用于时间分辨荧光的成像荧光计

摘要

本发明涉及一种用于对生化和医学样品中的时间分辨荧光进行成像的装置和方法。按照一主要方面，该装置包括一大孔径透镜，一处于照明光路中的闪光灯，一快速动作的固态快门或者一处于发射光路中的选通的探测器，一用于将均匀单色光照输送到分布于带微池平板中的多个小池的装置，一高量子效率数字摄像机，和一计算机。在计算机的控制下，灯以很短的间隔发射脉冲。该快速动作的发射快门或者选通的探测器用于将摄像机的曝光限制于每个灯脉冲消失之后若干微妙的时间，在这个期间仅延迟的荧光被传输到该摄像机。本发明同时实现了多个样品的时间分辨的成像，具有高灵敏度和高处理量。

说明书

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求基于2001年2月28日提出的美国临时申请序列No.60/272,083的优先权，该申请的全部内容在此引作参考。

发明领域

本发明涉及对生化和医学样品中的时间分辨荧光进行成像的装置和方法。

发明背景

当一荧光团与入射光子相互作用时(激励)发出荧光。光子的吸收导致荧光团中的电子从其基态跃迁到更高能级。在荧光团和其环境所决定的一段时间之后，电子返回其初始能级，释放一个光子(荧光发射)，该光子的波长取决于返还过程中所释放的能量大小。当电子从各个轨道下落到其基态时，荧光团可能以单波长或者多波长发射(产生一发射光谱)。对于每种荧光团，发射光谱不变。

荧光标记通常是小有机燃料分子，如荧光素，得克萨斯红(TexasRed)或若丹明，它们易于与探测分子如链霉亲和素相结合。可以通过用适当激发频率的光照射来探测荧光团，并且可以通过电光探测器或通过眼睛检测所产生的光谱发射。

对荧光材料进行分析的方法在本领域中是众所周知的，并且例如在纽约：Plenum出版社(1983年)出版的Lakowicz，J.R.的荧光光谱学原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy)；圣地亚哥：Academic出版社(1989)出版的Taylor，D.L.和Wang，Y.L.编辑的培育中活体细胞的荧光显微技术(Fluorescence Microscopy of LivingCells in Culture)，B部，细胞生物学中的方法(Methods in CellBiology)，Vol.30中的Herman，B.的谐振能量转移显微技术(Resonance Energy Transfer Microscopy)，p.219-243；Menlo Park：Benjamin/Cummings Publishing有限公司(1978)出版的Turro，N.J.，现代分子光化学(Modern Molecular Photochemistry)，P.296-361和美国：分子探测器目录(Molecular Probes Catalog)(2001)中描述了荧光材料分析方法。

荧光计是测量荧光的仪器。荧光计具有三个主要元件：(a)用于激励的光源，最典型的为激光器或宽带光源；(b)滤波器和/或色散单色仪，用于在激励和发射过程中选择感兴趣的波长区域；(c)探测器，将碰撞荧光发射转换成电信号。本发明涉及测量生物样品，尤其是药品发现活动中所使用的生物样品中的荧光。

有些荧光计(微荧光计)根据共焦或非共焦显微镜的原理构成，且被设计成将荧光标记的细胞或样品的微量视作分离目标。大量在先技术涉及到这种微荧光计。该在先技术群的一个子集涉及将微荧光计与带微池(microwell)的平板或薄片一起使用(例如，Galbraith等人，1991；Rigler，1995)。

其它荧光计(宏荧光计)不进行细胞分辨率测量，而是使用低放大倍数光学装置收集多个样品中每个样品发出的信号(如Bjornson等人的美国专利No.5,125,748；Eden等人的5,340,747)，最典型的是在微池平板中设置小池(如Modlin等人的美国专利No.6,071,748；Akong等人的5,670,113)。

在“扫描荧光计”、“步进荧光计”与“区域成像荧光计”之间，对多个样品进行测量的方法不同。

在扫描宏荧光计(如Kain的美国专利No.5,672,880中所披露的)中，通过在样品上扫描激励光束，并逐点收集各个发射，顺序对多个样品进行检测。扫描荧光计能将每个样品分成多个分辨点。

