区分正常妊娠和异位妊娠的诊断装置及其制备方法

摘要

本发明提供可同时检测和区分正常妊娠和异位妊娠的一步妊娠诊断装置以及制备这种装置的方法。根据本发明，通过免疫检测分泌到孕妇体液中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)及其修饰形式间的形态差别，可在早期快速而准确地测定正常妊娠和异位妊娠。

说明书

技术领域

本发明涉及用于区分正常妊娠和异位妊娠的一步妊娠诊断装置以及这种装置的制备方法。更具体地说，本发明涉及通过免疫检测分泌到孕妇体液中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)及其修饰形式间的形态差别而可以在早期快速而准确地测定正常妊娠和异位妊娠的诊断装置，以及制备这种装置的方法。

背景技术

异位妊娠指受精卵着床在正常子宫内膜外的妊娠，根据着床的位置分为输卵管妊娠、宫颈妊娠、卵巢妊娠、腹膜妊娠等等。95％以上的异位妊娠事件为输卵管妊娠，因此它被用作异位妊娠的一般名称。异位妊娠的病因学包括在先的输卵管结扎(避孕)、PID(盆腔炎)、排卵控制配方给药和STD(性传播疾病)，异位妊娠的发生率高达约每64～241个孕妇中就有一个。

异位妊娠是最常发生的产科和妇科急症之一，并且它的发生率逐年增加。异位妊娠导致的输卵管破裂的可观察到的症状包括下腹痛、闭经或阴道出血、血压下降引起的头晕、胃肠道症状引起的恶心和呕吐。未治疗的输卵管破裂可能导致腹膜内出血，这是孕妇在妊娠早期死亡的最大原因。因此，如果异位妊娠未在早期发现，输卵管破裂和随后出血休克的发生可能导致患者死亡。然而，异位妊娠的早期诊断面临困难，因为还没有发现特定的症状和可特定地用于异位妊娠的诊断方法。在这些情况下，本发明的发明人对异位妊娠的早期检测可以降低孕妇死亡率并解决正常妊娠的妇女担心异位妊娠的焦虑的假设进行了广泛研究，现在已发现用于异位妊娠的早期诊断的方法和装置。

人绒毛膜促性腺激素(下文中称为“hCG”)产生于胎盘的合胞滋养层，它在妊娠早期诱导黄体酮的稳定产生以维持胚泡进入子宫内膜的过程直到妊娠第10周，这时胎盘功能完善。它还刺激胎儿睾丸中睾酮的产生，在男性胚胎内生殖器的分化中起重要作用，并且还具有其它各种功能包括刺激母体甲状腺。在受孕(或受精)后约8天在血液和尿中检测到hCG水平约为25mIU/ml。接着它的浓度从妊娠第5周开始以稳定的速度快速上升，在妊娠第6周达到约1IU/ml，在妊娠第10周达到约100～120IU/ml。在妊娠第10到18周期间，浓度由那一水平下降到妊娠第20周时的约20IU/ml，此后浓度维持稳定。hCG是糖蛋白，其由α和β两个亚基组成，含有30％的碳水化合物，分子量约为36700道尔顿。α-亚基由92个氨基酸残基组成，具有与黄体生成素和甲状腺刺激激素的α-亚基相同的结构。β-亚基由145个氨基酸残基组成(hCG的结构特征)(Lapthorn等，Nature.1994.Vol369：455～461)。

一般而言，发现hCG在人体液中以各种形式存在。已知的有完整的hCG(I-hCG)以及修饰的hCGs，后者包括缺口hCG(N-hCG)、高糖基化的hCG、游离的β-hCG和游离的β-核心片段。hCGs的这些各种形式产生于妊娠、脑垂体、滋养层疾病和绒毛膜癌事件中。在正常妊娠妇女的体液中，完整的hCG约占存在的总hCGs的90％，各种修饰的hCGs约占10％或10％以下。

