含有人甲状旁腺激素的药物成分及含有该成分的用于鼻内给药的药物组合物

摘要

一种药物成分，其特征在于含有人甲状旁腺激素肽或其衍生物和乙酸，并且所含乙酸的量低于相对于人甲状旁腺激素肽或其衍生物的化学计算量；以及含有这些成分的药物组合物。在这些药物成分中，以人甲状旁腺激素肽或其衍生物的附着物形式存在的乙酸的量降低至其相对于肽或其衍生物的化学计算量以下。因此，这些成分具有高度的稳定性，并且在用于药物组合物中时能提供优良的使用感。

说明书

发明领域

本发明涉及一种含有人甲状旁腺激素的药物成分，该药物成分具有优良的稳定性，在用作药物组合物的成分时能保证良好的使用感。另一方面，本发明涉及一种含有人甲状旁腺激素的用于鼻内给药并且适于长期使用的药物组合物。

背景技术

人甲状旁腺激素肽(下文称为“hPTH”)是生物活性肽类，负责骨代谢，并具有强烈的骨形成活性(Aurbach等人，激素研究的最新进展(RecentProgr.Horm.Res.)，1972年，28卷，35页)。hPTH是一种通常由84个氨基酸残基构成的肽类(hPTH(1-84))。hPTH(1-84)的衍生物，由hPTH(1-84)中氨基酸序号为1-34的34个氨基酸残基构成的hPTH(1-34)，也具有与hPTH(1-84)相同的药理学活性(Tregear等人，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.，1974年，355卷，415页)。hPTH(1-84)和hPTH(1-34)的氨基酸序列分别以序列表中的序列号1和序列号2表示。

降钙素和二磷酸盐或用于治疗骨质疏松的治疗剂均通过抑制骨吸收发挥其治疗效果，而hPTH(1-84)和hPTH(1-34)则刺激骨形成或刺激与骨形成有关的骨代谢。因此人们期望这些肽类能用作新的骨质疏松症治疗剂(Lane等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，1998年，102卷，1627-1633页)。

据报道，当以一定的剂量每周一次向人类皮下给药hPTH(1-34)时，将会升高骨的矿物质含量，而当相同的试剂以类似的给药方法以前者1/5的剂量每天一次连续给药五天时，将同样显著增加骨的矿物质密度(BMD)(Sone等人，矿物质及电解质的代谢(Miner.Electrolvte Metab.)，1995年，21卷，232-235页)。动物实验表明当hPTH以一定的剂量一周一次皮下给药时，引起的骨BMP的增加要小于分割给药时观察到的增加情况(Tawaragi等人，Osteoporosis International，1996年，6卷，增补版1，245页)。该结果显示，当hPTH长时间的以小剂量每日给药时所达到的最大治疗效果要大于短时间内以大剂量给药并且每次剂量之间有长的间隔时所达到的治疗效果。如果长时间内连续给予小剂量的hPTH能保证与短时间内间歇给予大剂量获得同样甚至要更好的效果，这一处方从小剂量的hPTH可避免给药高剂量hPTH时对消化道与心血管器官所产生的副作用的观点来看也是非常有利的。

同样的，通过注射对通常需要长期治疗的骨质疏松症患者进行治疗也是不适宜的，这是因为患者之后必须在医生的管理下接受治疗；患者在治疗过程中会感到或多或少的疼痛；并且为了治疗而拜访医生的办公室也将成为患者的负担。

鉴于此，人们需要一种能允许患者轻松的在家里长期每日使用并且不会对患者产生过多疼痛与负担的鼻腔用药物。

然而，为了使鼻腔用药物能够长时间连续安全地使用，药物必须满足如下条件：药物应能平稳地通过鼻粘膜吸收；对鼻粘膜没有刺激作用；具有优良的使用感，这是因为鼻粘膜对于药物或其添加剂的刺激作用非常敏感。尤其是，对于这样一种由hPTH制备而得并希望能在长时间使用时具有治疗效果的药物，在其准备用于鼻内给药时，优良的使用感是非常重要的。为了制备一种即便是长时间连续使用也能易于接受的鼻腔用药物，以药物或其盐形式存在的活性成分以及适宜添加剂的选择、确定它们的有效浓度、以及优化其组合都是很重要的。鼻腔用药物使用感的影响因素与药物的气味及刺激性有关。由此，制备鼻腔用药物的药物或添加剂的种类及其浓度都是非常受限的。

可购买到的由hPTH制备的产品是一种含有hPTH(1-34)的5-乙酸酯的注射剂，其用作分析甲状旁腺功能活性的诊断剂(其通用名是乙酸特立帕肽，由旭化成工业株式会社提供)。然而，由于气味和刺激性的原因，迄今还没有基于hPTH而制得的并能提供令人满意的使用感的鼻内药物。

日本专利特开昭64-16799描述了如下内容：当将hPTH纯化时，它将会混有纯化过程中所使用的乙酸，不同批号的产品中乙酸的含量差异很大，难以获得均匀乙酸含量的产品，并且还描述了在产品中引入乙酸将会导致产品活性的降低。

此文还公开了一种适用于改进hPTH(1-34)稳定性的方法，其中使用了一种冷冻干燥的以酒石酸为基础的hPTH(1-34)的组合物。然而，酒石酸的酸性很强，含有酒石酸的药物不适宜于鼻内给药。

日本专利特开平2-111公开了一种用于鼻内给药的粉末状组合物，该组合物含有一种为了改进生物活性肽例如hPTH(1-34)的鼻腔吸收而开发的水溶性有机酸。然而，该组合物并不适于长期使用，因为它会直接刺激鼻粘膜，这取决于共存的有机酸的种类和含量。

如上所述，还没有开发出即使长时间使用仍可被接受的、能保证优良的使用感以及良好的稳定性和吸收性的由hPTH制得的鼻内药物。

发明详述

本发明的目的是提供一种含有hPTH且非常稳定的药物成分，当其用作药物组合物的成分时，具有优良的使用感。在另一方面，本发明的目的在于提供一种含有hPTH的用于鼻内给药并能长期使用的药物组合物。

为了实现提供如上所述的用于鼻内给药的药物组合物的目的，本发明发明人进行了大量研究，并发现按传统方法制备的hPTH配制品并不能令人满意，因为它在向鼻粘膜给药时有酸性气味和刺激性，并且这种不便是由于在纯化过程中使用的并作为hPTH盐的组成部分或附着物以很少的量存在的乙酸而引起的。根据这些发现，他们制备了一种药物成分，其中的乙酸含量与先前的产品相比有所降低，评价该成分后惊奇的发现所述成分在制备成药物组合物时非常稳定，并能提供优良的使用感，并能与适宜量的用于改进吸收和稳定性的功能性成分安全地混合，也能与制备药物时常用的载体和赋形剂安全地混合。由此，他们完成了本发明。

更明确地说，本发明涉及一种药物成分，该药物成分含有hPTH和乙酸，所述乙酸的含量保持在相对于hPTH的重量的某一化学当量以下。另一方面，本发明涉及一种用于鼻内给药的药物组合物，该组合物含有hPTH作为其活性成份，并且含有其含量保持在相对于hPTH的重量的某一化学当量以下的乙酸。

附图的简要说明

图1显示的是乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)配制品在40℃下保存6个月后的反相HPLC色谱图。

图2显示的是乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品在40℃下保存6个月后的反相HPLC色谱图。

图3显示的是不同乙酸含量的hPTH(1-34)配制品在80℃下保存15小时后的分解产物(副产物)B、C、D的含量。

图4显示的是不同乙酸含量的hPTH(1-34)配制品在80℃下保存15小时后的hPTH(1-34)的纯度。

图5显示的是乙酸含量为12.3％的hPTH(1-84)配制品在80℃下保存15小时后的反相HPLC色谱图。

图6显示的是不同乙酸含量的hPTH(1-84)配制品在80℃下保存15小时后的分解产物(副产物)的含量。

图7显示的是不同乙酸含量的hPTH(1-84)配制品在80℃下保存15小时后的hPTH(1-84)的纯度。

实施方式详述

根据本发明，hPTH包括那些与骨代谢有关的、对骨形成具有强烈刺激作用的、以及具有增加血清内钙浓度作用的肽类，即，包括84个氨基酸残基的天然型hPTH(1-84)及其衍生物。

例如，该hPTH可包括hPTH(1-84)(Biochemistry 17，5723(1978)；Kimura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第114卷，493页，1983年)、hPTH(1-38)(日本专利公开号57-81448)、hPTH(1-34)(日本专利公开号9-29600；Takai等人，Peptide Chemistry，第187页，1979年)、hPTH(1-34)NH₂(日本专利公开号58-96052)、[Nle^8，18]hPTH(1-34)以及[Nle^8，18，Tyr³⁴]hPTH(1-34)(日本专利公开号55-113753)、[Nle^8，18]hPTH(1-34)NH₂(日本专利公开号61-24598)、[Nle^8，18，Tyr³⁴]hPTH(1-34)NH₂(日本专利公开号60-34996)、hPTH(1-37)(日本专利公表号5-505594)、hPTH(2-84)、hPTH(3-84)、hPTH(4-84)、hPTH(5-84)、hPTH(6-84)、hPTH(7-84)以及hPTH(8-84)(日本专利公表号4-505259)等。这些hPTH物质可以通过上述文献中记载的基于基因工程技术或者化学合成技术的方法制得，或者通过与前者相当的方法制得。

一般说来，当通过基因工程技术或者化学合成技术来纯化一种生理学活性肽时，需要用到柱色谱。然而，由于hPTH是一种碱性肽，如果随意地将其上到色谱柱上，它将被吸附在构成色谱柱的树脂上。为了防止hPTH被吸附并提高其溶解度，要使用一种酸作为洗脱剂。当肽类被用作药物组合物中的材料时，必须将其制成一种冻干的组合物以用作制备药物组合物的起始原料。为了适应这种需要，这种酸必须是可挥发性的，该性质限制了可使用酸的种类。

为了说明情况，让我们假设：例如，将盐酸用于本发明目的。盐酸即使在很低的浓度时仍具有很强的酸性，因此极易导致水解等副反应，并极具腐蚀性。因此，盐酸并不适用于本发明目的。如果为实现本发明目的而使用一种有机酸，其可选自低沸点的三氟乙酸、甲酸和乙酸。然而，为了安全，不希望将三氟乙酸制掺入到药物组合物中去。甲酸的使用也由于其可降低活性而受到限制，并且其不能与hPTH等肽类相容和。

