完全融化；4将含有DNA凝胶的溶液B移入过滤柱中，室温静止2分钟；5加入500毫升溶液C于过滤柱中，洗脱一次：5000g离心60秒，弃滤液；6再次加入500毫升溶液C于过滤柱中，洗脱后同上离心，弃滤液；7将过滤柱至于室温下干燥30-60分钟，加入溶液D30-50毫升，室温静止2分钟；812000g离心1分钟，收集的滤液为含有DNA片段的溶液D；9-20℃保存收集液，备用。二连接反应：

1取3-5ul上清液电泳，并在紫外灯下观察电泳带，与marker(10ng/ul)相比较，估计回收DNA浓度；2连接反应体系Insert DNA(SEQ ID NO 14)                  0.05-0.3pmol

         pMD18-TVector                             0.5-1ul

         Solution I                                5ul

         (Ligation Solutionl Code No：D504A，TaKaRa)

         DH₂O加至                                 10ul

                           16℃反应1小时三转化：

转化的方法是：将100ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO，混合后，加入10μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；加入1ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；4,000Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置10分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。

感受态细胞的制备方法是：将大肠杆菌GM109(JM109 Code No：Y001，北京鼎国生物)在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)；将菌液冰浴2小时，然后2,500Xg，4℃离心20分钟收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl₂，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；1800Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；按每份200ul分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。

四鉴定：由北京鼎国生物技术发展中心进行DNA的测序。测序结果无误(具体序列参见SEQ ID No：14，其琼脂糖电泳图见附图4)。

五菌种及保存：重组质粒冰冻保存于-20℃。含重组质粒的菌株在含20％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。

按常规方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis)1.21-1.32，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。实施例3.“O”型口蹄疫病毒RNA的获得：

利用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)提取细胞培养液中的口蹄疫病毒(中国内蒙古金宇集团生物制药厂)的RNA；具体的步骤如下：

1.将300ul含口蹄疫病毒的细胞培养液与600ul无水乙醇混合后室温静止10分钟，10000Xg离心10分钟。

2.弃上清，用1ml Trizol试剂裂解细胞沉淀，摇动混合后，室温孵育10分钟。

3.加入200ul氯仿震荡混匀15秒，室温3分钟。

4.10000Xg，4℃离心15分钟，将水相转移至另一离心管中，加入500ul异丙醇，混合后室温下沉淀10分钟，10000Xg，离心10分钟。

5.弃上清，加入1ml 75％乙醇，8000Xg，离心10分钟。

6.弃上清，室温下空气蒸发残余乙醇，无色、透明的FMD病毒RNA附着于试管底部。实施例4.采用逆转录反应及两轮PCR获得“O”型口蹄疫病毒的VP1抗原核苷酸序列。一.采用逆转录反应获得“O”型口蹄疫病毒的cDNA逆转录反应的特异性引物由我们自行设计，序列为：5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO：5)逆转录方法：1.在提取的病毒RNA沉淀中加入：特异性引物(10uM)        1ulDEPC-水                 9ul混合后置65℃水浴10分钟，然后冰浴2分钟。2.向上述溶液中加入下列试剂：5×逆转录酶缓冲液      4ul(AMV RT 5×Reaction Buffer and Solutions Code No：M5 101，Promegacorporation USA)Rnasin                 0.25ul(Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega corporation USA)dNTPs(10mmol/L)        4.0ul逆转录酶               0.5ul(AMV-RT Code No：M5101，Promega corporation USA)DEPC-水至终体积为      20ul混合后37℃水浴1小时。3.将上述反应液移入68℃水浴10分钟(灭活逆转录酶)，-20℃保存。二.PCR反应1.第一轮PCR(模板为为“反应一”中获得的口蹄疫病毒的cDNA)引物1的序列为：5’GGCTGATTACGCGTACAC 3′(SEQ ID NO：6)引物1’的序列为：5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO：7)第一轮PCR合成的产物的序列是：5’CGCGTCCGACGTCGCCGAAACCACAAACGTGCAGGGATGGGTCTGCTTGTTCCAGATAACACACGGGAAAGCCGACGGCGATGCTCTGGTTGTGCTAGCTAGTGCTGGCAAAGACTTTGACCTACGCCTACCGGTTGACGCCCGCACGCAGACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAGCTGGCGGGAGACGTC3’(SEQ ID NO：8)2第二轮PCR(模板为第一轮PCR合成的产物)引物2的序列是：5’GAATTCACCACCTCTGCGGG 3’(SEQ ID NO：9)引物2’的序列是5’AAGCTTCAGAAGCTGTTTTGC 3’(SEQ ID NO：10)产物的序列是：5’GAATTCACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAAGCTT3′(SEQ ID NO：11)此序列代表的是两端加入酶切位点的“O”型口蹄疫病毒VP1基因序列。