在另一方面，异位妊娠的特征为几乎所有的hCGs均以完整的hCG的形式存在，与正常妊娠相反，它仅有极少量的修饰的hCGs，其中测得缺口hCG和游离β-hCG的某些比率。另外，与正常妊娠相比，其hCG分泌总量和增加范围非常小。因此，在妊娠第6周其hCG分泌量约为正常妊娠的1/5，在妊娠第8周则降至正常妊娠的约1/50，也就是约15IU/ml。

美国专利第5,786,220号公开了区分正常妊娠和异常妊娠的一步诊断试剂体系的制备方法。这一专利公开了正常妊娠、自然流产、异位妊娠、癌症等可以通过同时测定女性体液中的黄体酮浓度和hCG水平来诊断。具体而言，该专利公开了一种诊断方法，其中血液中黄体酮的浓度为25ng/ml或25ng/ml以下，并且hCG的浓度为25～2500mIU/ml，表示自然流产或异位妊娠；黄体酮浓度超过25ng/ml，并且hCG浓度超过2500mIU/ml，表示正常的子宫内妊娠。Denil等(Fertility& Sterility.1999.Vol.72：1013～1017)公开了在正常妊娠中，游离β-hCG水平为30～170IU/ml，在异常子宫内妊娠中，为1～70IU/ml，在异位妊娠中为0.059～29IU/ml，这表明在异位妊娠中分泌的hCG降解产物的浓度比正常妊娠中低得多。

如上所述，hCG是妊娠诊断中最重要的激素，利用妊娠早期的hCG水平，结合超声检查，可以区分妊娠、流产和异位妊娠。在妊娠诊断中，hCG可以用于确证早期妊娠。低水平的hCG和加倍时间，后者指在受孕第5周到第9周期间每1.4～2天血液中hCG加倍，表明流产或异位妊娠。hCG水平高于正常值解释为表明多胎妊娠或葡萄胎。除了测定孕妇血浆和尿中的hCG水平外，异位妊娠也通过超声波检查法、诊断腹腔镜检查及类似方法进行诊断。特别地，超声波检查法结合hCG水平测定进行诊断，其中超声发现存在妊娠囊，并且hCG水平低于1000mIU/ml，表明妊娠生存能力不足。如果每48小时hCG水平不定量增加至少65％，则确定妊娠的预后很差。

这种用于异位妊娠的诊断方法如测定hCG水平加倍时间的已知方法和测定孕妇体液中游离β-hCG水平的方法具有需要重复采血样的缺点。美国专利第5,786,220号中公开的妊娠诊断方法建立在与本发明不同的诊断原理的基础上，其不同之处在于黄体酮浓度的测定应与hCG水平的测定平行进行。即使可以区分正常妊娠和异常妊娠，也还存在另一个问题，对孕妇来说很危险的常见自然流产和异位妊娠间的有效早期区分很难获得。

因此，本发明的发明人对一步同时诊断试剂盒的制备方法进行了广泛的研究，通过所述试剂盒，可以在妊娠早期诊断中同时实现正常妊娠和异位妊娠的诊断。结果，现在本发明的发明人提供一步同时诊断试剂盒，通过所述试剂盒，通过测定hCG水平为25mIU/ml，可以确定为正常妊娠，通过比较I-hCG和修饰的hCGs的浓度，可以确定异位妊娠。

发明内容

本发明的目的是提供用于在妊娠早期一步同时诊断正常妊娠和异位妊娠的诊断装置，以及制备这种装置的方法。

本发明的特征在于抗-I-hCG单克隆抗体与抗-α-hCG单克隆抗体的组合使用，抗-修饰的hCG单克隆抗体与抗-β-hCG单克隆抗体的组合使用，以分别检测孕妇体液(血液、尿、唾液等)中存在的I-hCG和修饰的hCG

附图说明

图1a显示本发明的用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断装置的示意图。参考数字1和4标明了诊断试剂盒的阅读窗口，参考数字2和5标明了指示测试完成的标记(C)。参考数字3标明了异位妊娠线(下文中称为“EP”)，参考数字6标明了正常妊娠线(下文中称为“NP”)。参考数字7标明了样品接受窗孔，孕妇体液被施加到其中。