相反的，由于其安全性和化学性质，乙酸最适宜用作药物组合物的材料，并且已经用作碱性肽的最终纯化步骤中不可缺少的酸。例如，基于反相高效液相色谱(反相HPLC)或尺寸排阻柱色谱的纯化方法使用含乙酸的洗脱剂进行操作并获得了良好的结果。在操作过程中，乙酸以足以防止hPTH被吸附到柱子上的浓度加入，因此，从乙酸水溶液中洗脱出来的样品，即目的肽级分，以及由此制备的冻干组合物含有的乙酸浓度要高于仅作为碱性氨基酸残基的盐的组成部分而存在的乙酸的浓度，即，乙酸不仅作为hPTH盐的组成部分存在，还作为粘附的附着物形式存在。

也即，乙酸在以hPTH为基础的药物成分中存在有两种形式：作为hPTH盐的组成部分以及粘附的附着物而存在。由于乙酸是一种挥发性物质，因此很难将冻干组合物中乙酸的含量保持在恒定的水平，因为冻干组合物中乙酸的含量会随着冷冻干燥的条件、冷冻干燥前原溶液中乙酸的浓度或原溶液中共存的hPTH的浓度而变化。

本发明的药物成分包含hPTH和乙酸，其中以hPTH盐的组成部分和附着物的形式存在的乙酸的含量有所降低。由于乙酸含量的降低，该药物成分改善了hPTH的稳定性，并能保证在制成用于鼻内给药的药物组合物并以此形式使用时具有良好的使用感。

在本发明的药物成分中，乙酸含量降低的定义是乙酸的含量低于某一特定的化学当量。

因为hPTH(1-34)含有9个碱性氨基酸残基(包括色氨酸残基)，一个hPTH(1-34)分子可最多与9个一元酸(乙酸及其它酸)分子相结合成盐。然而，它也含有4个酸性的氨基酸残基，其可在同一分子内与碱性残基相结合成盐。因此，就本发明的hPTH(1-34)而言，剩下的5个碱性的氨基酸残基被认为是可用来与乙酸相结合的，从中可得出与一个hPTH(1-34)分子相结合所需的乙酸重量或乙酸对hPTH(1-35)的化学当量。乙酸的含量可根据乙酸和人甲状旁腺激素肽的重量通过式I计算而得，式I：乙酸的重量×100(％)/人甲状旁腺激素肽的重量。乙酸相对于hPTH(1-34)的化学当量约为7.3％(重量％，除非另有说明)。

类似的，由于hPTH(1-84)含有19个碱性的氨基酸残基(包括色氨酸残基)和12个酸性氨基酸残基，在制备本发明hPTH(1-84)配制品时，推测一个分子中有7个过多的碱性氨基酸残基可用于与乙酸相结合，由此可得到与一个hPTH(1-84)相结合而所需的乙酸重量或者乙酸对hPTH(1-84)的化学当量。乙酸的含量可通过式I计算而得，乙酸相对于hPTH(1-84)的化学当量约为4.5％。

即，根据本发明，乙酸的含量低于其化学当量是指，除去作为附着物的量，而仅仅是作为hPTH盐的组成部分的量，其重量百分比要低于其化学当量。

本发明通过控制其乙酸的含量提供了一种含有hPTH的稳定的药物成分，以及一种用于鼻内给药的含此药物成分的药物组合物。

此外，本发明还提供了一种含有hPTH的药物成分，其中控制乙酸的含量使其维持在一定的水平内；以及一种用于鼻内给药的含有此药物成分的药物组合物。

由于肽在溶液中通常是不稳定的，通常使用其冷冻干燥的产品作为药物成分。如果将以含有乙酸或者作为盐的组成部分的挥发性物质的盐存在的肽如hPTH溶解于水或者稀释的乙酸中，并将其冷冻干燥的产品用作制备药物成分的原料，则药物成分中的乙酸含量将不会保持在稳定的水平内，这就提出了难题。本发明可制备所含乙酸含量降低的hPTH水溶液，因此能制备出含有hPTH并同时含有稳定的特定量的乙酸的药物成分。由此，本发明从生产稳定性的角度来看也非常有优势。

对于本发明的药物成分，乙酸含量相对于hPTH的重量维持在化学当量以下。例如，对于基于hPTH(1-34)成分，从稳定性和效用的观点来看，乙酸含量相对于hPTH的重量维持在约7.3％以下，更优选的为约6.0％或以下，特别是约4.0％或以下，或者从生产稳定性来看，更优选为约4.0％或以下，特别是约3.0％或以下。从制备稳定性的观点来看，乙酸的含量控制在过低水平以下是不适宜的，因为虽然该成分能提供优良的稳定性和使用感，但是不易在较高的pH(hPTH的等电点为8.2，pI＝8.2)下溶解。乙酸的含量优选保持在约0.5％或更高，特别是约1.0％或以上。另一方面，对于基于hPTH(1-84)的组分，从稳定性和效用的观点来看，乙酸的含量应保持在约4.5％以下，优选约3.0％或以下，从生产稳定性的观点来看更优选为约0.1％或以上。

本发明的药物成分可通过任一公知的方法或通过任一与前者相当的方法制备。即，将作为hPTH盐的组成部分或作为附着物存在的乙酸的含量降低至一特定水平以下的操作可通过向纯化hPTH的过程中适当的引入一种熟知的方法，如透析、电渗析、离子交换色谱、尺寸排阻柱色谱、反相HPLC等实现，其中hPTH是通过以基因工程为基础的工艺或者以化学合成为基础的工艺获得的。

当通过如透析、电渗析、离子交换色谱等方法将过量的乙酸除去时，调节乙酸的含量至任一所需的水平可通过直接监测hPTH溶液的pH值或溶液中的乙酸浓度而实现，这样就可以获得含有所需浓度乙酸的hPTH溶液。

例如，hPTH水溶液中的乙酸含量可依据溶液中乙酸的含量与溶液pH值的关系进行调节。

透析可按下文操作：将通过基于基因工程或者基于化学合成工艺获得的hPTH的水溶液、或者pH值已调节至5-9的相同水溶液，在加入了碱性溶液如氢氧化钠或氨的水溶液后置于筒状的可通过低分子量组分的透析膜中；溶液中的溶质基于简单的扩散机理进行透析；通过该操作可除去所含的乙酸。例如，透析初始溶液直至透析膜之外的溶液pH达到约6.5为止，得到hPTH(1-34)(乙酸含量2％)溶液。

电渗析可按下文操作：将通过基于基因工程或者基于化学合成工艺获得的hPTH的水溶液、或者pH值已调节至5-9的相同水溶液，在加入了碱性溶液如氢氧化钠或氨的水溶液后，在暴露于电场中的可通过分子量为300或以下组分的两层透析膜之间循环；乙酸离子将向阴极迁移并在阴极蓄积，而游离的hPTH碱性离子将向阳极迁移并在阳极蓄积；低分子量的乙酸离子将穿出薄膜以外，而高分子量的游离的hPTH碱性离子仍在透析系统中循环。因此便有可能通过监测透析溶液的pH值或离子强度并由此方法检查已降低了的乙酸浓度来生产含特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，对初始溶液实施电渗析直至透析溶液的pH值达到约6.5为止，得到hPTH(1-34)溶液(乙酸含量约为2％)。

在离子交换色谱操作中，乙酸通过与碱性离子交换树脂相结合而被其吸附从而被除去。例如，将通过基于基因工程或者基于化学合成的工艺获得的hPTH的水溶液置于由季铵或仲铵树脂制成的碱性离子交换树脂柱上，乙酸通过离子-离子的结合方式与树脂相结合；回收可轻易通过柱子的非吸附性部分可得到已降低了乙酸含量的hPTH溶液。可根据溶液中hPTH的重量调节离子交换树脂的量来获得具有特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，若要获得hPTH(1-34)溶液(乙酸含量约为2％)，需要使用重量大到足够能调节洗脱液的pH值至6.5的树脂。

尺寸排阻柱色谱可按下文操作：将通过基于基因工程或者基于化学合成工艺获得的hPTH的水溶液、或者pH值已调节至5-9的相同水溶液，在加入了碱性溶液如氢氧化钠或氨的水溶液后置于柱子中，用含有有机溶剂如乙腈的水溶液进行洗脱；这样可除去其中的乙酸。通过调节准备上到柱子上的hPTH水溶液的pH值获得特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，若要获得一种hPTH(1-34)溶液(乙酸含量约为2％)，需要将hPTH水溶液调节至pH至约为6.5后再经过柱子，并回收由hPTH(1-34)洗脱液组成的级分。

在反相HPLC操作中，使用通过基于基因工程或者基于化学合成工艺获得的hPTH的水溶液、或者pH值已调节至5-9的相同水溶液，并加入碱性溶液如氢氧化钠或氨的水溶液。将该溶液上到用水预先处理的C18或C4柱子之上，然后例如用水作为洗脱剂洗脱有机盐类。之后，使含有有机溶剂如乙腈的水溶液流过柱子以洗脱吸附在柱子上的hPTH；由此获得降低了乙酸含量的hPTH溶液。

具有特定乙酸含量的hPTH溶液可通过调节准备上到柱子上的hPTH水溶液的pH而获得。也可以通过这样的方法来获得特定乙酸含量的hPTH溶液：制备乙酸含量很小的hPTH溶液，例如该方法所允许的低含量，之后加入所需量的乙酸以获得一种含有特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，将被过量去除了乙酸的hPTH(1-34)溶液用水稀释至10mg/mL；向溶液中加入乙酸至溶液的pH值到达6.5；由此可获得hPTH(1-34)溶液(乙酸含量约为2％)。

将通过上述方法制得的hPTH水溶液用传统方法冷冻干燥以生产本发明的药物成分。

本发明的药物成分可包含水溶性的有机酸，或优选至少一种选自柠檬酸、己二酸和乙醇酸的酸，以改善该成分的粘膜吸收性。药物成分可进一步的含有在经过非肠道途径给药时，尤其是在经鼻给药时，可保证其高稳定性并能保证其优良使用感的有机酸。

因此，本发明的药物成分可用作适于长期使用的鼻内给药的药物组合物的成分。

此外，本发明的用于鼻内给药的药物组合物具有与各种功能性组分以及载体、赋形剂、增粘剂、防腐剂、稳定剂、抗氧剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、润滑剂、着色剂、调味剂、矫味剂、致悬剂、乳化剂、增溶剂、缓冲剂、张力调节剂、表面活性剂、镇痛剂(soothing agent)、含硫还原剂等相容的特性。因此，本发明的药物组合物能很好的经受起加入多种有可能相应的改善吸收和稳定性的功能性组分。

载体或赋形剂包括易溶或微溶于水的物质如糖类、多糖、糊精、纤维素、合成或半合成聚合物、氨基酸、聚氨基酸、蛋白质以及磷脂。

糖类(单糖类、寡糖类)可包括，例如，D-甘露醇、葡萄糖、乳糖、果糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖等，多糖类可包括葡聚糖、普鲁兰、藻酸、透明质酸、果胶酸、植酸、非汀等等。糊精类可包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、糊精、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉等。