在步进宏荧光计中，激励光束和探测器(通常为光电倍增管或二极管)以步进方式从一个样品移动到另一个样品。探测器(或探测器阵列)对各个样品进行整体测量，不对每个样品中的多个分辨点进行辨别(如，例如Harootunian的美国专利No.5,589,351；Akong等人的5,670,113；Tuunanen等人的6,144,455；Akong等人的6,127,133)。

在区域成像宏荧光计中，探测器同时面对多个样品(不进行扫描或步进)，且在探测器区域的不同部分检测各个样品。通过将不同样品定位于探测器上不同的点处，区域成像荧光计具有对多个样品中分离样品进行辨别的能力。区域成像宏荧光计可以辨别或者不辨别每个样品中的多个分辨点。

区域成像宏荧光计是众所周知的(例如，Haggart 1994；Che的美国专利No.6,140,653；Kawano等人的6,069,734；许多商业系统)。大多数区域成像宏荧光计适用于平坦的样品，如电泳凝胶。某些(例如Reintjes等人的美国专利No.5,275,168；Knuttel的5,309,912)需要更为特殊的方法，如拉曼光谱学或光照的相位/振幅调制，并且不适用于众多生物样品中所使用的瞬时或时间分辨的荧光强度测量。另外(Stabile等人的5,854,684)提到用于检测多个样品所反射的光量的成像检测器的一般应用，没有描述能够在宏荧光计中有效使用成像检测器的照明和光检测系统中的特定实施例。最后，另外的文献(McNeil等人的WO96/05488)披露了实现区域成像宏荧光计的具体方法，该方法对实际应用来说不是最佳的。

在药品发现应用中需要样品的高处理量，其中一般将荧光样品设置于多个小池内，并且要求高处理量。区域成像荧光计呈现出的已知优点在于同时对大量样品进行量化，从而实现高处理量的能力，如果要使该仪器同时具有高处理量和高灵敏度，则需要适合于这个目的的特殊实施例。

显然，从区域成像宏荧光计的技术来看，设置一CCD摄像机以便对样品进行成像，用已知的方法输送荧光激励，并且用已知的方式使用透镜收集所发射的光。不过，McNeil等人(WO96/05488)披露的这种成像荧光计不能获得与非成像荧光计相当的灵敏度，并且存在信号检测错误的缺点。例如，它们使用不包含机械装置的标准透镜系统，如此设计以便使反射和其它形式的寄生信号最小，具有视差，通常要求带微池的平板具有一透明底面，通过该透明底面观看样品。相反，非成像荧光计非常灵敏，没有视差，并且能从平板的顶部或底部观看，不需要昂贵的透明底面平板。由于上面所详细说明的原因，药品筛选中区域成像荧光计的潜在用户没有广泛采用任何在先技术系统。

对区域成像荧光计应用于药品筛选提出的挑战，总的来说，来自于四个方面：

a)这些小池(well)形成了与光照明的入射角相互影响的孔径。接收更大角度光照明的小池不如接收更多正面光照明的小池那样被很好地照射。由于大多数区域成像荧光计从会聚透镜旁边输送光照明(例如，Neri等人，1996)，故它们对于平坦样品是成功的，不过不能适当地照明较深的小池。实际上，常常发现输送到带微池的平板中不同位置处小池的光存在超过300％的变化，除非仅通过带微池平板的底面产生光照明输送(如Schroeder的美国专利No.5,355,215和McNeil等人的WO96/05488)。

b)这些小池非常暗淡。标准的带微池平板中所包含的大量小池占据了大约96平方厘米的空间大小。如果宏区域成像荧光计能同时对所有小池进行成像，则必须同时照明所有小池。因而，输送到任何一个小池的光照量(如同被照射面积与强度/单位面积之间的几何关系的倒数所描述的)非常低，而由任何一个小池发出的荧光量也倾向于较小，且需要灵敏的探测器。不管探测器是多么灵敏，重要的是所有小池都尽可能有效地接收照射光束。如果光照没有达到某些小池的内容物，即使最灵敏的探测器也不能抽提取有用的信号。

c)存在视差。由标准透镜以不同角度对带微池的平板内不同位置处的深池进行成像。这种众所周知的视差主要影响光学装置的精度，尤其是当光学装置从顶部对多个小池进行成像时。

d)照明光线与探测光学装置相互影响。用于将光照输送到整个小池平板上的光学装置，和用于同时收集平板中多个小池的荧光发射的光学装置，必须具有特殊的性质。例如，最有效的照明方法是从聚光透镜里面照射(外照射)，不过宏外照射透镜会受到反射和其它不明显的寄生信号源的影响。