图1b示意性地显示了图1a中用于内部条带的抗体固定化膜上的结果线(NP、EP)和完成线(C)。参考数字11标明了硝化纤维膜。参考数字8和12标明了完成线，在此处固定有兔抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体。参考数字9标明了测试结果线，在此处固定有抗-β-hCG单克隆抗体，参考数字13标明了测试结果线，在此处固定有抗-α-hCG单克隆抗体。参考数字10标明了其上结合有抗-修饰的hCG单克隆抗体的有色颗粒垫，参考数字14标明了其上结合有抗-I-hCG单克隆抗体的有色颗粒垫。

图2a显示本发明的用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断装置的另一示意图。参考数字15标明了指示测试完成的标记(C)。参考数字16标明了异位妊娠线(EP)，参考数字17标明了正常妊娠线(NP)。参考数字18标明了诊断装置的阅读窗口，参考数字19标明了样品接受窗孔，孕妇体液样品被施加到其中。

图2b示意性地显示图2a中用于内部条带的抗体固定化膜上的结果线(NP、EP)和完成线(C)。参考数字20标明了硝化纤维膜。参考数字21标明了完成线，在此处固定有兔抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体。参考数字22标明了异位妊娠(EP)线，在此处固定有抗-α-hCG单克隆抗体，参考数字23标明了正常妊娠(NP)线，在此处固定有抗-β-hCG单克隆抗体。参考数字24标明了其上结合有抗-修饰的hCG单克隆抗体和抗-I-hCG单克隆抗体的混合有色颗粒垫。

图3显示本发明的用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断装置中内部条带的结构。参考数字25标明了样品吸收垫，参考数字26标明了抗体固定化的硝化纤维膜，参考数字27标明了有色颗粒垫，参考数字28标明了样品接受垫，其中这些垫以部分重叠的方式顺序组合。

具体实施方式

本发明建立在称为夹心测定(sandwich assay)的免疫测定方法的基础上。在这种测定中，用于测定的抗体的选择非常重要，因为抗体支配对要测定的样品的灵敏度和专一性。在夹心测定中，主要使用两种单克隆抗体，其中抗体的结合位点应该存在于相关抗原的不同区域，以维持测定灵敏度。例如，为了用夹心测定检查分泌到孕妇体液(血液、尿、唾液等)中的hCG，需要两种单克隆抗体，这两种抗体在抗原(hCG)上的结合位点应该清楚地分开。如果所用的两种抗体在抗原(hCG)上的结合位点位于相似或接近的区域上，位阻可能导致测定灵敏度下降。本发明利用免疫测定方法中基于夹心测定的免疫层析方法。特别地，以前表征的单克隆抗体通过共价或非共价键结合到有色微粒(有色颗粒)上，由此而得的颗粒用作流动相。第二个以前表征的单克隆抗体分散入并固定到硝化纤维膜上，用作固定相。要测定的样品与流动相混合并通过毛细作用流过作为固定相的膜。在此，如果样品中含有相关的抗原，流动相和固定相经抗原缀合，从而在固定相上出现可见的有色颗粒线。根据这种可见线的出现与否，可在视觉上判断样品中相关抗原的存在与否。本发明中要使用的单克隆抗体可作为现有的商品单克隆抗体购得，或根据已知的细胞融合方案来制备。用于实施例的抗体根据制备单克隆抗体的已知方法来制备，其中选择对I-hCG有反应性的抗体和对修饰的hCG有反应性的抗体。对于抗-α-hCG抗体和抗-β-hCG抗体，选择并使用单克隆抗体，当用标准hCG检测时，所述抗体很好地维持灵敏度。