纤维素可包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等等。

合成或半合成聚合物可包括聚乙烯醇、羧乙烯聚合物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸钠、聚乳酸等等。

氨基酸类可包括甘氨酸、牛磺酸，聚氨基酸可以包括聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚甘氨酸、聚亮氨酸等等。

蛋白质可包括明胶或其他。此外，也包括壳多糖和脱乙酰壳多糖。

在这些载体和赋形剂中，特别优选的是蔗糖、麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精、糊精、D-甘露醇、肌醇、乳糖、葡聚糖、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、普鲁兰等等。

除此之外，还可以有山梨酸；苯扎氯铵；鲸蜡基氯化吡啶鎓；氯化苄乙氧铵；对羟基苯甲酸酯类如对羟苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等；阿拉伯胶；山梨醇；硬脂酸镁；滑石粉；二氧化硅；微晶纤维素；淀粉；磷酸钙；植物油；羧甲基纤维素；十二烷基硫酸钠；水；乙醇；甘油；和糖浆。

表面活性剂的典型示例列于下文中。其中，单独一种或两种以上的这些表面活性剂的组合可加入到本发明的制剂中。

非离子型表面活性剂可包括脱水山梨醇脂肪酸酯，例如，脱水山梨醇单辛酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯等等；以及脂肪酸甘油酯，例如甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等等；以及脂肪酸聚甘油酯，如单硬脂酸十聚甘油酯(decaglycerylmonstearate)、二硬脂酸十聚甘油酯、单亚油酸十聚甘油酯等等；以及聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇三硬脂酸酯等等；以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四月桂酸酯等等；以及聚氧乙烯脂肪酸甘油酯，如聚氧乙烯单硬脂酸甘油酯；以及聚乙烯脂肪酸甘油酯，如聚氧乙烯二硬脂酸甘油酯；以及聚氧乙烯烷基醚，如聚氧乙烯月桂基醚；以及聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，如聚氧乙烯聚氧丙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等等；以及聚氧乙烯烷基苯基醚，如聚氧乙烯壬基苯基醚；以及聚氧乙烯蓖麻油类，如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯蜂蜡衍生物，例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡；以及聚氧乙烯羊毛脂类衍生物，例如聚氧乙烯羊毛酯；以及HLB值为6至18的聚氧乙烯脂肪酸酰胺，如聚氧乙烯硬脂酰胺。

阴离子表面活性剂可包括烷基硫酸(C₁₀至C₁₈)盐，例如，鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等等；以及聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，其中加入的环氧乙烷的平均摩尔数为2至4且烷基的碳数为10-18，例如聚氧乙烯月桂醚硫酸钠；以及其中的烷基链长为8-18的烷基磺基琥珀酸酯盐，例如月桂基磺基琥珀酸酯钠。

天然表面活性剂可包括卵磷脂；甘油磷脂；鞘脂，如神经鞘脂；以及(C₁₂-C₁₈)脂肪酸蔗糖脂。

含硫还原剂可包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫代乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、含有巯基的硫代链烷酸(C₁-C₇)。

抗氧剂可包括异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、棕榈酸L-抗坏血酸酯、硬脂酸L-抗坏血酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食酸子酸三戊酯、没食酸子酸丙酯、以及螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)钙二钠、焦磷酸钠、偏磷酸钠等等。

对于本发明的药物组合物，hPTH的含量约为0.01-20％，优选约为0.05-10％，需要时可加入有机酸。后者在使用前的浓度约为0.05-99.5％，优选约为0.1-99.0％。在需要时可加入药物制备中常用的载体或赋形剂，或者在使用前以约0.01-99.5％存在。其它各种功能性组分也可在需要时加入，或者在使用前以约0.05-99.5％存在。

本发明的鼻内给药的药物组合物可以通过公知的方法制备。

例如，降低了乙酸含量的基于hPTH的药物成分可用于药物组合物中。或者，向乙酸含量降低的基于hPTH的药物成分中，可加入在医药产品的制备中常用的载体或赋形剂、有机酸及其它各种功能性组分，所得的混合物可用作药用组分。有机酸可代替乙酸加入，或者仅仅是加入。例如，向hPTH药物成分中加入在制备药物中常用的载体或赋形剂、有机酸、各种功能性组分，所得混合物在蒸馏水中一次溶解，将溶液冷冻干燥，由此可得一种均一的组合物。

或者，将hPTH药物成分和药物制备中常用的载体或赋形剂在蒸馏水中一次溶解，之后向溶液中加入有机酸和各种功能性组分，将所得溶液冷冻干燥，由此获得一种均一的组合物。作为另一种改变形式，将hPTH药物成分、有机酸以及各种功能性组分在蒸馏水中一次溶解，将溶液冷冻干燥，按需将适宜量的冻干混合物与药物制备中常用的载体或赋形剂一起溶解，由此获得一种均一的组合物。

本发明的药物成分可以根据所需不同的给药途径制成各种剂型：可制成适于向直肠、鼻、腔、口腔粘膜等施用的形式。本发明的用于鼻内给药的药物组合物优选制成适于鼻内使用的形式。

本发明的鼻内给药的药物组合物的优选实例可制成可在需要时(on-demand)溶解的形式，其中的冻干部分含有本发明的冻干的药物组合物，并附带有用于溶解前者的溶液部分。

用以促进吸收的有机酸如柠檬酸、己二酸或乙醇酸可以hPTH盐的构成物、附着物或添加剂的形式存在。或者，有机酸可溶于溶解用的溶液部分中。

本发明的鼻内给药的药物组合物的给药可通过公知方法实施。例如，用于鼻内给药的药物组合物可喷雾给药：组合物可置于一容器中；喷雾器与一喷嘴相连；将喷嘴尖端伸入鼻腔中；然后喷出药物组合物。

本发明药物组合物的剂量视疾病种类、患者年龄及体重、病情严重程度以及组合物给药途径而定。例如，如果经鼻给药含有hPTH的组合物，可以每日一次或以按比例减少的剂量每日多次给药，持续一段时间。hPTH(1-34)组合物的单次剂量优选在10-5000μg范围内。在治疗期间，应当插入一段称为“洗除期”的时间段，然后可重新开始治疗。

实施例

本发明将通过实施例在下文中详细介绍，然而本发明并不限于这些实施例。

在实施例中使用的测试方法和装置以以下描述为基础，除非另有说明。

1、通过HPLC分析hPTH

使用反相HPLC测定组合物中被研究肽的含量，并检测在组合物中是否有任何分解产物(副产物)，所用装置和条件列于如下。仪器：岛津LC-9A体系柱：YMC Protein-RP(4.6mmΦ×150mm)柱温：40℃洗脱剂：0.1％三氟乙酸中的乙腈浓度在30分钟内从25％线性变化至40％。流速：1mL/分钟检测器：UV(210nm)进样量：50μL

2、乙酸的分析

使用离子交换色谱测定冻干组合物和透析溶液中的乙酸含量，所用条件列于如下。仪器：岛津LC-9A体系。柱：岛津IC-A1(4.6mmΦ×100mm)柱温：40℃洗脱剂：0.84％邻苯二甲酸水溶液与0.58％三羟甲基氨基甲烷水溶液以1∶1混合的混合物流速：1.5mL/分钟检测器：电导检测器进样量：10μL

3、质量分析

在以下所列条件下使用仪器装置测定hPTH、hPTH的分解产物(副产物)及其酶消化物的质量。仪器：Finnigan MAT TSQMS离子源：ESI检测方式：正性喷射电压：4.5kV毛细管温度：250℃流动相：0.2％乙酸和甲醇(1∶1)混合物流速：0.2mL/分钟检测范围：m/z550-850

4、氨基酸测序

hPTH分解产物(副产物)及其酶消化物的氨基酸序列可以通过以下仪器测定。仪器：PerkinElmer477A型测序仪

5、氨基酸组成分析

hPTH及其分解产物(副产物)以及它们的酶消化物的氨基酸组成使用以下仪器测定。仪器：日立L-8500型氨基酸分析仪

6、样品的保存(稳定性测试)

测试样品在以下条件下保存在贮藏器中。仪器：LH-30-14，Nagano Science Co.Ltd。温度设置：1)40±1℃，2)60±1℃，3)80±2℃，

7、冷冻干燥仪器：共和真空技术株式会社RL-903BS小瓶：15mL玻璃小瓶参考实施例1：hPTH(1-34)的制备(1)

通过插入编码含有Kex2蛋白酶或加工酶的切割位点(Lys-Arg)的接头的DNA片段将编码源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的衍生物的DNA片断和编码hPTH(1-34)的DNA片断相连接，由此获得含有编码hPTH(1-34)嵌合蛋白的基因的表达质粒pG117S4HPPH34(日本专利特开平9-29660)，将该表达质粒导入到大肠杆菌M25菌株的细胞中(W3110/ompT：Sugimura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第153卷，1988年，753-759页)。将转型的大肠杆菌M25株的细胞在20L培养池中的含有2％酵母提取物的培育基中培养。

持续培养直至细胞浓度到达OD₆₆₀＝12。将回收的细胞在添加了1mMEDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.2)中通过高压均化器(Manton-Gaullin)碎成碎片，离心，洗涤，得到约625mL含有约100g填充了嵌合蛋白的包函体的混悬液。向250mL含40g包函体的混悬液中加入100mL 1M Tris-HCl(pH8.2)、50mL 5M NaCl、500mL去离子水以及900g尿素，混合物在30℃下搅拌以溶解包函体。

溶液用去离子水稀释至5L，并向其中加入50mL 250mM CaCl₂。然后，向溶液中加入Kex2-660直至其浓度到达20kU/mL或以上；Kex2-660中含有指定的氨基酸编号为1-660的氨基酸残基(日本专利特开平10-229884)，是一种源于Kex2蛋白酶的衍生物。将混合物轻轻搅动2小时，hPTH(1-34)可从嵌合蛋白中切割下来。加入乙酸将反应液调整至pH6.4；之后用去离子水稀释两倍，使嵌合蛋白和β-半乳糖苷酶不与沉淀发生反应；将所得产物离心以获得含6.7g hPTH(1-34)的上清液。向上清液中加入乙酸调节pH至5.0；将溶液置于已用10mM乙酸钠平衡了的阳离子交换树脂(Tosoh公司的SP Toyopearl)上，使hPTH(1-34)吸附于树脂之上；树脂用10mM乙酸钠缓冲液洗涤；使用0.4M的NaCl获得含6.0g hPTH(1-34)的级分。