Ramm等人在美国专利申请09/240,649和09/477,444中披露了在小池平板、凝胶和污渍中进行测定的数字成像系统。这种系统满足高处理量区域成像荧光计的需要，并且实现了技术进步，因为它克服了上面点a-d中所提出的问题。更具体地说，所披露的系统：

a)最小限度地与小池孔径相互影响，以便以有效和均匀的方式从上面或下面照射多个小池；

b)通过用有效的方式进行照射，使区域成像荧光计更加灵敏；

c)使用远心光学装置，避免视差；

d)包含用于使宏区域成像荧光计中产生的背景信号源最少的光学装置和元件(例如，使安装在聚光透镜中的发射滤波器的内反射最小)。

所披露的系统已经被付诸实践，并且广泛地用于发光和瞬时荧光信号的区域成像。在所引用的专利申请中披露了使用该系统进行时间分辨荧光成像的方法，不过没有详细描述用于该目的的实施例。本发明披露了用于在小池平板、凝胶和污渍中进行时间分辨测定的区域成像荧光计的最佳实施例。

通过收集所发射荧光的同时输送激励光照定义瞬时荧光发射。瞬时荧光中的问题包括：

●必须检测发射中非常小的改变，同时该系统充满激励光；

●与激励相比，发射的强度非常低，难以滤除所有激励而剩下纯净的发射；

●样品介质(例如溶剂，包含被标记化合物的细胞)，光学装置(例如Beverloo等人的装置，1990，1992)和样品载体(小池平板，小池)可能发射与感兴趣的荧光相似的光谱成分。

总的来说，将到达探测器的任何激励光或样品介质的贡献称为“背景”。发射滤波器被放置在样品与探测器之间，以便阻挡尽可能多的背景信号到达探测器(如Ramm等人的国际专利申请公开W099/08233中所披露的)。不过，发射滤波器不能去除所有的背景，且使背景泄漏到探测器上，导致探测灵敏度降低。即，荧光计的灵敏度倾向于受到大背景信号的限制。

时间分辨的荧光(TRF)是一种众所周知的用于减小背景并提高探测灵敏度的技术(例如，Hemilla等人的美国专利N0.4,565,790，Mikola等人的4,808,541，Zarling等人的5,736,410)。在TRF中，使用光源激发样品，然后迅速地熄灭或遮断光源。在激励过程中，关闭探测器。处于关闭状态时，它不受激励期间所产生的背景成分的影响(例如激励光通过发射滤波器的泄漏)。

在激励终止之后，大多数背景成分都消失或迅速地衰减(例如溶剂荧光)。相反，荧光团并不立即停止其发射。相反，存在一个在激励终止之后荧光团继续发射的周期(从皮秒到毫秒)。在这期间，打开探测器，观察具有最小背景的相关荧光信号。探测周期的这种延迟计时是TRF的主要原理。

为了能够进行TRF探测，在控制时间周期内必须打开和关闭探测器。在激励终止之后某个时间，开始探测周期(在一段延迟时间之后)，并持续一段时间(探测时间)。通常将TRF用于镧系(Eu，Tb等)荧光团，其延迟时间为100微秒到2毫秒的量级，比典型的背景源延迟时间长得多。一般，该延迟时间为数十微秒量级，且探测时间为数十到数百微秒。

在激励期间和延迟时间，遮断或关闭探测器(下面称之为断开)。在探测期间，探测器暴露于来自样品的发射(下面，称之为选通)。不可能任何一个断开和选通周期都将在探测器上产生可靠的信号，从而要重复该周期，直到积累了足够的信号。