如上所述，女性正常妊娠或异位妊娠早期阶段时尿中的hCG以各种形式存在。特别地，异位妊娠情况下发现的大多数hCG以完整形式(I-hCG)存在，仅有很少量的修饰的hCG存在。在正常妊娠的情况下，I-hCG约占存在的总hCGs的90％，各种修饰的hCGs约占10％。利用以上差别，本发明可以通过分别检测和视觉比较I-hCG和修饰的hCGs而确证妊娠并同时区分正常妊娠和异位妊娠。本发明的诊断装置的构建通过分别提供具有异位妊娠(EP)区和正常妊娠(NP)区的诊断试剂盒来完成，其中当样品中存在I-hCG时，在异位妊娠区中出现有色线，当样品中存在修饰的hCGs时，在正常妊娠区中出现有色线。在异位妊娠的情况下，大多数hCG以I-hCG的形式存在。因此，有色线由于I-hCG的反应将仅在EP区出现，或者即使NP线出现，也将出现强得多的EP线。在正常妊娠中，除了I-hCG外，体液中存在的修饰的hCG约为10％。因此，在本发明的诊断装置中，将其上结合有对修饰的hCGs有反应性的抗体的有色颗粒的浓度增加2～10倍，或者使要结合的抗体的浓度相应增加，从而增强修饰的hCGs的反应灵敏度。这将致使在两个区(EP、NP)中出现的有色线的强度相似，以辅助诊断正常妊娠。

在下文中，本发明的妊娠诊断装置的结构将得到更详细的描述。

在异位妊娠中过量表达的抗I-hCG单克隆抗体根据众所周知的方法进行制备，并接着结合到有色颗粒上。将由此而得的颗粒掺入玻璃纤维垫中，并进行干燥以产生有色颗粒垫。在另一方面，抗修饰的单克隆抗体根据众所周知的方法进行制备，并接着结合到有色颗粒上。将由此而得的颗粒掺入玻璃纤维垫中，并进行干燥以产生有色颗粒垫。可以用于本发明的各种有色颗粒包括聚苯乙烯颗粒、胶体金及类似物。在这种颗粒中，优选胶体金，粒径为20到60nm的胶体金更为优选。

为了维持诊断装置的灵敏度，结合到抗原(hCG)结合位点上的单克隆抗体用作固相膜，该抗原结合位点与结合在有色颗粒上的抗体的结合位点不同。用于这一目的单克隆抗体为抗-β-hCG单克隆抗体和抗-α-hCG单克隆抗体。通过将抗体分散入膜中分别形成直线而将这两种抗体固定在分开的硝化纤维膜上(图1)，或者通过将抗体分散入膜中形成两条交叉的线或两条分离的线而将这两种抗体固定在一个膜上(图2)。在单克隆抗体结合区带的膜下游末端，将抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体分散入膜中，从而将出现测试完成线。

如上述制备的抗体固定化膜可被贴在其上施加有粘合剂的聚酯载体上，接着在上面纵向施加单克隆抗体-有色颗粒垫。接着纵向以相互重叠的方式施加要直接滴加孕妇体液的样品接受垫和吸收过量体液的样品吸收垫，从而提供用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断试剂盒的内部条带(图3)。

现在将阐述使用如上述制备的同时诊断装置来早期诊断正常妊娠和异位妊娠的方法。

当将孕妇体液(血液、尿、唾液等)样品施加到样品接受垫上时，样品通过毛细作用被吸收并迁移，接着和掺入有色颗粒垫中的单克隆抗体结合的有色颗粒反应。在正常妊娠的情况下，存在于样品中的I-hCG和修饰的hCGs将分别结合到结合于有色颗粒上的单克隆抗体上并沿着硝化纤维膜相移动。在固定有两种单克隆抗体的膜区域，抗原抗体复合物将分别以夹心方式结合，从而由有色颗粒形成的两条结果线(NP、EP)以相似的强度在膜上出现。