向该级分中加入乙酸至3v/v％；将该溶液置于预先用3v/v％乙酸平衡了的低压反相ODS(Soken ODS-W，综研化学株式会社)柱上；使用30v/v％含有3v/v％乙酸的乙腈洗脱hPTH(1-34)。减压浓缩含有hPTH(1-34)的洗脱液；产物置于反相HPLC柱(TSKgel10DS120T，尺寸为55mm×600mm，Tosoh公司生产)上；使溶于5v/v％乙酸的乙腈溶液以40mL/分钟的流速流过柱子60分钟，同时乙腈的浓度从16％线性变化至32％，以洗脱hPTH(1-34)。由此得到含有4g hPTH(1-34)的纯化级分。

剩余的60g包函体用相同方法处置，将从中得到的含5g hPTH(1-34)的纯化级分与前者混合；减压除去混合物中的乙腈；所得产物用5v/v％乙酸稀释以使hPTH(1-34)浓度降至10mg/mL。在每一小瓶中放置15mL该溶液；将所有含此溶液的小瓶进行冷冻干燥得到总共9g hPTH(1-34)(150mg×60小瓶)。

ESI-MS：4117.7(理论值为4117.8)、用6N盐酸水解后的氨基酸组成：Asx-4.0(4)；Ser-2.6(3)；Glx-4.9(5)；Gly-1.0(1)；Val-3.0(3)，Met-2.0(2)；Ile-1.0(1)；Leu-5；Phe-1.1(1)；Lys-30(3)；His-3.0(3)；Arg-2.0(2)；Trp没有检测到(1)。参考实施例2：hPTH(1-34)的制备(2)

将与参考实施例1所使用的相似的活的微生物在200L的培养箱中培养。持续培养直至细胞浓度到达OD₆₆₀＝160。将回收的细胞在添加了1mMEDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.2)中通过高压均化器(Manton-Gaullin)碎成碎片，离心，洗涤，获得约10L含有约5kg填充了嵌合蛋白的包函体的混悬液。

向4.0L含有2kg包函体的混悬液中加入1.6L 1M Tris-HCl缓冲液(pH8.2)、0.8L 5M NaCl、15L去离子水以及13kg尿素，所得混合物在30℃下搅拌以使包函体溶解。

溶液用去离子水稀释至80L，并向其中加入0.8mL 250mM CaCl₂。然后，向此溶液中加入Kex2-660(日本专利特开平10-229884)直至其浓度达到10kU/mL或以上。将混合物轻轻搅拌1小时，使hPTH(1-34)从嵌合蛋白中切割下来。加入乙酸将反应溶液调节至pH6.3；然后将其用去离子水稀释两倍，使得嵌合蛋白与β-半乳糖苷酶不与沉淀发生反应；将所得产物加压过滤得到含hPTH(1-34)的上清液。

向上清液中加入乙酸调节pH至5.0；将溶液置于已用10mM乙酸钠缓冲液平衡了的阳离子交换树脂柱上(5L)(Poros 50HS，PerSeptiveBiosystems，美国)，使hPTH(1-34)吸附于柱子上；将柱子用10mM乙酸钠缓冲液洗涤；使用0.4M的NaCl获得含hPTH(1-34)的级分。向该级分中加入乙酸至3v/v％；将该溶液置于预先用3v/v％乙酸平衡了的低压反相ODS(Soken ODS-W，综研化学株式会社)柱(5L)上；使用30v/v％含有3v/v％乙酸的乙腈洗脱hPTH(1-34)。

减压浓缩含有hPTH(1-34)的洗脱液，产物通过0.22μm滤器过滤；将滤液置于反相HPLC柱(TSK ODS 80Ts 20μm，105mmID×550mm，Tosoh公司)；在存在3v/v％乙酸的情况下使用浓度梯度变化的乙腈以洗脱hPTH(1-34)。合并所获得的多份洗脱液，减压蒸馏除去溶液中的乙腈，获得10.4L含有70g hPTH(1-34)的纯度为99.6％的hPTH(1-34)浓缩液。在剩余的3kg包函体中，将2kg用相同的纯化方法操作，得到hPTH(1-34)纯度为99.6％的11.6L hPTH(1-34)浓缩液。参考实施例3：hPTH(1-34)的制备

通过插入编码含有Kex2蛋白酶或加工酶的切割位点(Lys-Arg)的接头的DNA片段将编码源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的衍生物的DNA片断和编码hPTH(1-84)的DNA片断相连接，由此获得含有编码hPTH(1-84)嵌合蛋白的基因的表达质粒pGP#19(日本专利特开平9-29660)，将该表达质粒导入到大肠杆菌M25菌株的细胞中。将转型的大肠杆菌M25株的细胞在3L的培养池中于37℃下培养。持续培养直至培养溶液的浊度(OD₆₆₀)变为OD₆₆₀＝1。之后加入异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)至其浓度为1.0mM。

之后继续培养4小时。通过离心回收细胞；然后将所得细胞混悬于TE(pH值8.0的10mM Tris和1mM EDTA溶液)之中。细胞通过FrenchPress碎成碎片，反复离心并重新混悬，洗涤，获得包函体。将含有此包函体的混悬液溶解于含有8.0M尿素和10mM Tris的溶液(pH8.0)中；离心；所得上清液置于Toyopearl柱(Toso公司)上，使用浓度梯度为0M至0.4M的NaCl洗脱富集的hPTH(1-84)。此溶有富集的包函体的溶液通过限度为10000MW的超滤法进一步浓缩。稀释所得产物获得含有50mM pH6.8的BisTris、1.0mM的CaCl₂以及5mg/mL嵌合蛋白的溶液。加入Kex2-660至其浓度为2kU/mL，并在30℃下反应1小时以从中切割出hPTH(1-84)。

加入乙酸调整反应液pH值为5.0；之后用去离子水稀释两倍；使得其中的嵌合蛋白和β-半乳糖苷酶衍生物不与沉淀发生反应；将产物离心获得含有hPTH(1-84)的上清液。向上清液中加入乙酸至其浓度为3v/v％；将溶液置于预先用3v/v％乙酸平衡了的TSK凝胶ODS 80 Ts(21mm ID×250mm，Tosoh公司)上进行纯化。将含有98％或以上的hPTH(1-84)的级分合并；除去所得溶液中的溶剂；将残余物冷冻干燥后得到500mghPTH(1-84)。该物质的分子量和氨基酸组成如下所示。在这些数据的基础上，可将此物质确定为hPTH(1-84)。

ESI-MS：9424.7(理论值为9424.7)。用6N盐酸水解后的氨基酸组成：Asx-10.1(10)；Thr-1.1(1)；Ser-6.3(7)；Glx-11.0(11)；Pro-2.9(3)；Gly-4.1(4)；Ala-7.0(7)；Val-8.0(8)，Met-1.9(2)；Ile-1.0(1)；Leu-10；Phe-1.0(1)；Lys-8.9(9)；His-3.9(4)；Arg-5.0(5)；Trp没有检测到(1)。

实施例1、除去hPTH(1-34)中的乙酸(1)

(1)将相当于150g参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。该溶液用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的GI微型酸透析仪(microacilyzer)(旭化成工业株式会社)对蒸馏水(100mL)进行透析。连续透析以除去乙酸直至透析液的pH值为5.0。将含有6.8％乙酸的浓缩溶液冷冻干燥后，得到相当于约150mg hPTH(1-34)的干燥物质，其中的乙酸含量为4.8％。

(2)将相当于150g参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。将该溶液作如实施例1中所述的电渗析处理：持续透析以除去乙酸，直至透析液的pH值变为5.5。将含有4.6％乙酸的浓缩溶液冷冻干燥后，得到相当于约150mghPTH(1-34)的干燥物质，其中的乙酸含量为3.8％。

(3)将相当于150g参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。将该溶液作如实施例1中所述的电渗析处理：持续透析以除去乙酸，直至透析液的pH值变为5.9。将含有3.1％乙酸的浓缩溶液冷冻干燥后，得到相当于约150mghPTH(1-34)的干燥物质，其中的乙酸含量为2.9％。

(4)将相当于150g参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。将该溶液作如实施例1中所述的电渗析处理：持续透析以除去乙酸，直至透析液的pH值变为7.0。将含有1.6％乙酸的浓缩溶液冷冻干燥后，得到相当于约150mghPTH(1-34)的干燥物质，其中的乙酸含量为1.6％。

从上述结果可以得出，乙酸的含量降低的同时，冷冻干燥导致的乙酸含量的递减将变少；并且在乙酸含量降低的同时，乙酸含量的分级递减也将减少。因此，hPTH组份中乙酸含量的减少将有利于制备按常规方法难以获得的含有特定乙酸含量的hPTH药物成分。实施例2：除去hPTH(1-34)中的乙酸(2)

向含有相当于约150mg参考实施例2中得到的hPTH(1-34)的配制品的溶液中加入5N NaOH至pH为5.5。将四分之一的溶液上到预先用5v/v％乙腈水溶液平衡了的低压反相ODS(Soken ODS-W(800mL)综研化学株式会社)柱上，使hPTH(1-34)吸附于柱子上。使4L 5v/v％的乙腈水溶液流过柱子以洗脱乙酸钠；之后使50v/v％的乙腈水溶液流过柱子以洗脱hPTH(1-34)。对四份溶液中的每一份重复进行该项操作，将四份溶液中富含hPTH(1-34)的溶液合并得到8.2L几乎不含乙酸而含有122.5ghPTH(1-34)的级分(乙酸含量为hPTH(1-34)的1.13％)。

向此级分中加入蒸馏水得到10mg/mL的hPTH(1-34)溶液，向此溶液中加入2.3g乙酸以使所得溶液含有122.5g的hPTH(1-34)和3％的乙酸；充分搅拌所得混合物。所得溶液分装入小瓶中，每一小瓶含有150mg的hPTH(1-34)；将小瓶中的hPTH(1-34)溶液冷冻干燥，得到的hPTH(1-34)中含有2.1％乙酸。实施例3：除去hPTH(1-34)中的乙酸(3)

(1)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将此含有9.5％乙酸的溶液(pH4.7)置于三个玻璃小瓶之中，每瓶2mL；将其置于内压保持在0.13mBar或以下的FZ-6冷冻干燥机(Laboconco公司)之中；将其进行初步干燥(箱内温度，-20℃，12小时)与二次干燥(箱内温度，25℃，48小时)以完成冷冻干燥操作。二次干燥完成后，向冷冻干燥室内冲入氮气；并将小瓶自动帽封。向每一小瓶中注入2mL蒸馏水，所得溶液通过离子交换HPLC测定其中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

(2)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将溶液(pH4.7)用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析。持续透析以除去乙酸直至透析液的pH值变为5.0(进行透析的溶液中乙酸含量为7.3％)。将除去乙酸的溶液置于三个玻璃小瓶中，每瓶2mL；并将其按照实施例(1)的描述冷冻干燥；通过离子交换HPLC测定每一样品中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