PCR的反应条件为：94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。

实施例5.构建卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因片段

将卡介苗伴侣蛋白10的编码基因和口蹄疫病毒VP1基因的PCR产物分别与Ta载体连接(方法同实例2)，将连接产物(含卡介苗伴侣蛋白10和含“O”型口蹄疫病毒VP1基因)的重组Ta质粒分别转化大肠杆菌(转化方法同实例2)。

卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因的测序结果表明，所得到的卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因和设计的完全一致，具体序列参见SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。

用NcoI(Nco I Code No：D1160A，TaKaRa，下同)和EcoRI(EcoRICode No：D1040A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自实施例5的伴侣蛋白10连接物，用EcoRI和HindIII(HindIII Code No：D1060A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自实施例5的“O”型口蹄疫病毒VP1连接物，时间为2小时。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。20×TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/LNa₂EDTA，用冰醋酸调pH 8.3。

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带(分别含Chaperonin10和口蹄疫病毒VP1基因)。纯化回收DNA片段(方法同实施例2，电泳图见附图2；附图4)

实施例6卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合基因的构建

将回收的DNA片段分别克隆入经限制性内切酶NcoI和EcoRI；EcoRI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。

含卡介苗伴侣蛋白10质粒DNA的消化反应：质粒DNA                                        1μg10×缓冲液(10×K buffer Lot：A1018，TaKaRa)    1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)                   1μl限制性内切酶EcoRI(10单位/μl)                  1μl用双蒸水补齐至                                 10μl混合后37℃温育30-120分钟。

含“O”型口蹄疫病毒VP1质粒DNA的消化反应：

质粒DNA                                       1μg

10×缓冲液(10×M buffer Lot：A1032，TaKaRa)   1μl

限制性内切酶HindIII(10单位/μl)               1μl

限制性内切酶EcoRI(10单位/μl)                 1μl

用双蒸水补齐至                                10μl

混合后37℃温育30-120分钟。

连接反应：

质粒DNA(0.5μg/μl)                           2μl

DNA插入片段(300ng/μl)                        5μl

10×连接缓冲液

(T4Ligation Solution Lot：CA2901，TaKaRa)     1μl

T4 DNA连接酶

(T4 Ligation Code No：D2011A，TaKaRa)

                                              1μl

用双蒸水补齐至                                10μl

混合后置14-16℃水浴6-12小时。

将含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1融合基因的重组pET-28a(+)质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(BL21(DE3)Code No：Y016，北京鼎国生物，下同)。

鉴定：由北京鼎国生物技术发展中心对pET-28a(+)质粒上的含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因进行DNA的测序。测序结果无误。(具体序列参见SEQ ID No：16)。

用酶切的方法(HindIII、EcoRI)对pET-28a(+)质粒上的含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因进行鉴定，结果切除大小约650bp的片段，证实“O”型口蹄疫病毒VP1连接成功。(附图5)

实施例7卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1融合基因的表达

将单菌落的细菌接种于50ml LB培养基中，于250ml三角烧瓶中，37C水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPT6使其终浓度为1mM，37C水浴震荡培养2-3小时。三角烧瓶于冰上5分钟，4C离心5分钟(5000xg)。吸弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。

实施例8卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因融合蛋白的纯化样品的准备1.将细菌重悬于细胞裂解液中；细胞裂解液：20mM Tris，0.5M NaCl

        5mM imidazole 0.1mM PMSF调pH致7.92.加入10mM MgSO₄和20ug/ml Dnase I(DnaseI Code No：C082，Roche分装，北京鼎国生物，下同)于细胞裂解液中，在冰上孵育30min除去DNA；3.12000rpm离心15min收集沉淀物，然后用细胞裂解液离心洗一次；4.将沉淀物溶解在结合缓冲液中，冰上孵育1-2小时.结合缓冲液：20mM Tris，0.5 M Nacl

        5mMimidazole 6M urea调pH致7.95.12000rpm离心15min除去絮状物。柱的准备1.将柱(离子交换层析柱，Pharmacia下同)较准到理想的容量，用防水笔作好标记；2.用磷酸盐缓冲液装柱，然后封住出口；磷酸盐缓冲液：20mM phosphate，pH7.2 1M Nacl配制方法：溶液A Na2Hpo4.12H2O 35.8g  双馏水加到100ml