在异位妊娠中，I-hCG组成了体液中存在的大部分hCGs。因此，I-hCG结合的单克隆抗体和有色颗粒的复合物将沿着膜移动，并结合到抗-α-hCG单克隆抗体上以产生很强的EP带。相反，其上结合有抗修饰的hCG单克隆抗体的有色颗粒将不与样品中的I-hCG反应，因此它将继续移动而不结合到固定有抗-β-hCG单克隆抗体的膜上。颗粒还可以与样品中存在的极少量修饰的hCGs反应，产生强度很弱的NP带。因此，在异位妊娠的情况下，将出现一条EP带或强度不同的两条带(EP带强于NP带)。

如果被测妇女并没有怀孕，单克隆抗体-有色颗粒复合物将继续移动而不结合到固定在膜中结果线(NP、EP)上的抗-hCG单克隆抗体上，因为样品中并不存在hCG。因此，有色颗粒带将仅出现在固定有抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体的测试完成线(C)上。

描述本发明的用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断装置的形状和结构的实例如图1a到2b所示。

如果结合到有色颗粒垫上的抗体和结合到膜上的抗体交换，可以获得相同的结果。如上所述将抗-α-hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体分别结合到有色颗粒上，将抗-I-hCG单克隆抗体、抗-修饰的hCG单克隆抗体和抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体固定在硝化膜上以提供诊断试剂盒。当将来自孕妇的体液施加到样品接受垫上时，1)在正常妊娠中，样品中存在的I-hCG和其它修饰的hCGs分别结合到结合于有色颗粒上的抗-α-hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体上，并沿着硝化纤维膜移动，接着分别以夹心方式结合到固定在膜上的抗-I-hCG单克隆抗体和抗-修饰的hCG单克隆抗体上，从而导致膜上出现两条强度相似的结果线(NP、EP)；2)在异位妊娠中，存在于体液中的I-hCG结合到结合于有色颗粒上的抗-α-hCG单克隆抗体上，并沿着膜移动，接着结合到膜上的抗-I-hCG单克隆抗体上，从而仅给出很强的EP带，或者样品中存在的极少量修饰的hCG产生强度很弱的NP带；3)如果被测妇女并没有怀孕，单克隆抗体-有色颗粒复合物将继续移动而不结合到固定在膜中结果线(NP、EP)上的抗-hCG单克隆抗体上，因为样品中并不存在hCG。因此，有色颗粒带将仅出现在固定有抗-鼠免疫球蛋白多克隆抗体的测试完成线(C)上。

现在，本发明将通过下列实施例进行详细描述。本领域技术人员应理解，这些实施例仅出于阐明本发明的目的，而不应解释为限制本

发明的范围。实施例1：抗-I-hCG单克隆抗体和抗-α-hCG单克隆抗体的制备和纯化A：免疫和细胞融合

将已知的细胞融合过程(Galfre，G等，1981，Methods Enzymol.73：3-46)用于制备抗I-hCG的单克隆抗体。首先，将20μg/100μlI-hCG(Zymed，美国)用100μl弗氏完全佐剂充分乳化并腹膜内注射入Balb/C小鼠(8周)。3周后，除了用100μl弗氏不完全佐剂进行乳化外，在与第一次注射相同的方案下进行第二次腹膜内注射。1周后，从小鼠采集血样，通过ELISA测定抗体形成，此后在尾部静脉注射20μg hCG。3天后，从小鼠回收脾细胞，用预培养的Sp2/O细胞和PEG进行细胞融合。在加入HAT培养基的96孔板中培养融合的细胞。接着，选择分泌对I-hCG有反应性的抗体的细胞和分泌对α-hCG有反应性的抗体的细胞，并进行大规模培养。B：单克隆抗体的纯化

离心大规模培养物以除去沉淀。吸取上清液并加载到蛋白A-琼脂糖凝胶(FF)柱上，用磷酸盐缓冲液淋洗，用0.1M甘氨酸缓冲液洗脱。洗出液用磷酸盐缓冲液透析以调整浓度并用于制备诊断试剂盒。实施例2：抗-修饰的hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体的制备和纯化