(3)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将溶液(pH4.7)用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析。持续透析以除去乙酸直至透析液的pH值变为5.5(进行透析的溶液中乙酸含量为4.6％)。将除去乙酸的溶液置于三个玻璃小瓶中，每瓶2mL；并将其按照实施例(1)的描述冷冻干燥；通过离子交换HPLC测定每一样品中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

(4)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将溶液(pH4.7)用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析。持续透析以除去乙酸直至透析液的pH值变为6.3(进行透析的溶液中乙酸含量为2.0％)。将除去乙酸的溶液置于三个玻璃小瓶中，每瓶2mL；并将其按照实施例(1)的描述冷冻干燥；通过离子交换HPLC测定每一样品中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

(5)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将溶液(pH4.7)用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析。持续透析以除去乙酸直至透析液的pH值变为7.0(进行透析的溶液中乙酸含量为1.1％)。将除去乙酸的溶液置于三个玻璃小瓶中，每瓶2mL；并将其按照实施例(1)的描述冷冻干燥；通过离子交换HPLC测定每一样品中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

(6)将相当于300mg参考实施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将溶液(pH4.7)用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析。持续透析以除去乙酸直至透析液的pH值变为7.6(进行透析的溶液中乙酸含量为0.5％)。将除去乙酸的溶液置于三个玻璃小瓶中，每瓶2mL；并将其按照实施例(1)的描述冷冻干燥；通过离子交换HPLC测定每一样品中的乙酸含量。所得结果示于表1中。

从表1中可明显看出，随着样品在冷冻干燥前的乙酸含量的降低，冷冻干燥操作中乙酸含量的递减将变小，并且随着样品在冷冻干燥前的乙酸含量的降低，冻干后不同样品或批次间乙酸含量的变化也变小。因此，证明了低乙酸含量的hPTH有利于制备使用常规工艺难以获得的具有特定乙酸含量的药用hPTH成分。

                     表1：冷冻干燥引起的乙酸含量的变化结果

   透析   液pH 冷冻干燥前的 乙酸含量(％) 冷冻干燥后的 乙酸含量(％)  平均值   (％) 冷冻干燥前后乙酸   含量之差(％)   4.7     9.5     6.7     6.5     6.6    6.6      2.9   5.0     7.3     5.5     5.4     5.5    5.5      1.8   5.5     4.6     4.9     4.9     4.8    4.9      -0.3   6.3     2.0     2.1     2.1     2.1    2.1      -0.1   7.0     1.1     0.8     0.8     0.8    0.8      0.3   7.6     0.5     0.4     0.4     0.5    0.4      0.1实施例4：除去hPTH(1-34)中的乙酸(4)

(1)将与参考实施例1中使用的活体微生物相似的微生物在200L培养箱中培养。将细胞破碎成碎片，离心，洗涤；得到4.8kg填充有嵌合蛋白的包函体。将其中的2.4g使用参考实施例2中的Kex2-660消化以获得hPTH(1-34)。产物通过阳离子交换色谱纯化，通过反相ODS色谱脱去盐分；最终通过反相HPLC纯化。然后，按照实施例2的方法，向纯化的级分中加入5N氢氧化钠至pH5.5；所得溶液上到低压反相ODS柱上。使5v/v％的乙腈水溶液流过柱子以除去乙酸钠；然后使50v/v％的乙腈水溶液流过柱子以洗脱hPTH(1-34)。由此得到了5.4L含有58g hPTH(1-34)的溶液(hPTH(1-34)中含有1.2％的乙酸)。向此溶液中加入1.0g乙酸，从而使溶液中含有58g hPTH(1-34)和3％的乙酸；充分搅拌该混合物。溶液分装入小瓶中，每一小瓶中含有150mg hPTH(1-34)；将所有小瓶中的hPTH(1-34)溶液进行冷冻干燥，得到57.8g hPTH(1-34)，乙酸的含量为2.5％(385个小瓶)。

(2)将相当于150mg实施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解于3mL三氟乙醇中；加入30mL乙醚进行沉淀。所得的粉末在含氢氧化钠小球的干燥器内减压干燥24小时，得到130mg的hPTH(1-34)，其中的乙酸含量为2.0％。

(3)向含有相当于150mg实施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入1.53μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为3.6％的hPTH(1-34)配制品。

(4)向含有相当于150mg实施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入3.78μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为5.1％的hPTH(1-34)配制品。

(5)向含有相当于150mg实施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入5.28μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为6.2％的hPTH(1-34)配制品。参考实施例4

(1)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入7.23μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为7.5％的hPTH(1-34)配制品。

(2)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入9.48μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为9.1％的hPTH(1-34)配制品。

(3)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入10.53μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为7.5％的hPTH(1-34)配制品。

(4)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入14.28μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为12.5％的hPTH(1-34)配制品。

(5)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入16μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为13.7％的hPTH(1-34)配制品。

(6)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入22.6μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为18.3％的hPTH(1-34)配制品。

(7)向含有相当于150mg实施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿着小瓶内壁加入100μL乙酸，注意不要使注射器与hPTH(1-34)相接触。将小瓶置于80℃下5分钟将乙酸汽化；将小瓶用涡流混合器搅动，并将小瓶中的hPTH(1-34)制成极细的粉末，由此得到乙酸含量为72.5％的hPTH(1-34)配制品。实施例5：除去hPTH(1-84)中的乙酸

(1)将相当于50mg参考实施例3中制备的乙酸含量为5.4％的hPTH(1-84)的配制品溶解于10mL蒸馏水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。将此溶液用包着电渗析膜AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)在室温下对100mL蒸馏水进行透析。持续透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值变为5.0。将富集的溶液冷冻干燥后，得到相当于约50mg hPTH(1-84)的配制品，其中的乙酸含量为3.9％。

(2)将相当于50mg参考实施例3中制备的乙酸含量为5.4％的hPTH(1-84)的配制品溶解于10mL蒸馏水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。将此溶液按照与实施例(1)相同的方法进行电渗析。持续透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值变为6.0。将富集的溶液冷冻干燥后，得到相当于约50mg hPTH(1-84)的配制品，其中的乙酸含量为2.5％。

(3)将相当于50mg参考实施例3中制备的乙酸含量为5.4％的hPTH(1-84)的配制品溶解于10mL蒸馏水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。将此溶液按照与实施例1相同的方法进行电渗析。持续透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值变为7.0。将富集的溶液冷冻干燥后，得到相当于约50mg hPTH(1-84)的配制品，其中的乙酸含量为1.3％。

(4)将相当于50mg参考实施例3中制备的乙酸含量为5.4％的hPTH(1-84)的配制品溶解于10mL蒸馏水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。将此溶液按照与实施例1相同的方法进行电渗析。持续透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值变为8.0。将富集的溶液冷冻干燥后，得到相当于约50mg hPTH(1-84)的配制品，其中的乙酸含量为0.9％。实施例6：除去hPTH(1-84)中的乙酸(2)

(1)将相当于100mg参考实施例3中制备的含有5.4％乙酸的hPTH(1-84)的配制品溶解于500μL三氟乙醇中；加入20mL乙醚进行沉淀。通过过滤回收沉淀物；产物在含有氢氧化钠小球的干燥器中减压干燥24小时，得到相当于约90mg hPTH(1-84)的干燥物质，乙酸含量为1.6％。

(2)精确称量5.49mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入0.3μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为2.2％的配制品。

(3)精确称量5.58mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入0.6μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为2.7％的配制品。

(4)精确称量4.96mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入1.0μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为3.8％的配制品。参考实施例5

(1)精确称量5.05mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入1.7μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为5.2％的配制品。

(2)精确称量5.59mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入2.5μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为6.4％的配制品。

(3)精确称量5.01mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入3.0μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为8.0％的配制品。

(4)精确称量5.48mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入4.4μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为10.2％的配制品。

(5)精确称量5.47mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入5.5μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为12.3％的配制品。

(6)精确称量5.10mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入10.2μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为22.9％的配制品。

(7)精确称量5.53mg实施例6(1)中的干燥物质，置于5mL小瓶中；用微型注射器加入16.6μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量为33.6％的配制品。实验1：hPTH(1-34)的稳定性(1)

测定除去了以hPTH盐的组成部分或者以附着物形式存在的乙酸后的hPTH配制品的稳定性。

将相当于约150mg参考实施例1中制备的乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)的配制品置于玻璃小瓶中并用盖子封口，在LH-30-14储藏库(Nagano Science Co.)中，在40±1℃下储存6个月。将储存之前的部分小瓶和剩余的储存后的小瓶进行反相HPLC，由此分离出储存前后的分解产物(副产物)并对其进行结构分析。结果示于表2中。

储存后样品的反相HPLC谱图示于图1中。高的峰代表hPTH(1-34)，其后有三个峰(保留时间为13至17分钟)，将其标记为B、C和D。如表2所示，峰B的面积％为3.9％，峰C为6.9％，峰D为3.0％。总计为13.8％，它们是造成产品变质的主要原因。用结构分析法确定各个峰的化合物，结果表明B峰代表[Nε-乙酰基-Lys¹³]-hPTH(1-34)与[Nε-乙酰基-Lys²⁶]-hPTH(1-34)的混合物，C峰代表[Nα-乙酰基-Ser¹]-hPTH(1-34)，D峰代表[Nε-乙酰基-Lys²⁷]-hPTH(1-34)。

然后，按照上述相同的方法研究实施例1(3)中乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品的稳定性。

将相当于150mg乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)的配制品置于玻璃小瓶中并用盖子密封，在LH-30-14储藏库(Nagano Science Co.)中，在40±1℃下储存6个月。将储存之前的部分小瓶和剩余的储存后的小瓶进行反相HPLC，由此分离出储存前后的分解产物(副产物)并对其进行结构分析。结果示于表3中。

储存后样品的反相HPLC谱图示于图2中。从图2中可明显看出，与乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)相比，峰B、C、D的面积都有所下降。峰B、C、D的总面积为0.2％，与乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)中所观察到的对应值相似。储存后的峰面积的总值为3.6％，远低于在乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)中所观察到的对应值(13.8％)。

以上证明了乙酰基体是从hPTH中衍生而来的主要分解产物，因此降低以hPTH(1-34)盐的组成部分形式和附着物形式存在的乙酸的含量将改善hPTH的稳定性。即，降低hPTH配制品中的乙酸含量将有利于制备具有优良稳定性的基于hPTH的药物成分。

                 表2：hPTH(1-34)的稳定性(乙酸含量9.5％，在40℃下储存6个月)

