哺乳动物配子和胚胎培养基添加剂及其使用方法

摘要

本发明提供了一种对培养哺乳动物配子和胚胎组织有用的添加剂和培养基。该培养基包括至少一种重组人白蛋白、发酵透明质酸糖胺多糖和柠檬酸盐。由于所述培养基成分通过非常规途径生产，所以培养基中不含病毒、朊病毒和内毒素等污染成分。此外，由于培养基完全明确，避免了成分变动，从而使得哺乳动物细胞发育不受影响并且使得实验研究可进行有意义的对比。

说明书

发明领域

本发明涉及一种可提供细胞培养有效环境的培养基。更明确地说，本发明涉及精制培养基添加剂，其含有从非常规途径制得的成分，当加入培养基中可避免现有培养基的问题。

发明背景

多年以来，哺乳动物胚胎细胞培养基添加剂一直从动物体液、特别是从血清取得。尽管血清型培养基添加剂对培养特定类型的细胞和组织有一定功效，但是也有不足之处。血清型培养基添加剂对细胞培养来说不理想，主要原因之一是此培养基可能受到动物体液中杂质、毒素、感染源的污染。另外，由于采血动物不同，生活环境各异，所以获得的体液成分和浓度都不一样。人们已经认识到，血清型培养基一个重要方面是培养基中要求有高分子物质的存在。在一项模拟血清型产品实验中，研究者试图加入合成高分子物质如聚乙烯醇来替代血清中的高分子物质，如白蛋白。然而，由于血清是大量不确定的化学物质，从培养基中去除血清并试图只用大分子替代来生产培养基，其效果并不理想或由于多种原因根本无效，因为培养基缺乏必要的成分。

因此，需要和基于血液制品的培养基添加剂一样有效的培养基添加剂，同时消除潜在的污染源。此外，还需要标准培养基。

发明概述

本发明描述了一种新的基于生理的成分完全明确的哺乳动物胚胎细胞和配子培养基添加剂。这种培养基添加剂可用于体外受精培养基、胚胎移植培养基和用于哺乳动物移植前胚胎冷藏培养基，同时也可用作胚胎干细胞培养基添加剂或用于本领域已知其他相似培养基。本发明添加剂含有重组人白蛋白(rHA)、发酵透明质酸糖胺多糖和/或柠檬酸盐及其组合物。在培养基中加入这种添加剂可产生与加入从血液纯化的血清白蛋白同样的培养效果。发明详述

这种添加剂用于培养基时，可包含任何合适浓度的重组人白蛋白(rHA)。如本文详述，使用rHA比使用天然存在人血清白蛋白(HAS)有很多优点。

典型地，当添加剂含有rHA，添加剂可按培养基总体积按比例加入，含量在约0.1mg/ml到20.0mg/ml之间。在一个实施方案中，按培养基总体积加入约0.5mg/ml到5.0mg/ml的rHA。

加入发酵透明质酸糖胺多糖(HYN)可增强添加剂的作用。在培养基添加剂中加入发酵HYN经证明有效。

本文所用的短语“增加配子或胚胎细胞生存力”是指包括促进培养胚胎发育到胚泡阶段、体外提高透明带孵化能力、和/或比较于在同样的培养基中不含有本发明添加剂，用含有本发明添加剂进行胚胎培养时，胚胎在胚胎培养基中的整体生存力提高。

并且，在适当的培养基中加入发酵HYN可显著提高胚泡的冷藏存活率。使用发酵HYN相比较于使用天然存在的温血脊椎动物来源的HYN(如纯化自鸡冠或脐带)有若干优点。使用发酵HYN相比较于使用天然存在的温血脊椎动物来源的HYN，控制不同来源以及批次的HYN的安全性和稳定性的能力显著提高。

如果含有发酵HYN时，则发酵HYN含量按培养基总体积计通常为0.1mg/ml到5.0mg/ml浓度。在一个实施方案中，加入了按培养基总体积计算约0.125mg/ml到约1.0mg/ml的发酵HYN。

加入柠檬酸盐可进一步增强添加剂的作用。在一个实施方案中，柠檬酸盐和rHA都加入本发明培养基添加剂，因为令人惊奇地意外发现将柠檬酸盐加入含有rHA的培养基添加剂后，使得rHA几乎复制了HSA或牛血清白蛋白(BSA)的特性。柠檬酸盐的加入对培养细胞有进一步增强作用。可以使用用于本领域已知培养基的任何柠檬酸盐，包括但不限于柠檬酸胆碱、柠檬酸钙、柠檬酸、柠檬酸钠及其组合物。在一个实施方案中，使用柠檬酸钠。柠檬酸盐加入浓度按培养基总体积计算约0.1mM到约5.0mM。在一个实施方案中，根据培养基总体积，加入柠檬酸盐的浓度约0.1-1.0mM。