从小鼠获得脾细胞，所述小鼠此前已用购自Zymed的β-hCG抗原根据与实施例1，A中相同的过程免疫三次。这些细胞与Sp2/O细胞混合，用PEG进行细胞融合。在加有HAT培养基的96孔板中培养融合的细胞。接着，选择分泌对β-hCG有反应性的抗体的细胞和分泌对修饰的hCGs有反应性而对完整hCG没有反应性的抗体的细胞，并进行大规模培养。接着，根据与实施例1，B中相同的纯化过程从大规模培养物纯化单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液透析后调整浓度，并接着用于诊断试剂盒的制备。实施例3：胶体金(有色颗粒)的制备

将粒径为20～60nm的胶体金用作有色颗粒。为了制备胶体金，向500ml圆底烧瓶中加入220ml双蒸水。接着将烧瓶放在电热板(Corning，美国)上，装上回流装置(Pyrex，美国)以防止水分蒸发。打开电热板将悬浮的烧瓶加热到100℃。当蒸馏水的温度超过100℃时，边混合边加入1.0ml 2％的氯化金(Sigma，美国)，接着加入2.0ml 1％的柠檬酸钠(Sigma，美国)。继续加热30分钟以产生胶体金。在0.45μm滤纸上过滤由此而得的胶体金，以除去杂质和聚集体，接着用于诊断装置的制备。实施例4：掺有其上结合有单克隆抗体的有色颗粒的有色颗粒垫的制备

为了制备其上结合有单克隆抗体的有色颗粒，将实施例3中制备的有色颗粒的50ml等份试样分别放在烧杯中。实施例1和2中制备的单克隆抗体分别以每1ml有色颗粒1～15μg的量在搅拌下加到烧瓶中，并反应2～30分钟。反应结束后，向每个烧杯中加入含有1～10％牛血清白蛋白的封闭溶液使白蛋白的最终浓度为0.1～1％，并反应2～30分钟。

将反应混合物放入50ml离心管(Corning，美国)中，在超速离心机(Beckman，美国)中在10000rpm下离心15分钟。离心后，弃去上清液，转移沉淀并在稳定化缓冲液(0.5～2％牛血清白蛋白，1～5％蔗糖，50～100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5～9.0))中再悬浮。将所得的悬浮液调整到合适浓度，将有色颗粒垫浸入悬浮液中并接着干燥。加入其上结合有实施例2中获得的抗-修饰的hCG单克隆抗体的有色颗粒，直到其浓度为其上结合有实施例1中获得的抗-I-hCG单克隆抗体的有色颗粒浓度的2～10倍。或者，将浓度为2～10倍高的抗-修饰的hCG单克隆抗体被于结合反应，这样测试样品中含有的相对少量(10％)的修饰的hCGs可得到清晰检测。

当将实施例2中获得的抗-β-hCG单克隆抗体和实施例1中获得的抗-α-hCG单克隆抗体制成有色颗粒垫时，将结合到膜上的抗-修饰的hCG单克隆抗体的浓度调整到2～10倍高于抗-I-hCG单克隆抗体的浓度，由此修饰的hCG可得到清晰检测。实施例5：抗体固定化膜(阅读面板)的制备