    峰    分解产物(副产物)    储存前  (峰面积％)    储存后  (峰面积％)    X1   [Met(O)⁸-hPTH(1-34) 0.1％或以下    0.1％    X2   [Met(O)¹⁸-hPTH(1-34) 0.1％或以下    0.1％    B^* [Nε-AcLys¹⁸]-hPTH(1-34) [Nε-AcLys²⁶]-hPTH(1-34)   未检出    3.9％    C [Nα-AcSer¹]-hPTH(1-34)    0.2％    6.9％    D [Nε-AcLys²⁷]-hPTH(1-34)   未检出    3.0％   其他    未定性的分解产物    0.1％    4.9％ HPTH(1-34)     -    99.6％    81.1％   总计     -   100.0％    100.0％^*：峰B代表混合物

               表3：hPTH(1-34)的稳定性(乙酸含量2.9％，在40℃下储存6个月)

    峰    分解产物(副产物)   储存前 (峰面积％)   储存后 (峰面积％)    X1  [Met(O)⁸-hPTH(1-34)    0.1％   0.1％    X2  [Met(O)¹⁸-hPTH(1-34)    0.1％   0.1％    B^*  [Nε-AcLys¹⁸]-hPTH(1-34)  [Nε-AcLys²⁶]-hPTH(1-34)   未检出   1.4％    C  [Nα-AcSer¹]-hPTH(1-34)    0.2％   1.0％    D  [Nε-AcLys²⁷]-hPTH(1-34)   未检出   1.2％   其他    未定性的分解产物    0.1％   3.9％ hPTH(1-34)    -   99.5％   92.3％    总计    -   100.0％   100.0％^*：峰B代表混合物

实验2：hPTH(1-34)的稳定性(2)

将实施例4和参考实施例4中得到的各自的乙酸含量如实施例4和参考实施例4所述的hPTH(1-34)配制品在80℃下保存15小时；向各配制品中用注射器加入15mL蒸馏水；并在储存前后对每一配制品的分解产物(副产品)的含量进行测定。所得结果示于表4中。将储存后的每一hPTH(1-34)配制品中的乙酰基体(B、C、D)含量作为其乙酸含量的函数作图，示于图3中。

从表4和图3中可明显看出，伴随着乙酸含量的降低，衍生自乙酰基体的分解产物B、C和D也下降。

将hPTH(1-34)配制品的纯度作为hPTH(1-34)乙酸含量的函数作图，示于图4中。从图4中可明显看出，曲线呈S型，在化学当量(乙酸含量等于约7.3％)处有偏差点，如果将乙酸含量保持在化学当量以下，产品的稳定性将大大提高。

即，hPTH(1-34)配制品中乙酸含量的降低将有利于制备具有优良稳定性的基于hPTH的药物成分。

                       表4：hPTH(1-34)的稳定性(在80℃下储存15个小时)

   分解   产物                        乙酸含量(％)  2.0    2.5    3.6    5.1    6.2    7.5    9.1    9.9    12.5   13.7   18.3^* 72.5^*  X1(％)  ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND  X2(％)  ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND  B(％) 0.15   0.43   0.64   0.91   0.95   1.32   2.19   1.87   1.82   1.93   2.75   5.24  C(％) 0.09   0.28   0.61   1.30   1.63   2.85   4.92   4.80   6.25   6.92   17.8   19.5  D(％) 0.16   0.27   0.40   0.60   0.87   1.04   1.50   1.58   1.28   1.31   1.82   2.8 其他(％) 0.74   0.93   1.10   1.14   1.48   2.22   1.45   2.54   1.91   2.58   12.4   39.9   HPTH(1-34)(％) 98.9   98.1   97.2   96.0   95.1   92.6   89.9   89.2   88.7   87.3   65.2   32.6

ND：未检测到

^*在储存后为液态

X1：[Met(O)⁸-hPTH(1-34)

X2：[Met(O)¹⁸-hPTH(1-34)

B：[Nε-AcLys¹⁸]-hPTH(1-34)与[Nε-AcLys²⁶]-hPTH(1-34)的混合物

C：[Nα-AcSer¹]-hPTH(1-34)

D：[Nε-AcLys²⁷]-hPTH(1-34)试验3：hPTH(1-84)的稳定性

将实施例6和参考实施例5中得到的各自的乙酸含量如实施例6和参考实施例5所述的hPTH(1-84)配制品在80℃下保存15小时；让每一配制品在室温下放置1分钟以使二氯甲烷气化，之后密封。将含有不同乙酸含量的hPTH(1-84)配制品在80℃下储存15小时；用注射器向每一配制品中加入1mL蒸馏水以进行溶解；并在储存前后对每一配制品的分解产物(副产品)的含量进行测定。结果示于表5中。储存后的样品的反相HPLC谱图示于图5中。另外，将储存后的每一hPTH(1-84)配制品中的分解产物(副产物)含量作为其乙酸含量的函数作图，示于图6中。

如图5所示，储存的结果是产生了标记为R1至R6的分解产物(副产S物)。从表5和图6中证实，除了标记为R5之外的其它分解产物均以乙酸含量的函数形式增加。

将hPTH(1-84)配制品储存后的纯度作为乙酸含量的函数作图，示于图7中。hPTH(1-84)配制品的纯度随着其乙酸含量的降低而增加，并当乙酸含量降至化学当量(约4.5％)以下时急速增加。上述结果显示尽管hPTH(1-84)配制品含有某些分解产物其含量不依赖于与其共存的乙酸，但是大多数的分解产物与以hPTH(1-84)盐的组成部分形式与附着物形式存在的乙酸密切相关。即，降低hPTH配制品中的乙酸含量将有利于制备具有优良稳定性的hPTH药物成分。

             表5：hPTH(1-84)的稳定性(在80℃下储存15个小时)

 分解产物                           乙酸含量(％)1.6    2.2    2.7    3.8    5.2    6.4    8.0    10.2   12.3    22.9   33.6 R1(％)ND     2.52   4.38   4.55   5.46   6.60   6.82   8.04   8.8     12.0   12.4 R2(％)0.05   0.24   1.83   1.85   2.67   4.05   3.80   5.03   5.91    11.3   14.8 R3(％)ND     ND     1.82   1.80   2.00   2.31   2.22   2.28   2.45    3.21   9.32 R4(％)0.88   1.83   2.18   2.15   2.39   2.57   2.59   2.86   2.96    3.41   6.61 R5(％)5.68   5.27   4.48   5.11   5.56   4.89   4.62   4.82   5.03    5.89   5.13 R6(％)0.68   1.66   1.66   1.83   2.94   2.83   2.76   3.33   4.70    6.87   12.2 hPTH(1-84)    (％)92.8   88.5   83.6   82.7   79.0   76.7   77.2   73.6   70.1    57.3   39.6

ND：未检测到实验4：感觉测试(1)

对于基于hPTH的药物成分，通过将其施用于鼻腔内来评估其使用感。

将参考实施例1中制备的hPTH(1-34)配制品溶于0.6w/v％柠檬酸水溶液或者溶于水中达到10mg/mL；将所得溶液置于螺口玻璃瓶中；在玻璃瓶上接上一个喷嘴(50μL)(Valois公司)；将50μL溶液喷于鼻腔内；评估由鼻腔喷入而引起的气味和刺激(测试者为12位健康正常的成年男子)。根据测试人的嗅觉将气味分为“有酸性气味”、“有轻微酸性气味”、“检测到轻微气味”、“未检测到气味”四个级别。刺激分为“疼痛刺激”、“强烈刺激”、“微弱刺激”、“极微弱刺激”四个级别。然后，根据等级给气味和刺激打分。使用生理盐水作为对照。所得结果示于表6中。

如表6中明显可见，溶解于柠檬酸水溶液中的hPTH(1-34)配制品以及hPTH(1-34)配制品的水溶液都引起强烈的酸性气味，让测试者感觉不舒服。

然后，制备不同有机酸的水溶液，以判断导致配制品在施用于鼻腔时产生气味和刺激的决定因素。所使用的有机酸包括乙酸、柠檬酸以及酒石酸；草酸、马来酸、邻苯二甲酸、抗坏血酸、己二酸以及乙醇酸。

配制0.1v/v％、0.2v/v％、0.3v/v％和0.6v/v％的乙酸水溶液，以及0.6w/v的柠檬酸、酒石酸、草酸、马来酸、邻苯二甲酸、抗坏血酸、己二酸以及乙醇酸的水溶液。将溶液喷入鼻腔；用上述同样的方法(测试者为四个健康正常的成年男子)评估气味和刺激。所得结果示于表6中。从表6中可明显看出，0.3v/v或更高浓度的乙酸水溶液可产生强烈的酸性气味，并且当乙酸浓度为0.3v/v或更高时，刺激作用也迅速增加。

另一方面，其它有机酸的水溶液不会引起任何可检测到的气味，并且由柠檬酸水溶液和抗坏血酸、己二酸和乙醇酸水溶液引起的鼻腔内的刺激与生理盐水引起的刺激是相同的。

参考实施例1中制得的乙酸含量为9.5％的hPTH(1-34)配制品，其中所含的乙酸含量与此测试中所用的hPTH(1-34)溶液和0.1v/v％乙酸水溶液的对应值大致相同。

从上述结果可以看出，既然0.6w/v％柠檬酸水溶液本身不产生任何可检测到的气味，则溶解于0.6w/v％柠檬酸水溶液中的hPTH配制品所产生的气味应归因于配制品中以hPTH(1-34)盐的组成部分形式或盐的附着物形式存在的乙酸，即便hPTH配制品中所含的乙酸如果以水溶液的形式存在的话，即，与水相结合的话，不会引起任意可检测到的气味。

将实施例1(3)中乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品溶解于0.4w/v柠檬酸水溶液中，浓度为5mg/mL。按照上文同样的方法，将测试溶液施用于鼻腔中，评估其引起的气味和刺激(测试者为12个健康正常的成年男子)。所得结果示于表6中。从表6在可明显看出，配制品中乙酸含量的降低将抑制配制品的气味和刺激，因此，乙酸含量降低了的配制品可以成为在制备实际使用的药物组合物时能保证具有优良使用感的药物成分。

  表6：hPTH(1-34)和各种有机酸的水溶液的刺激性和气味

      hPTH/有机酸   刺激性      气味      hPTH(1-34)^*1     ++    有酸性气味      hPTH(1-34)^*2      +    有酸性气味       生理盐水      +    无气味     乙酸(0.6v/v％水溶液)     +++    有酸性气味     乙酸(0.3v/v％水溶液)     +++    有酸性气味     乙酸(0.2v/v％水溶液)      +  有轻微酸性气味     乙酸(0.1v/v％水溶液)      + 几乎没有任何气味    柠檬酸(0.6w/v％水溶液)      +    无气味    酒石酸(0.6w/v％水溶液)     ++++    无气味     草酸(0.6w/v％水溶液)     ++++    无气味    马来酸(0.6w/v％水溶液)     ++++    无气味  邻苯二甲酸(0.6w/v％水溶液)     +++    无气味   抗坏血酸(0.6w/v％水溶液)      +    无气味    己二酸(0.6w/v％水溶液)      +    无气味    乙醇酸(0.6w/v％水溶液)      +    无气味        hPTH(1-34)^*3      +  轻微酸性气味