本发明培养基添加剂包含任何有用组合的rHA、发酵HYN和/或柠檬酸盐。在一个实施方案中，本发明培养基添加剂和加入本发明培养基添加剂的培养基不含非重组高分子或纯化自动物来源的高分子物质。在另一实施方案中，本发明培养基添加剂和加入本发明培养基添加剂的培养基不含非重组HSA或非发酵HYN。

本发明涉及上述培养基添加剂、含有所述培养基添加剂的培养基、所述培养基添加剂的生产方法、含有所述培养基添加剂的试剂盒和应用本文所述培养基添加剂培养胚胎的方法。

本发明包括一种培养细胞材料的方法，在一个实施方案中培养胚胎，所述方法应用本文所述培养基添加剂，在培养开始时加入所述培养基添加剂，或以补料分批培养或连续培养方式加入。而且，培养基添加剂成分可在培养基生产的不同时期一起或分别加入。

本发明添加剂可加入本领域已知的任何合适的哺乳动物细胞培养基中，包括但不限于胚胎培养基、胚胎移植培养基和来源于任何哺乳动物种类胚胎冷藏培养基(包括冷藏和玻璃化程序)以及干细胞培养基。任何可支持胚胎或细胞生长发育的培养基都可应用，例如包括碳酸氢盐缓冲培养基、Hepes缓冲或MOPS缓冲培养基或磷酸缓冲盐水。培养基的例子有G1.2/G2.2、KSOM/KSOMaa、M16、SOF/SOFaa、MTF、P1、Earle’s、Hams F-10、M2、Heps-G1.2、PBS和/或Whitten’s。(Gardner和Lane，1999；Embryo Culture Systems；Handbook of In Vitro Fertilization，CRC Press，Editors：Trounson AO andGardner DK，2^nd edition，Boca Raton，pp205-264.)。

rHA的生产是本领域众所周知的。在一个实施方案中，rHA从产生人白蛋白的遗传修饰酵母菌中得到。一种用酵母制备rHA的方法参阅美国专利第5,612,197号。

发酵透明质酸糖胺多糖(HYN)可用本领域已知任何方法得到。一种方法是对马链球菌进行连续发酵。透明质酸糖胺多糖是天然存在的聚合物，由连续的二糖单位N-乙酰葡萄糖胺和D-葡糖醛酸组成。透明质酸糖胺多糖在体内广泛分布。发酵HYN分子量一般为2.3×10⁶kD。用链球菌生产HYN本领域众所周知的，可使用任何已知方法，包括在Cifonelli JA，Dorfman A中公开的方法。A族链球菌生物合成透明质酸：The uridine nucleotides of groups A Streptococcus.J.Biological Chemistry 1957；228：547-557；Kjems E，Lebech K.Isolationof hyaluronic acid from cultures of streptococci in a chemically definedmedium.Acta Path.Microbiol.Scand.1976(Sect.B)；84：162-164；Markovitz A，et al.The biosynthesis of hyaluronic acid by group AStreptococcus.J.Biological Chemistry 1959；234(9)：2343-2350。

另一些化合物可加入本发明培养基添加剂中。这些物质包括生长因子，因为哺乳动物胚胎和细胞通常具有许多生长因子受体，加入这些生长因子可增加培养物质的生长率。这些生长因子包括但不限于胰岛素，典型用量为0.1-100ng/ml；IGF II，一般用量为0.1-100ng/ml；EGF，典型用量为0.1-100ng/ml；LIF，典型用量为5-1000U/ml；PAF，典型用量为0.1-500μM；及其组合物。所有用量均按培养基添加剂要加入的培养基总体积计算。