为了使结果线在固定有抗体的区带内响应正常妊娠和异位妊娠，将识别并结合α-hCG的单克隆抗体和识别并结合β-hCG的单克隆抗体滴加到硝化纤维膜上分别形成直线。浓度为1～4.0mg/ml的抗体得到制备，将该抗体滴加并固定在膜上，其最终浓度为0.1～5μg/cm，其中含有0.1～2％蔗糖的5～50mM磷酸盐缓冲液用作固定化溶液。在单克隆抗体滴加区带下游，用浓度为0.5～2mg/ml的兔抗-鼠免疫球蛋白(IgG)多克隆抗体提供反应结束线(图1a和2b中的C)，其中含有0.1～2％蔗糖的5～50mM磷酸盐缓冲液用作固定化溶液。完成抗体固定化的膜在室温下干燥2小时。要固定的抗体和滴加模式可以根据要显示的结果线的形状而变化。图1中显示的诊断试剂盒通过将抗-α-hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体滴加并固定在不同的膜上来制备。在图2中显示的诊断试剂盒中，为了使结果线在一个膜上出现，将两种抗体以两条分开的直线的形式滴加并固定在膜上。特别是对于如图1显示的诊断试剂盒，要固定在膜上的抗体和要结合到有色颗粒上的抗体的选择对于获得需要的结果很重要。因此，当使用其上固定有抗-α-hCG单克隆抗体的膜时，就需要使用其上结合有抗-I-hCG单克隆抗体的有色颗粒垫。当使用其上固定有抗-β-hCG单克隆抗体的膜时，就需要使用其上结合有抗-修饰的hCG单克隆抗体的有色颗粒垫，这样修饰的hCG就可得到检测。当使用其上固定有抗-修饰的hCG单克隆抗体的膜时，就使用其上结合有抗-β-hCG单克隆抗体的有色颗粒垫。如果使用其上固定有抗-I-hCG单克隆抗体的膜，就需要使用其上结合有抗-α-hCG单克隆抗体的有色颗粒垫。实施例6：样品接受垫和样品吸收垫

将玻璃纤维(Millipore，美国)或纤维素纸(Whatman，英国)用于样品接受垫中，将纤维素纸(Whatman，英国)用于样品吸收垫中。实施例7：用于妊娠和异位妊娠的同时诊断的条带的制备

如图3所示，将实施例5中制备的抗体固定化膜贴到粘性聚酯载体上，将实施例4中制备的抗体结合的有色颗粒垫施加在其上，重叠1～3mm。接着施加样品接受垫，纵向重叠1～10mm，接着施加样品吸收垫，重叠1～5mm，由此获得同时诊断条带。将所得的同时诊断条带组装到如图1a和图2a中所示的那些塑料套中，从而产生用于正常妊娠和异位妊娠的同时诊断试剂盒。实验例1：用hCG标准溶液评价同时诊断试剂盒

为了评价上述实施例制备的诊断试剂盒的专一性，由来自Zymed(Cat.No.14-1401)的商品I-hCG和通过超声检查判断为正常妊娠的孕妇的妊娠早期的尿制备hCG标准溶液。用于要评价的试剂盒的有色颗粒垫通过将抗I-hCG的单克隆抗体和抗修饰的hCGs的单克隆抗体分别结合到实施例4中的有色颗粒上来制备。抗体结合的膜通过如实施例5所述在硝化纤维膜上分别滴加抗-α-hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体来制备。将由此而得的两种抗体固定膜和两种有色颗粒垫组装来提供每一种可能的膜和垫的组合。接着将样品接受垫和样品吸收垫分别贴到装置上以产生同时诊断条带。

制备标准溶液、阴性和阳性标准并用于测试。

阴性标准：50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)

阳性标准1：I-hCG 50mIU/ml磷酸盐缓冲液(pH 7.2)

阳性标准2：来自早期妊娠妇女的尿，其中超声检查确证正常子宫内妊娠囊，并且检测到胎儿的心跳。

向样品接受区带施加约500μl上述标准溶液，并观察3分钟。结果线的出现与否表明结果的“阳性”和“阴性”。

测试结果列于下面表1中。表1.用于同时诊断试剂盒(1)的单克隆抗体识别性质的比较

  标准  结合到膜上的抗体    结合到有色颗粒上的抗体 抗-修饰的hCG单克隆    抗体抗-I-hCG单克隆    抗体  阴性标准  抗-β-hCG抗体    -    -  抗-α-hCG抗体    -    -  阳性标准1  抗-β-hCG抗体    +    +  抗-α-hCG抗体    +    ++  阳性标准2  抗-β-hCG抗体    +++    +  抗-α-hCG抗体    +    +++注：-(没有反应)，+(很弱的反应)，++(显著反应)，+++(强烈反应)