      溶液B NaH2po4.H2O 13.Sg    双馏水加到100ml

      溶液C将溶液B逐渐加到溶液A中，一直pH为7.2为止3.开始加入层析介质(Sepharose4B-Ni²⁺Pharmacia下同)；4.让柱开始流动并加入更多的介质，一直到介质水平达到标记的柱水平；5.打开出口，加磷酸盐缓冲液，弹击柱边使介质下沉，持续弹击一直到柱床高度恒定为止；6.加更多的介质，重复第1-6步，当弹击不在改变柱床的体积时，关闭柱的出口。7.加入磷酸盐缓冲液来充满柱，盖上柱的上盖，打开出口；8.让柱开始以最小100个柱床体积/小时流动，最短流动30分钟；9.如果柱中介质的容积需要调整，关闭柱的出口，打开柱的上盖，加入更多的介质，然后应该再以最大流速冲洗柱至少30分钟。用金属离子给介质充电在螯合介质能够被用于纯化过程以前，必须用所选择的金属离子为其充电。1.用至少5个柱床体积的双蒸水洗柱。2.将3-5个柱床体积的20mM金属离子溶液加到柱中。50mM镍离子溶液的配制：NiSO₄·6H₂O 13.1g，双馏水加到1000ml。3.用5个柱床体积的洗脱缓冲液洗柱。洗脱缓冲液：20mM Tris，pH7.9

        0.5M NaCl

        1M imidazole

        6M urea4.用10个柱床体积的结合缓冲液洗柱。  结合缓冲液：20mM Tris，pH7.9

          0.5M NaCl

          5mM imidazole

          6M urea吸附

1.将样品加到金属螯合的柱中，并以预先确定的最佳流速让其流过柱床；

2.用含16mM咪唑的结合缓冲液洗柱，一直到流出物的吸收值回到基线水平。洗脱

用洗脱液洗脱时，会出现一个峰值，继续洗脱直到吸收值不在下降为止，用容器接取不同时段的流出液，并进行SDS电泳(见附图3)，判定纯化效果，纯度可达50％以上。

咪唑洗脱液：20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl

            1M imidazole，6M urea。实施例8：C57小鼠的疫苗免疫一.材料

1.C57雌性小鼠(C57小鼠，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供下同)，6-8周龄

2.“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白(吉林大学基础医学院分子生物学教研室提供下同)

3.PBS    二.方法

1.将20只小鼠随机分两组，一组为伴侣蛋白10-VP1融合蛋白疫苗免疫组，一组为PBS免疫组，疫苗组：于0、14、28天，每只鼠在二下肢股四头肌处共注射“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗200ug(150ul)，1.3ug/ul；PBS组：用同样的方法等量注射PBS。

2.距第三次免疫后6天，小鼠眼球取血约1ml，4000g离心10秒后分离上清。实施例9：ELISA检测免疫后的C57小鼠抗体效价

一.材料

C57小鼠(雄性6-8周龄)、“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白、“HSP-VP1”融合蛋白、PBS、包被缓冲液1％BSA、羊抗鼠IgG-HRP(编号：H005北京鼎国生物，下同)、OPD-底物缓冲液(OPD-底物缓冲液CodeNo：P002，北京鼎国生物，下同)

二.方法

1.将纯化后的“HSP-VP1”融合蛋白(6.5ng/ml)。经预实验后，1：80用包被缓冲液稀释。

2.包被：加入96孔板，100ul/孔。4℃，过夜。

3.洗涤：洗液洗板3次，5分钟/次。

4.封闭：加1％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5小时。

5.洗涤：洗液洗板3次，5分钟/次。

6.加样：将PBS免疫及“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗免疫鼠(免疫方法同前)各10只的血清用样品稀释液做100、200、400、800、1600、3200及6400倍稀释，100ul/孔。设复孔。37℃，60分钟。