培养基添加剂的制备有两种方式，一种是独立制备培养基添加剂，在培养基制成后加入其中，另一种方法是将所述培养基添加剂各成分在培养基制备过程中直接加入到培养基中。

举例来说，本发明培养基添加剂可如下独立制备。培养基添加剂rHA可制成储备液，加入水、盐水或培养基制成浓度为50-500mg/ml的浓储备液，通常为250mg/ml。或者，配制250mg/ml的储备液溶液。发酵HYN可用水、盐水或培养基制成10-500mg/ml的浓储备液，通常为500mg/ml。通过在瓶中加入水、盐水或培养基并在溶液中加适量HYN制得。然后剧烈振摇或用搅拌棒混和使HYN溶解。可在1ml溶液中加入500mg HYN制备500ng/ml溶液。柠檬酸盐可加入水、盐水或培养基制备5-500mM的浓储备液，通常为500mM。对于500mM的储备液，可在10ml溶液中加入0.9605g柠檬酸。rHA、发酵HYN和柠檬酸盐储备液一起加入制备单一添加剂溶液，然后将其加入最终培养基中得到100×浓储备液。10ml培养基中加入100μl添加剂即可。

rHA粉或储备液可直接加入培养基中。下述实施方案仅仅是举例性说明。250mg/ml的储备液100μl加入9.9ml培养基中。发酵HYN粉或储备液可直接加入培养基中。作为粉末，1.25mg HYN可加入10ml培养基中。或者125μl的1％储备液可加入9.9ml培养基中。柠檬酸盐粉或储备液可直接加入培养基中。作为粉末，9.6mg可加入100ml培养基中；或者100μl50mM的储备液可加入9.9ml培养基中。

本文引用的所有专利和公开出版物通过引用结合到本文中。

本文所述所有范围包括所述范围限度内的所有组合或分组合；因此，“约0.1mg/ml到约20.0mg/ml”包括约0.125mg/ml到约11.5mg/ml、约1.0mg/ml到约15.0mg/ml等。

本发明培养基添加剂解决了几个存在于本领域哺乳动物细胞、组织、胚胎和其他相关细胞物质的培养问题。当前培养基存在的一个问题是，培养的哺乳动物细胞物质、尤其是胚胎可能受到高分子血液制品如人白蛋白中存在的朊病毒和/或内毒素的污染。本发明添加剂的一个优点是，它排除了使用血液制品培养胚胎和其他哺乳动物细胞物质带来的潜在污染。

当前培养基存在的另一个问题是，当使用血液制品如血清白蛋白或其他天然存在物质时，标准化这些培养基十分困难。不仅如此，当培养基中血液制品的天然存在的不确定因素和污染物被排除之后，本发明使得更容易纯化最终培养产物。

本发明排除了使用生物蛋白时涉及的因有不确定因素，生物蛋白经常受到其他分子的污染，并且这些蛋白的不同制剂、相同制剂不同批次之间差异巨大。因此，使用重组分子如rHA使得生理性培养基的制备以标准化方式进行。这些制剂不含内毒素、朊病毒并且与现在使用的培养基相比有更好的生理相容性。当前的培养基包含其他合成高分子如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮，这些分子不能执行重要的生理功能如结合生长因子，因此，使用这些培养基可导致哺乳动物细胞物质培养效果较次。

可根据下述实施例更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易知道，本发明的具体组合物、方法和结果仅仅是说明性的，并不意味着对本发明进行限制。

实施例实施例1

培养基G1.2/G2.2用下表1所示浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基。初步实验考察了用rHA替代纯化自血液的白蛋白对培养基中远系繁殖小鼠胚胎发育的影响。受精卵在3种不同rHA浓度之一条件下培养4天。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时后，在G2.2培养基中培养48小时。阴性对照组不用蛋白处理，阳性对照组使用5mg/mlHSA(血液制品)处理。结果见下表2。