由表1可见，在不含有hCG的阴性标准的情况下，测定结果为“阴性”，因为在膜上固定有抗体1和2的区带内没有出现线。对于含有I-hCG的阳性标准1，其上结合有抗-I-hCG单克隆抗体的有色颗粒和固定有抗-α-hCG单克隆抗体的区带显示出强烈的相互作用，具有其它单克隆抗体的试剂盒显示出很弱的相互作用。对于利用来自正常妊娠的妇女的尿的阳性标准2，其上结合有抗-I-hCG单克隆抗体的有色颗粒和固定有抗-α-hCG单克隆抗体的区带显示出强烈的相互作用。其上结合有抗-修饰的hCG单克隆抗体的有色颗粒和固定有抗-β-hCG单克隆抗体的区带也显示出强烈的相互作用。从这些结果可以认识到，抗-I-hCG单克隆抗体结合抗-α-hCG单克隆抗体可检测I-hCG，而用抗-修饰的hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体可检测修饰的hCGs。

当结合到有色颗粒和膜上的抗体互换时获得相似的结果，这清楚地表明测定中所用抗体组合的重要性。表2显示用标准hCG溶液测试的结果，其中抗-α-hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体结合到有色颗粒上，抗-I-hCG单克隆抗体和抗-修饰的hCG单克隆抗体固定在膜上，以制备同时诊断试剂盒。表2.用于同时诊断试剂盒(2)的单克隆抗体的识别性质的比较

  标准  结合到膜上的抗体    结合到有色颗粒上的抗体抗-β-hCG单克隆    抗体抗-α-hCG单克隆    抗体  阴性标准  抗-修饰的hCG抗体    -    -  抗-I-hCG抗体    -    -  阳性标准1  抗-修饰的hCG抗体    +    +  抗-I-hCG抗体    +    ++  阳性标准2  抗-修饰的hCG抗体    +++    +  抗-I-hCG抗体    +    +++注：-(没有反应)，+(很弱的反应)，++(显著反应)，+++(强烈反应)

由上面实验例可以看出，正常妊娠和异位妊娠可以用肉眼检测，因为出现线的位置和强度取决于样品中含有的hCG的形式。实验例2：用同时诊断正常妊娠和异位妊娠的试剂盒测试孕妇尿样

表3显示测试结果，在该测试中，将来自非妊娠妇女、正常妊娠妇女和异位妊娠妇女的尿样分别施加到本发明的同时诊断试剂盒上，以测定正常妊娠和异位妊娠中特异性发现的修饰的hCGs和I-hCG。正常妊娠的尿样来自超声检查确证子宫内妊娠囊和已检测到胎儿心跳的孕妇。异位妊娠的尿样来自通过外科手术确证为异位妊娠的妇女。用于本实施例的诊断试剂盒为图1a中所示的形式。表3.同时诊断试剂盒的临床准确性的测定注：-(没有反应)，+(很弱的反应)，+++(强烈反应)

由表3可见，在来自非妊娠妇女的尿样的情况下，NP和EP结果线位置并不出现线。在来自正常妊娠妇女的尿样的情况下，出现相似强度的NP和EP结果线。特别的是，对于来自异位妊娠妇女的尿样，出现的EP结果线比NP结果线强得多，这意味着信息显示正常妊娠和异位妊娠间存在显著差别。

工业应用性

本发明提供可同时检测正常妊娠和异位妊娠的一步妊娠诊断装置以及这种装置的制备方法。由于孕妇体液根据妊娠形式而含有不同形式的hCG，本发明通过免疫学检测体液中存在的hCG的形式而在妊娠早期快速准确地检测正常妊娠和异位妊娠。在本发明中，为了分别检测孕妇体液中存在的I-hCG和修饰的hCGs，抗-I-hCG单克隆抗体与抗-α-hCG单克隆抗体组合，抗-修饰的hCG单克隆抗体和抗-β-hCG单克隆抗体组合。因此，本发明通过在早期发现异位妊娠而将有助于降低孕妇死亡率。