++++：疼痛刺激

+++：强烈刺激

++：微弱刺激

+：极微弱刺激

^*1：溶于0.6w/v％柠檬酸水溶液的10mg/mL hPTH(1-34)溶液(乙酸含量为9.5％)

^*2：10mg/mL hPTH(1-34)水溶液(乙酸含量为9.5％)

^*3：溶于0.4w/v柠檬酸水溶液的5mg/mL hPTH(1-34)溶液(乙酸含量为2.9％)实验5：感觉测试(2)

(1)测试液的制备

将相当于300mg参考实施例1中制得的乙酸含量为9.55％的hPTH(1-34)的配制品溶解于30mL蒸馏水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。将该溶液用包裹着AC-130-10(旭化成工业株式会社)的微型酸透析仪(旭化成工业株式会社)进行电渗析以除去乙酸直至透析液的pH值为5.0(乙酸含量为7.3％)。由此得到除去了相当多的乙酸的hPTH(1-34)水溶液。

对部分hPTH(1-34)的水溶液进行相同的电渗析直至达到pH6.0(乙酸含量2.9％)，得到除去了相当多的乙酸的hPTH(1-34)水溶液。对相同的hPTH(1-34)水溶液进行相同处理直至达到pH7.6(乙酸含量0.5％)，得到除去了大量乙酸的hPTH(1-34)水溶液。

(2)感觉测试

向按照此测试实施例(1)中制备的1.5mL每一测试液中加入1.5mL含有270mg精制蔗糖、12mg柠檬酸以及0.3mg苯扎氯铵的水溶液，将该混合物作为用于鼻内使用的测试液。将溶液置于带塞子的螺旋型玻璃小瓶中；在小瓶上接一个喷嘴(50μL)(Valois)用于测试(测试者是5个健康正常的成年男子)。气味分级为“A：几乎未检测到任何乙酸性气味”、“B：检测到微弱的乙酸性气味”、“C：检测到强烈的乙酸性气味”。刺激分级为“A：无刺激感”、“B：有或多或少的刺激感觉”、  “C：强烈的刺激感觉”。然后，按照其分级对气味和刺激进行打分。所得结果示于表7中。

从表7中可明显看出，配制品中乙酸含量的降低将抑制配制品的气味和刺激性，因此，乙酸含量降低了的配制品在用作制备实际使用的药物组合物的药物成分时，能保证具有长期使用的优良使用感。

     表7：不同乙酸含量的hPTH(1-34)药物产品的感觉测试

  测试者  乙酸含量    9.5％  乙酸含量    7.3％  乙酸含量    2.9％  乙酸含量    0.5％气味刺激气味刺激气味刺激气味刺激    ①  B  B  B  B  B  B  A  A    ②  B  B  A  B  A  B  A  B    ③  C  B  B  A  A  A  A  A    ④  C  B  B  A  A  A  A  A    ⑤  A  B  B  A  B  A  A  A气味

A：几乎未检测到任何乙酸性气味

B：检测到微弱的乙酸性气味

C：检测到强烈的乙酸性气味刺激

A：无刺激感

B：有或多或少的刺激感觉

C：强烈的刺激感觉实验6：不同有机酸对于hPTH配制品稳定性的影响

可通过上文所述的电渗析法除去hPTH配制品中的乙酸，也可以将乙酸换成其它的有机酸。

如果hPTH配制品中的乙酸组分被其它的有机酸所代替，则需要评估新引入的有机酸对hPTH配制品的稳定性产生的影响。

在此项测试中使用的有机酸包括公知的用作吸收促进剂的己二酸、柠檬酸和乙醇酸，在实施例4中发现它们能提供良好的使用感。加入有机酸以替代乙酸与hPTH相结合，其加入的浓度要与乙酸的化学当量相等。一个hPTH(1-34)分子含有9个碱性氨基酸残基和4个酸性氨基酸残基，即，一个hPTH(1-34)分子具有5个可与酸结合成盐的正电荷。由此，1mol的hPTH(1-34)(分子量4117.8)可与5/2mol己二酸(分子量146.14)、5/3mol柠檬酸(分子量192.13)、5mol乙醇酸(分子量76.05)结合成盐。向所测试的hPTH配制品中加入己二酸、柠檬酸或乙醇酸，以满足上述各摩尔比。

使用实施例1(3)中获得的乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品来制备5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。

向2mL该溶液(10mg或2.43μmol的hPTH(1-34))中加入888μg己二酸(2.43×5/2μmol)、778μg柠檬酸(2.43×5/3μmol)或924μg乙醇酸(2.43×5μmol)。将每份溶液用蒸馏水调节至所得溶液的肽含量为1mg/mL。将溶液冻干，得到含有10mg hPTH(1-34)的冻干样品。按照此方法制备的样品，其中的一些进行反相HPLC处理，得到hPTH储存前的纯度；其余的则在60℃下储存3周；然后将其进行同样的反相HPLC处理，得到储存后的hPTH纯度；比较储存前和储存后的纯度值以评估hPTH配制品的稳定性。用实施例1(3)中乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品作为对照。所得结果示于表8中。

乙酸含量为2.9％的hPTH配制品的储存后的纯度为92.7％，在储存前加入了己二酸、柠檬酸和乙醇酸的相同配制品在储存后的纯度值分别为92.0、93.9和90.3％。结果表明加入了己二酸、柠檬酸和乙醇酸的hPTH药物成分非常稳定，并可提供与以hPTH盐的组成部分形式和附着物形式存在的乙酸的含量降低了的hPTH药物成分相同的优良使用感。

同时还表明用某种有机酸替代存在于hPTH配制品中以盐的组成部分或附着物形式存在的乙酸，可作为与乙酸含量降低了的hPTH配制品相似的药物成分使用。其还进一步的表明，如果将该高稳定性且能保证优良使用感的成分制成药物组合物，其还可与为改善成分的吸收而加入的有机酸相容。

     表8：各种有机酸对hPTH(在60℃下储存3周)稳定性的影响

         乙酸  己二酸  柠檬酸  乙醇酸hPTH(1-34)的酸含量^*  9.5％  2.9％   8.8％   7.7％   9.2％储存前纯度(％)储存后纯度(％)  99.8％  73.2％  99.8％  92.7％   100.0％   92.0％   100.0％   93.9％   100.0％   90.3％

^*：酸含量＝酸重量×100(％)/hPTH肽重量实验7：鼻粘膜吸收测试

当将配制品设计成鼻内给药的药物组合物时，制剂通过鼻粘膜的吸收就变成了一个重要的因素。鉴于此，需要测试配制品通过鼻粘膜的吸收。在测试实施例4中证实具有优良使用感的柠檬酸和抗坏血酸在加入到hPTH配制品中后对hPTH的鼻腔吸收的影响根据hPTH血浆浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)和hPTH的生物利用度进行评估。

将实施例1(3)中制得的乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品溶解于0.3和0.6w/v％的抗坏血酸水溶液以及0.2、0.3、0.4、和0.6w/v％的柠檬酸水溶液中，得到5mg/mL的hPTH溶液。相似的，将实施例5(4)中制得的乙酸含量为0.9％的hPTH(1-34)配制品溶解于0.6w/v％的柠檬酸水溶液中，得到10mg/mL的肽溶液。作为对照，将实施例1(3)中制得的乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品和实施例5(4)中制得的乙酸含量为0.9％的hPTH(1-34)配制品溶解于生理盐水中。

此外，将实施例1(3)中制得的乙酸含量为2.9％的hPTH(1-34)配制品溶解于0.3 w/v％或0.6w/v％的柠檬酸水溶液中，向此溶液中加入公知作为蛋白酶抑制剂的卡莫司他甲磺酸盐至浓度为0.3w/v％；所得溶液用于测试。

将七至九周大的Sprague-Dawley雄性大鼠(Crj：CD，Charles RiverJapan，Inc.)置于温度为22±5℃、相对湿度为30-70％、每12小时昼夜交替的金属厢中，可自由取食食物小丸和自来水。在测试前24小时开始禁食(每组5只大鼠)。

鼻内给药时，将戊巴比妥麻醉下的大鼠通过股动脉插入套管；将5μL测试溶液或者10μL含有蔗糖的苯扎氯铵通过Pipetman(TM)导入到鼻腔中。血样通过套管采集到含有抗凝剂和蛋白酶抑制剂的试管中；将血液离心后得到血浆。血浆中的hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的浓度使用抗PTH(1-34)抗体(Chemicon International Inc.)通过RIA法测定。

皮下给药时，对大鼠背部皮下注射1mL/kg测试溶液，血浆中的hPTH浓度按照鼻内给药相同的方法进行测定。

hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的生物利用度通过计算皮下给药3小时(hPTH(1-34))后或6小时(hPTH(1-84))后的血浆浓度分别与相应的血浆浓度-时间曲线的AUC的比值而得到。结果示于表9中。

尽管hPTH(1-34)单独皮下给药时的生物利用度是1.4％，但当其作为0.3至0.6w/v％抗坏血酸或0.2至0.6w/v％柠檬酸溶液的溶解物给药时，其生物利用度将升高至5至10％、或12至19％。

当作为0.6w/v％柠檬酸水溶液的溶解物使用时，hPTH(1-84)的生物利用度约为30％、

此外，当hPTH(1-34)溶于加入了卡莫司他甲磺酸盐或蛋白酶抑制剂的溶液中使用时，其生物利用度为27至31％。

以上表明加入少量有机酸能显著的改善hPTH配制品通过鼻粘膜的吸收。同样，加入吸收促进剂也能进一步改善hPTH配制品的鼻内吸收。作为结论，含有hPTH药物成分的hPTH药物组合物是适于鼻内使用的，因为在有意降低了其中以盐的组成部分和附着物形式存在的乙酸的含量后，药物成分具有高的稳定性，并能在鼻内给药时保证优良的使用感。

表9：hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的经鼻吸收(大鼠)