                                  表1

 贮备液  有效期    成分     G1.2     (g/L)    G2.2    (g/L)    FG1    (g/L) A x10浓溶液  3个月    NaCl     5.26    5.26    5.844    KCl     0.41    0.41    0.41    NaH₂PO₄-H₂O     0.035    0.035    0.078    MgSO₄-7H₂O     0.246    0.246    0.246    乳酸钠     1.17    0.66    0.58    葡萄糖     0.09    0.568    0.567    青霉素     0.06    0.06    0.06 B x10浓溶液  1周    NaHCO₃     2.101    2.101    2.1    酚红     0.001    0.001    0.001 C x100浓溶液  2周    丙酮酸     0.0352    0.011    0.0352 D x100浓溶液  1个月    CaCl₂-H₂O     0.265    0.265    0.265 G x100浓溶液  3个月    丙氨酰谷氨酰胺     0.108    0.217    - T x100浓溶液  3个月    牛磺酸     0.0125    -    0.0125 ED  1个月    EDTA     0.029    -    -    NaOH溶液     0.4 N x100溶液    非必需氨基酸     10ml    10ml    10ml E x50溶液    必需氨基酸     -    20ml    - V x100溶液    维生素     -    -    10ml    10ml储备液A和B1.分别称量各成分放入一个100ml烧瓶中。2.加50ml水(Extreme H₂O或Biowittaker)。3.充分混和至所有成分溶解。4.再加入50ml水。5.混和均匀。6.使用0.2μm滤膜滤过。7.储藏于4摄氏度。储备液C-T1.称量组分放入一个10ml试管。2.加10ml水(Extreme H₂O或Biowittaker)。3.混和均匀至溶解。4.使用0.2μm滤膜滤过。5.储藏于4摄氏度。胚胎培养基制备-部分IEDTA储备液1.称量0.029gEDTA放入一个10ml试管。2.称量0.4gNaOH放入另一个10ml试管。3.将10ml水(Extreme H₂O或Biowittaker)加入NaOH中，混和至溶解。4.将220μlNaOH加入EDTA中。5.混和至溶解。6.将9.8ml水加入EDTA中。7.将90ml水加入100ml烧瓶。8.将10mlEDTA溶液加入90ml水中。9.使用0.2μm滤膜滤过。10.储藏于4摄氏度。

                                    表2

   rHA mg/ml    胚泡    孵化  细胞数  ICM数  TE数    ％ICM/总量   0    76.7    31.7  60.8±2.2^a  13.8±0.7^a  47.1±2.0^a    23.0±0.9   1.25    70.7    46.6  72.6±2.2^bc  17.7±0.6^b  56.4±1.9^bc    24.0±0.6   2.5    75    39.3  78.1±2.5^b  18.4±0.5^b  58.4±2.1^b    24.2±0.5   5    76.8    37.5  65.9±2.7^ac  16.3±0.7^b  49.6+2.4^ac    25.2+0.7   HSA 5mg/ml    72.6    38.7  74.3±2.4^bc  17.2±0.7^b  56.2±2.0^bc    23.6±0.6^*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

对培养胚胎发育来讲，rHA在至少1.25-2.5mg/ml浓度范围内可以取代HAS。实施例2

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基。

初步实验考察了用HYN替代纯化自血液的白蛋白对培养远系繁殖小鼠胚胎发育的影响。受精卵在4种不同HYN浓度之一条件下培养4天。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时后，在G2.2培养基中培养48小时。阴性对照组不用蛋白处理。结果见下表3。

                                                   表3

    HYN(mg/ml)    胚泡    孵化  细胞数  ICM数  TE数  ％ICM/总量    0    82.4^a    38.3^a  67.3±2.8^a  16.1±0.7^a  50.3±2.3^a  24.6±0.8^a    0.125    88.6^a    57.1b^c  79.6±1.9^bc  21.2±0.8^bc  58.7±1.5^bc  26.5±0.6^ac    0.25    94.5^a.    72.7^c  74.9±3.4^bc  21.8±1.2^bc  51.9±2.8^ac  29.7±0.8^bc    0.5    100^a    50^b  64.2±1.9^ac  18.0±0.7^ac  46.7±2.0^a  28.3±1.1^bc    1    61.8^b    23.5^a  62.0±2.7^ac  17.5±0.8^ac  49.1±2.5^a  26.4±0.9^ac*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

发酵HYN在至少0.125到0.5mg/ml浓度范围内可刺激小鼠胚胎发育。实施例3

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基。后续实验考察了用rHA及发酵HYN替代纯化自血液的白蛋白对培养远系繁殖小鼠胚胎发育的影响。受精卵培养4天。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时后，在G2.2培养基中培养48小时。结果见下表4。

                                           表4

  处理  细胞数    ICM数    TN数    ％ICM/总量  5mg/ml HSA  73.3±1.7    17.8±0.6    55.5±1.3    24.3±0.5  1.25mg/ml rHA+  0.125mg/ml HYN  71.8±1.6    18.6±0.5    53.2±1.3    26.0+0.5^**不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

使用rHA和发酵HYN一起培养，可显著提高内细胞团细胞(ICM)的发育。因为ICM发育与发育成活胚胎的能力线性相关，％ICM增加可能意味着生存力提高。实施例4

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基。后续实验考察了用rHA及发酵HYN替代纯化自血液的白蛋白对转入受体小鼠后远系繁殖小鼠胚胎发育的影响。受精卵培养4天，然后在胚泡阶段转入受体母鼠。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时后放入G2.2培养基中培养48小时。结果见下表5。