7.加酶标抗体：将羊抗鼠IgG-HRP(0.1ml，1∶1000)用洗液稀释500倍，100ul/孔。37℃，60分钟。

8.洗涤：洗液洗板三次，5分钟/次。

9.显色：新鲜配制OPD-底物缓冲液，100ul/孔。室温避光反应10分钟。

10.终止：加2mol/L H₂SO₄，50ul/孔

11.测A₄₉₀。实验结果及结论A₄₉₀OD值：空白对照：OD值：0.005±0.0005

正常对照组：稀释度(1∶80)OD值：0.213±0.003

免疫组：    稀释度(1∶100)OD值：3.564±0.012

            稀释度(1∶200)OD值：2.531±0.023

            稀释度(1∶400)OD值：1.971±0.011

            稀释度(1∶800)OD值：1.003±0.014

            稀释度(1∶1600)OD值：0.899±0.012

            稀释度(1∶3200)OD值：0.719±0.009

            稀释度(1∶6400)OD值：0.621±0.006

判断标准：用ELISA方法检测免疫血清抗体滴度时，当免疫组不同的稀释度时OD值高于对照组OD值的2倍时，判断为阳性。根据上述标准，当免疫组稀释度为1∶1600时，免疫组OD较对照组OD提高2倍以上，据此判断免疫组的有效抗体效价1∶1600。

实验结果表明：疫苗免疫组的抗体效价明显高于PBS免疫组。

          序列表<110>北京迪成华宇生物技术有限公司<120>预防动物口蹄疫病毒的感染的重组蛋白疫苗及其用途<130>I020107<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>639<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<220><221>CDS<222>(1)..(639)<223><400>1acc acc tct gcg ggc gag tcc gcg gac ccc gtt acc gcc acc gtt gag    48Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu1               5                   10                  15aat tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc cag cac acg gat atc    96Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile

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            245                 250                 255Ala Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala

        260                 265                 270Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr

    275                 280                 285Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys

290                 295                 300Gln Lys Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu305                 310                 315<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>5aaaggcccag ggttggactc                                           20<210>6<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>6ggctgattac gcgtacac                                             18<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>7aaaggcccag ggttggactc                                          20<210>8<211>861<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<400>8ggctgattac gcgtacaccg cgtccgacgt cgccgaaacc acaaacgtgc agggatgggt    60ctgcttgttc cagataacac acgggaaagc cgacggcgat gctctggttg tgctagctag    120tgctggcaaa gactttgacc tacgcctacc ggttgacgcc cgcacgcaga ccacctctgc    180gggcgagtcc gcggaccccg ttaccgccac cgttgagaat tacggtggtg agacacaggt    240ccagagacgc cagcacacgg atatctcgtt tatactagac agatttgtga aagtcacacc    300aaaagaccaa atcaatgtgc tggacctgat gcagatccct gcccacactt tagtaggggc    360cctcctgcgg acggccacct actacttctc cgacttggag ttggctgtca aacacgaggg    420tgatctcacc tgggttccga acggggcccc tgagacagct ttggacaaca ccaccaaccc    480aacagcttac cacaaagcac cactcacgcg actggccttg ccttacacgg ccccacaccg    540cgtcttagcg accgtctaca acggaagttg taagtacagt gacgcccgcg tgagcaacgt    600gaggggtgac cttcaagtgt tggctcagaa ggcaaaaaga gctctgccca cctcctttaa    660ctatggtgcc attaaggcaa cccgggtgac tgagttactc taccgaatga agagagccga    720gacatactgc cccaggcccc ttcttgccat tcaaccgagt gacgctagac acaagcagaa    780gatcgtggca cccgcaaaac agcttctgaa cttcgacctc ctcaagctgg cgggagacgt    840cgagtccaac cctgggcctt t                                              861<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>9gaattcacca cctctgcggg                                          20<210>10<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>10aagcttcaga agctgttttg c                                        21<210>11<211>651<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<400>11gaattcacca cctctgcggg cgagtccgcg gaccccgtta ccgccaccgt tgagaattac    60ggtggtgaga cacaggtcca gagacgccag cacacggata tctcgtttat actagacaga    120tttgtgaaag tcacaccaaa agaccaaatc aatgtgctgg acctgatgca gatccctgcc    180cacactttag taggggccct cctgcggacg gccacctact acttctccga cttggagttg    240gctgtcaaac acgagggtga tctcacctgg gttccgaacg gggcccctga gacagctttg    300gacaacacca ccaacccaac agcttaccac aaagcaccac tcacgcgact ggccttgcct    360tacacggccc cacaccgcgt cttagcgacc gtctacaacg gaagttgtaa gtacagtgac    420gcccgcgtga gcaacgtgag gggtgacctt caagtgttgg ctcagaaggc aaaaagagct    480ctgcccacct cctttaacta tggtgccatt aaggcaaccc gggtgactga gttactctac    540cgaatgaaga gagccgagac atactgcccc aggccccttc ttgccattca accgagtgac    600gctagacaca agcagaagat cgtggcaccc gcaaaacagc ttctgaagct t             651<210>12<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>12ccatggcgaa ggtgaacatc aa                                       22<210>13<211>28<212>DNA<213>Artificial<400>13ctagaattcc ttggaaacga cggccagc                                 28<210>14<211>309<212>DNA<213>Bacille calmette-Guerin<220><221>CDS<222>(1)..(309)<223><400>14atg gcg aag gtg aac atc aag cca ctc gag gac aag atc ctc gtg cag    48Met Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Glu Asp Lys Ile Leu Val Gln1               5                   10                  15gcc aac gag gcc gag acc acg acc gcg tcc ggt ctg gtc att cct gac    96Ala Asn Glu Ala Glu Thr Thr Thr Ala Ser Gly Leu Val Ile Pro Asp