与瞬时荧光发射相比，被延迟的荧光发射要弱得多，而且区域成像系统必须以非常低的发射量/单位面积来工作。因而，与另外类型的荧光计相比，区域成像荧光计更易于遭受探测器的噪声基底(noisefloor)中失去延迟发射的影响。因此，需要TRF系统具有可产生高光学处理量〔广延性(etendue)〕和低传输损耗的几何结构。在优化系统以便实现这种快速选通和高广延性的组合时产生了困难。

必须对激励光和探测器两者进行选通。使用机械斩波器和/或使用脉冲激光器(例如，Gadella和Jovin，1995)对激励进行选通是众所周知的，如同使用衰减足够快、使它们对延迟探测的影响最小的闪光灯(如Ramm等的WO99/08233；Vaisala等的EP0987540A2；Vereb等，1998中所披露的)。

有三种通常所使用的在TRF中对发射路径进行选通的方法：

(a)快速旋转光闸轮，以产生发射光的微秒级选通。已经将这种方法应用于TRF显微镜(Seveus等人，1992)中，以除去瞬时发射的荧光信号，从而减小自发荧光。在Vaisala等人的EP0626575A1中披露了一种类似的方法，并且用于扫描探测系统(Harju等人的美国专利No.5,780,857)。在一次探测一个样品的显微镜或系统中，由于广延性非常小，所以一个快门就行了。相反，宏成像系统的广延性很大，其幅值比显微镜大大约两个量级。宏成像系统将需要较大的机械快门机构，从打开到关闭逐渐变化。

(b)多元件的机械快门，使用快速旋转的光闸轮，具有一次暴露探测器一小部分的同步开口。该装置(如Vaisala等人的EP0987540A2中所描述的)比单个轮快，不过比较复杂，由快速运动部件组成，且具有较差的广延性。

(c)电选通探测器，并且还将发射光子转变成电子。在这种方法中，在光路中设置一光电阴极。可以以很短的间隔打开和关闭该光电阴极，以适应TRF的定时要求。不过，这类装置具有低量子效率，不能用于将暗淡的荧光发射成像在成像探测器上。因而，施加一加速电场，以便在靶子之前增大光电子的能量，在许多情形中，被加速的电子通过微通道板引导，而在微通道板处它们引起更多的加速电子的发射。因此，电选通的探测器一般采用一光放大器，在靶子之前放大电子束。

已经披露了使用电选通探测器，并且具有光电阴极和微通道板放大的宏TRF成像系统(Ramm等人的WO99/08233；Ramm，1999)。在透镜与探测器之间使用放大光电阴极，具有一些固有的缺点：

(a)最典型的是在长波长下发射TRF。这对于荧光谐振能量转移(FRET)中的施主—受主对尤其正确，它倾向于发射光谱的红光部分。为了探测这种类型的信号，光电阴极的带隙需要足够低，以便使长波长光子能够产生光电子。不过，低带隙材料易于产生热信号，产生不能区别于被检测信号的仪器背景。适当地冷却光电阴极(如在市售的装置中已经付诸实施)并不能消除热背景。将光电阴极深度冷却到足够低的温度，以便极大地减小热背景，存在明显的技术困难，不常被使用。

(b)增强型系统的摄像机元件产生噪声，尤其是热背景。为了克服这个问题，可以冷却CCD，以减小热背景(如在若干工业装置中付诸实施)。在对从增强器吸收热载荷的光纤耦合CCD进行冷却，并且保持热光纤耦合与冷CCD之间的连接时存在困难。

(c)选通/放大元件的QE较低，一般在蓝绿波长中为10％的量级，在红光中低到1％。因而，入射到放大选通系统的大部分信号光被损失掉，且将该系统用于时间分辨的荧光发射是有问题的。

(d)放大过程并不产生每入射光电子恒定数量的电子。通常通过设置探测活动的最小阈值来克服这种增益噪声，且只考虑有效的具有高度可能性的活动。通过这种方法，放大装置起计数器的作用，而不是起积分成像器的作用。虽然这种考虑方法非常灵敏，不过放大装置效率非常低，并且需要较长探测周期来积累足够的超过阈值的活动，以便产生图像。