                         表5

移植率(％)胚胎发育(％)胎儿/移植部位(％)  重量(mg) HSA63.343.368.4  208 rHA和HYN65.046.771.8  207

使用rHA和发酵HYN一起培养，对培养胎儿发育与含有添加剂HSA(血液制品)的培养基中培养的作用相同。实施例5

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基，柠檬酸盐以×100储备液100μl加入10ml培养基。进行实验来确定在培养基中进一步添加rHA、发酵HYN及柠檬酸盐是否可增进培养小鼠胚胎发育。在柠檬酸盐存在或不存在情况下用rHA及HYN自受精卵培养胚胎48h。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时。结果见下表6。

                           表6

   第3天平均细胞数8细胞胚胎(％)紧密型胚胎(％)无柠檬酸盐   6.33±0.1769.77.3柠檬酸盐   7.21±0.13^*81.1^*12.2^**与无柠檬酸盐培养基具有显著性差异，P＜0.05。

在含rHA和发酵HYN培养基中加入柠檬酸盐可显著增强胚胎发育。实施例6

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基，柠檬酸盐以×100储备液100μl加入10ml培养基。进行实验来确定在培养基中进一步添加rHA、发酵HYN及柠檬酸盐是否可增进培养小鼠胚胎发育。在柠檬酸盐存在或不存在情况下用rHA及HYN自受精卵培养胚胎48h。胚胎在37℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂培养，培养体积10胚胎：20μl培养基。胚胎在G1.2培养基中培养48小时后放入G2.2培养基中培养48小时。结果见下表7。

                              表7

    处理  桑葚胚/  胚泡(％)    总胚胞    (％)  孵化(总  量的％)  细胞数  ICM数  TE数    ％    ICM/总量    -/-  53.9    45.2  13  100.4  28.9  71.5    28.4    +/-  71.3    67.3  16.8  112.6  34.9  77.7    30.7    -/+  68.5    64.8  23.2   94.8  33.4  61.44    34.5    +/+  72.7    62.7  18.2  100.7  30.9   69.8    30.4^*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

由表7结果可见，加入柠檬酸盐可显著增强胚胎发育。实施例7

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基，柠檬酸盐以×100储备液100μl加入10ml培养基。

初步实验在母牛体内考察了用rHA或发酵HYN或rHA与发酵HYN一起替代纯化自血液的白蛋白(牛血清白蛋白，BSA)对培养受精卵发育的影响。受精卵培养6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂于500μl培养基中培养。胚胎在G1.2培养基中培养72小时后放入G2.2培养基中培养72小时。结果见下表8。

                  表8

  处理    胚胎数 第6天胚泡总数 第7天胚泡总数  BSA    592    30.9^a    36.8  rHA    583    22.1^b    38.4  HYN    549    16.9^b    30.4  rHA+HYN    558    27.8^a    39.1^*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

使用rHA和发酵HYN一起培养，对培养牛胎儿发育的作用与在含BSA的培养基中培养相同。实施例8

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基，柠檬酸盐以×100储备液100μl加入10ml培养基。

后续实验在母牛体内考察了用rHA在含有不含柠檬酸盐的情况下替代纯化自血液的白蛋白(牛血清白蛋白，BSA)对培养受精卵发育的影响。受精卵培养6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂于500μl培养基中培养。胚胎在G1.2培养基中培养72小时后放入G2.2培养基中培养72小时。结果见下表9。

                        表9

  处理 第6天胚泡总数    第6天胚泡    细胞数 第6天胚泡内细胞团细    胞数  BSA    40.2    143±6^a    46.2±1.9^a  rHA    36.6    123±7^b    37.9±1.9^b  rHA+柠檬酸盐    41.4    146±5^a    45.3+1.9^a*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

添加rHA和柠檬酸盐一起培养，对母牛胎儿发育的作用与含有BSA的培养基培养相同。实施例9

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。rHA以250mg/ml储备液200μl加入9.8ml培养基，发酵HYN以×100储备液100μl加入10ml培养基，柠檬酸盐以×100储备液100μl加入10ml培养基。

后续实验在母牛体内考察了在rHA和柠檬酸盐中加入发酵HYN对培养受精卵发育及随后使其冷藏能力的影响。受精卵培养6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO₂∶5％O₂∶89％N₂于500μl培养基中培养。胚胎在G1.2培养基中培养72小时后放入G2.2培养基中培养72小时。胚泡进行染色确定细胞数或冷藏然后解冻评价存活率。结果见下表10。