        20                  25                  30acc gcc aag gag aag ccg cag gag ggc acc gtc gtt gcc gtc ggc cct    144Thr Ala Lys Glu Lys Pro Gln Glu Gly Thr Val Val Ala Val Gly Pro

    35                  40                  45ggc cgg tgg gac gag gac ggc gag aag cgg atc ccg ctg gac gtt gcg    192Gly Arg Trp Asp Glu Asp Gly Glu Lys Arg Ile Pro Leu Asp Val Ala

50                  55                  60gag ggt gac acc gtc atc tac agc aag tac ggc ggc acc gag atc aag    240Glu Gly Asp Thr Val Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Gly Thr Glu Ile Lys65                  70                  75                  80tac aac ggc gag gaa tac ctg atc ctg tcg gca cgc gac gtg ctg gcc    288Tyr Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ile Leu Ser Ala Arg Asp Val Leu Ala

            85                  90                  95gtc gtt tcc aag gaa ttc tag                                        309Val Val Ser Lys Glu Phe

        100<210>15<211>102<212>PRT<213>Bacille caalmette-Guerin<400>15Met Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Glu Asp Lys Ile Leu Val Gln1               5                   10                  15Ala Asn Glu Ala Glu Thr Thr Thr Ala Ser Gly Leu Val Ile Pro Asp

        20                  25                  30Thr Ala Lys Glu Lys Pro Gln Glu Gly Thr Val Val Ala Val Gly Pro

    35                  40                  45Gly Arg Trp Asp Glu Asp Gly Glu Lys Arg Ile Pro Leu Asp Val Ala

50                  55                  60Glu Gly Asp Thr Val Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Gly Thr Glu Ile Lys65                  70                  75                  80Tyr Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ile Leu Ser Ala Arg Asp Val Leu Ala

            85                  90                  95Val Val Ser Lys Glu Phe

        100<210>16<211>951<212>DNA<213>Artificial<400>16atggcgaagg tgaacatcaa gccactcgag gacaagatcc tcgtgcaggc caacgaggcc    60gagaccacga ccgcgtccgg tctggtcatt cctgacaccg ccaaggagaa gccgcaggag    120ggcaccgtcg ttgccgtcgg ccctggccgg tgggacgagg acggcgagaa gcggatcccg    180ctggacgttg cggagggtga caccgtcatc tacagcaagt acggcggcac cgagatcaag    240tacaacggcg aggaatacct gatcctgtcg gcacgcgacg tgctggccgt cgtttccaag    300gaattcacca cctctgcggg cgagtccgcg gaccccgtta ccgccaccgt tgagaattac    360ggtggtgaga cacaggtcca gagacgccag cacacggata tctcgtttat actagacaga    420tttgtgaaag tcacaccaaa agaccaaatc aatgtgctgg acctgatgca gatccctgcc    480cacactttag taggggccct cctgcggacg gccacctact acttctccga cttggagttg    540gctgtcaaac acgagggtga tctcacctgg gttccgaacg gggcccctga gacagctttg    600gacaacacca ccaacccaac agcttaccac aaagcaccac tcacgcgact ggccttgcct    660tacacggccc cacaccgcgt cttagcgacc gtctacaacg gaggttgtaa  gtacagtgac   720gcccgcgtga gcaacgtgag gggtgacctt caagtgttgg ctcagaaggc aaaaagagct    780ctgcccacct cctttaacta tggtgccatt aaggcaaccc gggtgactga gttactctac    840cgaatgaaga gagccgagac atactgcccc aggccccttc ttgccattca accgagtgac    900gctagacaca agcagaagat cgtggcaccc gcaaaacagc ttctgaagct t             951