还有其它缺点，包括光放大器的易损坏性(它易于被亮光毁坏)和被放大图像中的弱调制传输。另外，样品的明亮区域势必会影响其周围的区域，从而微池平板的成像极易遭受小池之间的串扰。总之，在本发明领域中，使用光电阴极选通和放大的在先技术系统，均表现出缺陷。

有可能构成一种用于TRF的宏区域成像荧光计，其中选通和放大功能是该探测器所固有的。例如，已经确定在Ramm等人(WO99/08233)所披露的结构系统中可以实现电子轰击CCD(EBCCD)。可以想到，其它整体放大探测器，如电子放大的CCD(如由英国马可尼应用技术付诸实施)也将适用于所披露结构的系统中。与增强型CCD摄像机相比，EBCCD(和其它可能的整体选通探测器)的优点在于它表现出非常小的成像微池平板中的串扰，同时保持足够的灵敏性，以便探测微弱的延迟荧光信号。

可以想到将任何类型的快门作为TRF系统的选通器。已经披露了使用安装在光路中样品后面探测器之前的液晶、叶片或其它快门的具有宏外照明系统的TRF(WO99/08233，Ramm等)。在一个最佳实施例中，本发明采用了这样一种快门，设置于系统中，对该系统进行优化以便允许使用这种快门。

虽然没有特别描述应用本发明的自动过程，不过可以想到可以将本发明应用在利用用于识别调制器、路径、具有有用活性的化学制品的自动化和集成工作站的系统和方法，以及此处所披露的其它方法。在下列文件〔参见Kramer等人的美国专利No.4,000,976(公开于1977年1月4日)，Pfost等人的美国专利No.5,104,621(公开于1992年4月14日)，Bjornson等人的美国专利No.5,125,748(公开于1992年1月30日)，Kowalski的美国专利No.5,139,744(公开于1992年8月18日)，Bjornson等人的美国专利No.5,206,568(公开于1993年4月27日)，Mazza等人的美国专利No.5,350,564(1994年9月27日)，Harootunian的美国专利No.5,589,351(公开于1996年12月31日)和Baxter Deutschland GMBH的PCT申请No.93/20612(公开于1993年10月14日)，McNeil等人的WO96/05488(公开于1996年2月22日)和Agong等人的WO93/13423(公开于1993年7月8日)〕中概括地描述了这些系统。

根据本发明，一种用于小池平板、凝胶和污渍中样品的时间分辨的荧光测定术的区域成像系统，采用设置于大广延性选通照射系统中，与高灵敏摄像机(最好是如Ramm等在WO99/08233中所披露的)耦合的快速动作电子发射快门。最好，但不是必须，该系统的发射快门是基于铁电晶体(FLC)技术。FLC快门是一种基于铁电性的装置，由一输入偏振片、一根据电场改变偏振的旋转的铁电材料，和一插在阵列成像系统发射路径之中样品与固态阵列探测器之间的偏振分析器组成。

本发明的系统的特征在于包含FLC快门的光/探测元件是如此灵敏，以至于可调节通过电子快门的传输损耗而无需光放大阶段。在一个最佳结构中，探测器的量子效率很高，且光学装置的广延性很大。当用于该系统中时，本发明的快门能够透过足够的延迟荧光，以产生类似于从非成像时间分辨的荧光计所得到的测量结果，并且大于使用放大光电阴极的系统的灵敏度，而没有这种系统的缺点(串扰，易损坏性等)。

本领域的技术熟练人员将理解到，可将快速电子快门用作用于TRF的选通机构。不过，大多数快门如克耳盒、声光调制器或电光调制器，具有有限的广延性，将其应用限制为具有小广延性的系统，如显微镜。本发明的电子快门的优点在于它具有极大的孔径，利用本发明系统的广延性。

本发明的系统可以配备一基于液晶的快门。虽然这类快门可以具有足够大的孔径以利用本发明的大广延性，但其透射状态与阻断状态的比值(被定义为对比度)较低。具体来说，与用FLC快门观察的＞400∶1相比，液晶快门的对比度为＜200∶1的量级。对于许多通常使用的萤石进行TRF成像而言，基于液晶的快门不够快。