                        表10

  处理  第7天胚泡    总数    第7天胚泡    细胞数    融化存活并再    扩张  BSA    42.3    150±10    38.5^a  rHA+柠檬酸盐    50.0    134±10    57.1^b  rHA+柠檬酸盐+HYN    51.1    159±10    80^c*不同上标表示显著性差异，P＜0.05。

培养基中添加rHA、柠檬酸盐和发酵HYN，可显著提高胚泡冻融存活能力。实施例10

培养基G1.2/G2.2如实施例1所述用浓储备液制得。

本实验考察了在rHA和HYN存在下培养CF1小鼠胚胎对胚胎冻融存活能力的影响。CF1小鼠胚胎培养到胚泡阶段并评价了发育情况和冻融程序的存活能力。

                                  表11

  处理  发育至胚泡  阶段(％)    胚泡孵    化率(％)    融化后再    扩张(％)    融化后    孵化(％)  融化后  完全孵化  HSA  88.2    49.0    76.1    42.9  28.6  HSA+HYN  81.8    43.2    79.5    45.5  29.6  rHA+柠檬酸盐  85.0    53.4    77.5    57.5^*  40.0^*  RHA+柠檬酸盐+HYN  79.0    51.9    83.8    67.6^*  51.3^**与HAS具有显著性差异，P＜0.05。

从这些结果可清楚地看到，与用HSA培养胚泡相比，用rHA或rHA和HYN一起培养可显著增加融化后胚泡孵育率(P＜0.05)。

冷藏后培养长出胚泡能力也做了评定。ICM和TE的生长以数字0-3表示，0表示没有生出而3表示充分生长。证实生长与生存力相关(Lane和Gardner，1997)。

                         表12

处理    附着(％)   ICM生长晕(％)    TE生长晕(％)HSA    89.5   0.8±0.1    1.8±0.1HSA+HYN    91.2   2.2±0.1^*    1.7±0.1^*rHA+柠檬酸盐    85.0   1.8+0.1^*    1.6±0.1^*rHA+柠檬酸盐+HYN    86.8   2.1±0.1^*    1.9±0.1^**与HAS具有显著性差异，P＜0.05。

由表12可知，相比较于用人血清白蛋白培养胚胎，在含rHA或HYN的培养基中培养胚胎可使ICM发育程度提高。实施例11

本实施例说明了含有rHA、HYN和柠檬酸盐的培养基使得冷藏的额外胚泡成功膨胀。

在本实施例中，捐赠的冷藏人原核胚胎融化后在培养基G1.3中培养48小时，然后，根据美国专利申请第09/201,594号内容进行下述变化，在G2.3培养基中培养。G1.2-G1.3培养基中含1.0到1.8浓度的MgSO₄及1.8-1.0浓度的CaCl₂。G2.2-G2.3培养基的变化情况与G1培养基变化情况相同，都加入半浓度的必需氨基酸，没有烟酰胺、肌醇和叶酸。

两种培养基都添加2.5mg/ml rHA和0.125mg/ml HYN。胚胎冷藏溶液为4.5％甘油、0.1M蔗糖(10min)，然后为9％甘油和0.2M蔗糖(7min)。将胚胎放入-6℃冷藏机，接种并保持10min，然后每分钟降温0.5℃直至-32℃。将胚胎投入液氮中。融化后立即将胚胎在500nl新鲜G2.3培养基中各自培养4小时，之后分别放入10μl G2.3中过夜培养。所有培养条件均为5％O₂∶6％CO₂∶89％N₂。500nl培养基样本冷藏并使用超显微荧光分析。还检测了融化胚胎对蔗糖和丙酮酸盐的摄入。

                                 表13

胚泡数平均葡萄糖摄取量(pmol/胚胎/h)平均丙酮酸盐摄取量(pmol/胚胎/h)  24h后完全扩  张胚泡数  24小时后完  全孵化胚泡数1640.615.2  12(75％)  5(31％)实施例12

本实施例应用了Gardner等1988和Schoolcraft 1999概述的IVA方案。

本实施例说明了含rHA、HYN和柠檬酸盐的培养基对人胚胎发育的有益作用。

                      表14

处理组    患者数    产生的子代    移植率HSA    10    7(70％)    32.8％RHA+柠檬酸盐+HYN    12    9(66.7％)    31.9％