最好是，本发明的系统采用基于铁电晶体(FLC)的快门。本发明系统的优点在于FLC快门可以在100微秒内从选通转变到关断，且适用于通常所使用的镧系，铕和铽萤石的延迟荧光成像。

如前面所披露的，在TRF显微镜中尝试使用FLC快门，FLC的缺点是由于对比度不够，而对瞬时荧光的阻挡很差(Verwoerd等人，1994；Shotten，1995)。这种很差的对比度使得被迫使用两个串联FLC快门，导致传输损耗如此之高(Vereb等人，1998)，使得不可能用于宏成像荧光计中。在本发明中，将FLC设置于光学装置中可产生最佳可能的对比度的位置。本发明的系统的特征在于构成光学装置，将快门设置于发射荧光的光路中，使相对快门法线的入射角不大于20°。这种定位由快门得到了最佳可能的对比度，并且使所述快门受到的传输光波长特性的影响最小。

在本发明的一个最佳实施例中，通过首先拍摄快门关闭时瞬时荧光的图像(泄漏图像)，而校正通过FLC快门的泄漏。在获得延迟的荧光图像之前，从CCD摄像机读出该图像。然后，从延迟的荧光图像中减去该泄漏图像，剩下没有附加有通过FLC快门泄漏的延迟荧光的图像。

本发明的照明系统和电子快门的优点在于适用于现有的宏区域成像荧光计，无需对所述装置进行较大的改变(例如如Ramm等人在WO99/08233中所公开的)。相反，本发明的照明系统可以安装在现有的宏区域成像荧光计内，而且快门也可以安装在所述装置内，无需较大的改变。

本发明的优点在于易于从宏区域成像荧光计中插入或取出快门，使所述荧光计能用于非常广泛的应用中，而不会受到所述快门的防碍。

本发明系统的优点在于可以用在利用用于识别调制器、路径，具有有用活性的化学物品的自动化和集成工作站的系统和方法，以及此处所描述的其它方法。在下列文件〔参见Kramer等人的美国专利No.4,000,976(公开于1977年1月4日)，Pfost等人的美国专利No.5,104,621(公开于1992年4月14日)，Bjornson等人的美国专利No.5,125,748(公开于1992年1月30日)，Kowalski的美国专利No.5,139,744(公开于1992年8月18日)，Bjornson等人的美国专利No.5,206,568(公开于1993年4月27日)，Mazza等人的美国专利No.5,350,564(1994年9月27日)，Harootunian的美国专利No.5,589,351(公开于1996年12月31日)和Baxter DeutschlandGMBH的PCT申请No.93/20612(公开于1993年10月14日)，McNeil等人的WO96/05488(公开于1996年2月22日)和Akong等人的WO93/13423(公开于1993年7月8日)〕中，概括地描述了这些系统。

虽然本发明的目的在于时间分辨的宏荧光区域成像，然而本领域技术人员应该理解，可以使用本发明的偏振特性，如用采用偏振光学装置的FLC快门或其它快门构成偏振宏荧光区域成像系统。在这种系统中，通过首先通过FLC快门或其它偏振装置，使激励光偏振。发射光则通过一安装在发射光路中的偏振片。可以使任一个偏振片相对另一个旋转，该系统具有如此高的灵敏度，使得它实现了类似于非区域成像装置的偏振测量。

附图简述

从下面参照附图的目前最佳实施例，不用说是根据本发明的示例性实施例的描述，将更加完全地理解本发明的上述和其它目的，特征和优点，其中：

图1为根据本发明用于荧光成像的光学系统的最佳实施例的剖面示意图；

图2为用外延照明系统代替环形照射装置时图1所示光学系统的剖面图；

图3为与图2相似的剖面图，表示增加一快速快门；

图4为光线图，说明光学系统中快门和滤波器的操作；

图5说明将根据本发明的系统的性能与非成像时间分辨荧光计进行比较的曲线；以及

图6说明将目前系统中采用的电子轰击CCD摄像机性能与非成像时间分辨荧光计进行比较的曲线。

最佳实施例的详细描述

图1表示用于对带微池的平板3中所包含的多个小池2进行荧光成像的光学系统1的横截面。光学系统1的主要元件为透镜系统4，脉冲光源5，初始激励滤波器6，环形照明装置7，初始发射滤波器8(去除与所需样品信号无关的波长)和CCD摄像机系统9。光学系统1的透镜系统4包括在远心空间中工作的前元件4a，和在CCD摄像机9的CCD探测器10上形成小池平板3的图像。

在操作过程中，光源5提供施加给小池2中样品的必须的光能。最好，可以在小于100微秒的时间内将光源从高亮度调节到小于该高亮度的1％。光源发出的光通过滤波器6，并经过诸如光纤束或液体光导的光导引导到环形照明装置7，进入透镜系统内，该环形照明装置进行外围照明，最好照射一大于25平方厘米的区域。通过外围照明激发的样品所发射的光能通过透镜4a和整个透镜系统4，到达摄像机9，且在CCD探测器10上形成图像。

图2与图1相同，用外延照明系统代替环形照明装置。该外延照明由脉冲光源11、初始激励滤波器12和二向色反射镜13组成，由二向色反射镜13将激励波长反射到样品上，并朝向摄像机透射样品所发射的波长。

图3与图2相同，增加一快速快门14。快门14紧靠发射滤波器8，处于所有光线均接近光轴的位置。最好，快门14由可以使之不透明(关)或透明(开)的材料制成，开关周期短于100微秒，且对比度超过200∶1。最好该快门在500至700纳米的光波长之间的透射率大于20％。在一个最佳实施例中，快门14为FLC装置，不过在发射光路中应用快速动作的电子快门的原则是概括性的，快门14可以是任何其它快速动作的电子快门。例如，快门14可以由根据电场改变偏振的旋转的铁电材料组成的输入偏振器，和设置于样品3与CCD摄像机9之间的检偏器(a polarizing analyzer)组成。

图4表示出起源于平板一个角落处一个的光线A1-A3，如何通过快门14和发射滤波器8。还表示出分别发自平板中心和相对角落处的光线B1-B3和光线C1-C3。快门14和滤波器8处于通过透镜4进行成像时，所预测的关于平板3的无限共轭位置处。快门14和滤波器8还设置成：a)发射光线(如由线A1’-A3’，B1’-B3’和C1’-C3’所示)通过滤波器8的光轴的角度均接近于滤波器8的表面的法线，并以滤波器8的法线为中心，以及b)从平板3到滤波器8上光线的分布是均匀的。在所示结构中，当滤波器是干涉类型时，本发明的系统能够使发射滤波器8的动作所导致的光谱偏移最小。本实施例的特征在于，发射滤波器14处于透镜4的无限共轭位置，该光束也相对法线以小角度入射在快门14上，优点在于：a)快门14的对比度最大；b)对于给定的最大入射角，发射滤波器8和快门14的尺寸最小；和c)不可避免的快门14点缺陷的影响将在探测器上均匀分布，不在探测器10上所产生的图像中产生亮斑或暗斑。

图5表示本发明的系统的性能，与配备有最适宜的用于时间分辨荧光的元件的非成像时间分辨荧光计〔在这种情形中，以Wallac Victor2(Perkin Elmer Life Sciences)为例〕进行比较。用信噪比定义的铕的检测极限为3∶1，这对于两种仪器是相似的。如果说存在差别的话，本发明提供接近检测极限的更高的性能。

图6表示电子轰击的CCD摄像机(Hamamatsu)的性能，在本发明中所采用的系统中实现。在这种情形中，在电子轰击CCD探测器中实现的选通与使用安装在透镜4中的快速电子快门4不同。在这种结构中，性能为增益等于非成像荧光计的增益。图6说明可以通过多种形式的电子选通来实现本发明的系统，或者是通过发射路径中的快门，或者是设置于探测装置中的选通机构。

从图5和6将理解到，本发明使之可能在时间分辨成像荧光计系统中实现至少与最好的非成像荧光计同样好的性能。

虽然为了说明的目的已经披露了本发明的最佳实施例，然而本领域技术人员将理解到，在不偏离所附权利要求所限定的本发明的范围和精神的条件下，可能进行多种另外的变型和替代。

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