      处方    剂量 给药 途径     AUC   (pg×hr/mL)生物利用度 (％皮下)hPTH(1-34)(盐水)  25μg/kg 皮下  1356.5±503.4   (100)hPTH(1-34)(盐水)0.3w/v％抗坏血酸  125μg/kg  125μg/kg 经鼻 经鼻  93.7±61.3  357.4±308.3    1.4    5.2 0.6w/v％抗坏血酸 125μg/kg经鼻  687.3±281.9    9.9 0.2w/v％柠檬酸 125μg/kg经鼻  838.4±407.9    121.2 0.3w/v％柠檬酸 125μg/kg经鼻  1208.9±618.6    17.6 0.4w/v％柠檬酸 0.6w/v％柠檬酸 0.3w/v％柠檬酸 +0.3w/v％卡莫司他 0.6w/v％柠檬酸 +0.3w/v％卡莫司他 125μg/kg 125μg/kg 125μg/kg 125μg/kg经鼻经鼻经鼻经鼻  1285.2±572.4  1254.9±526.1  2118.0±860.4  1829.4±1072.7    18.7    18.3    30.8    27.0 hPTH(1-84)(盐水) hPTH(1-84)0.6w/v％抗坏 血酸 285μg/kg 285μg/kg皮下经鼻  46833.3±15667  14166.7±6833    (100)     30.2制剂实施例1

将40.5g精制蔗糖(日本药典)溶于124.2g纯净水(日本药典)中得到150mL 27w/v％的精制蔗糖水溶液。另一方面，将相当于1.5g实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)(10个小瓶)的配制品溶解于约75mL纯净水(日本药典)中作为药物成分。通过反相HPLC测得hPTH(1-34)的浓度为20.4mg/mL。向72.0mL溶液中加入25.9mL纯净水调整浓度至15mg/mL。由此制得97mL 15mg/mL的hPTH(1-34)溶液，所得溶液与先前准备的48.5mL 27w/v％的精制蔗糖水溶液相混合，得到约145mLhPTH(1-34)水溶液，其中精制蔗糖的浓度为9w/v％，hPTH(1-34)的浓度为10mg/mL。向47个小瓶中各注入3mL溶液，并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，得到每瓶含有270mg精制蔗糖和30mghPTH(1-34)的稳定的药物组合物。制剂实施例2

将40.5g精制蔗糖(日本药典)溶于124.2g纯净水(日本药典)中得到150mL 27w/v％的精制蔗糖水溶液。另一方面，作为药物成分，将相当于750mg实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)(5个小瓶)的配制品溶解于约146mL纯净水(日本药典)中，得到hPTH(1-34)浓度为5.1 mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。然后，将54mL纯净水(日本药典)加入到水溶液中并充分搅拌以调节hPTH(1-34)的浓度至3.8mg/mL(200mL)。将所得的200mL hPTH(1-34)浓度为3.8mg/mL的溶液与100mL预先配制的27w/v％精制蔗糖水溶液相混合，得到300mL hPTH(1-34)水溶液，其中的蔗糖浓度为9w/v％，hPTH(1-34)的浓度为2.5mg/mL。向90个小瓶中各注入3mL溶液，并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，得到每瓶含有270mg精制蔗糖和7.5mg hPTH(1-34)的稳定的药物组合物。制剂实施例3

将22.5g甘露醇(日本药典)溶于124.2g纯净水(日本药典)中得到150mL15％的甘露醇水溶液。另一方面，将相当于1.5g实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)(10个小瓶)的配制品溶于约75mL纯净水(日本药典)中作为药物成分。通过反相HPLC测得溶液中hPTH(1-34)的浓度为20.4mg/mL。向72.0mL溶液中加入25.9mL纯净水调整浓度至15mg/mL。由此制得97mL 15mg/mL的hPTH(1-34)溶液，所得溶液与先前准备的48.5mL 15％的甘露醇水溶液相混合，得到145mL hPTH(1-34)水溶液，其中甘露醇的浓度为5％，hPTH(1-34)的浓度为10mg/mL。向47个小瓶中各注入3mL溶液，并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，得到每瓶含有150mg甘露醇和30mg hPTH(1-34)的稳定的药物组合物。制剂实施例4

作为药物成分，称取805mg(粉末重量)实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)配制品的冻干产品并将其溶于360mL纯净水(日本药典)中，得到经反相HPLC测定hPTH(1-34)浓度为2mg/mL的水溶液。另一方面，称取1g甘露醇(日本药典)溶于50mL纯净水(日本药典)中制得甘露醇水溶液。

将预先制备的50mL甘露醇水溶液与50mL hPTH(1-34)水溶液(2mg/mL)充分混合。向每一小瓶中分装1mL溶液并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，得到每瓶含有1mg hPTH(1-34)和10mg甘露醇的稳定的药物组合物。制剂实施例5

作为药物成分，称取805mg(粉末重量)实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)配制品的冻干产品并将其溶于360mL纯净水(日本药典)中，得到经反相HPLC测定hPTH(1-34)浓度为2mg/mL的水溶液。另一方面，称取5g甘露醇(日本药典)溶于50mL纯净水(日本药典)中制得甘露醇水溶液。

将预先制备的50mL甘露醇水溶液与50mL hPTH(1-34)水溶液(2mg/mL)充分混合。向每一小瓶中分装1mL溶液并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，得到每瓶含有1mg hPTH(1-34)和50mg甘露醇的稳定的药物组合物。制剂实施例6

作为药物成分，称取约11mg(粉末重量)实施例2中制得的乙酸含量为2.1％的hPTH(1-34)配制品的冻干产品，向其中加入注射用水(WFI)(日本药典)调整体积至500mL，制得经反相HPLC测定为20μg/mL的hPTH(1-34)水溶液(溶液A)。将5g精制蔗糖(日本药典)和100mg苯索氯铵溶于注射用水(日本药典)中并将体积调节至100mL(溶液B)。将溶液A和溶液B各30mL相混合。向每一小瓶中分装1mL所得到的溶液并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，制得每瓶含有10μg hPTH(1-34)、25mg精制蔗糖和0.5mg苯索氯铵的稳定的药物组合物。制剂实施例7

作为药物成分，称取约50mg(粉末重量)实施例5(2)中制得的乙酸含量为2.5％的hPTH(1-84)配制品的冻干产品，向其中加入注射溶剂(日本药典)，得到经反相HPLC测定为2mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(25mL)。

另一方面，向2g精制蔗糖(日本药典)中加入注射用水(日本药典)得到100mL精制蔗糖水溶液。将20mL hPTH(1-84)水溶液(2mg/mL)与20mL预先制备的精制蔗糖溶液(2w/v％)混合。所得溶液加入35个小瓶中，每瓶1mL，并在FZ-6型冷冻干燥机(Labconco公司)中冷冻干燥，制得每瓶含有1mg hPTH(1-84)和10mg精制蔗糖的稳定的药物组合物。制剂实施例8

用于前述制剂实施例1-7中得到的药物组合物的用时溶解型制剂中所附带的溶剂的制备如下。

称取0.35g苯扎氯铵(日本药典)和21.0g柠檬酸(日本药典)并溶解于3500mL纯净水中。将所得溶液以3mL的量分装到各聚丙烯瓶中制得附带的溶剂。制剂实施例9

用于前述制剂实施例1-7中得到的药物组合物的用时溶解型制剂中所附带的溶剂的制备如下。

称取0.70g苯索氯铵(日本药典)和14.0g柠檬酸(日本药典)并溶解于3500mL纯净水中。将所得溶液以3mL的量分装到聚丙烯瓶中制得附带的溶剂。制剂实施例10

用于前述制剂实施例1-7中得到的药物组合物的用时溶解型制剂中所附带的溶剂的制备如下。

称取0.35g苯索氯铵(日本药典)和21.0g己二酸(日本药典)并溶解于3500mL纯净水中。将所得溶液以3mL的量分装到聚丙烯瓶中制得附带的溶剂。制剂实施例11

用于前述制剂实施例1-7中得到的药物组合物的用时溶解型制剂中所附带的溶剂的制备如下。

称取0.70g鲸蜡基氯化吡啶鎓(日本药典)和14.0g己二酸(日本药典)并溶解于3500mL纯净水中。将所得溶液以3mL的量分装到聚丙烯瓶中制得附带的溶剂。制剂实施例12

作为药物成分，将相当于900mg实施例4(1)中制得的乙酸含量为2.5％的hPTH(1-34)(6个小瓶)的配制品溶于18mL注射用水(日本药典)(50mg/mL)。另一方面，将12g柠檬酸(日本药典)溶于注射溶剂(日本药典)得到1000mL溶液(1.2w/v％柠檬酸水溶液)。使用所得的溶液按照以下方法制备液体药物。1.pH值为3，hPTH(1-34)为5mg/mL，柠檬酸为0.6w/v％的溶液的制备

将6mL 1.2w/v％的柠檬酸水溶液与1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，并加入95μL 1N NaOH将所得溶液的pH值调整为3。然后，向溶液中加入注射用水使溶液体积达到12mL。将所得的溶液通过0.22μm的过滤器过滤得到本标题的药物组合物。0.pH值为3.5，hPTH(1-34)为5mg/mL，柠檬酸为0.6w/v％的溶液的制备

将6mL 1.2w/v％的柠檬酸水溶液与1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，并加入210μL 1N NaOH将所得溶液的pH值调整为3.5。然后，向溶液中加入注射用水使溶液体积达到12mL。将所得的溶液通过0.22μm的过滤器过滤得到本标题的药物组合物。1.pH值为4，hPTH(1-34)为5mg/mL，柠檬酸为0.6w/v％的溶液的制备

将6mL 1.2w/v％的柠檬酸水溶液与1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，并加入350μL 1N NaOH将所得溶液的pH值调整为4.0。然后，向溶液中加入注射用水使溶液体积达到12mL。将所得的溶液通过0.22μm的过滤器过滤得到本标题的药物组合物。2.pH值为4.5，hPTH(1-34)为1mg/mL，柠檬酸为0.4w/v％的溶液的制备

将4mL 1.2w/v％的柠檬酸水溶液、0.24mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液以及约5mL纯净水混合，并加入335μL 1N NaOH将所得溶液的pH值调整为4.5。然后，向溶液中加入注射用水使溶液体积达到12mL。将所得的溶液通过0.22μm的过滤器过滤得到本标题的药物组合物。

工业实用性

本发明提供了一种降低了其乙酸含量的药物成分，其具有很高的稳定性，在用作药物组合物的成分时能保证良好的使用感。

本发明的药物成分可以承受加入适量的在药物生产中常用的各种功能性组分以及载体或赋形剂，可以掺入到各种剂型的药物组合物之中，也可以将其本身制成各种剂型。

根据本发明，提供了一种适于长期使用的用于鼻内给药的药物组合物。

序列表

                         序列表<110>三得利株式会社<120>含有人甲状旁腺激素的药物成分及含有该成分的用于鼻内给药的药物

 组合物<130><160><210>1<211>84<212>PRT<213>人<223>人甲状旁腺激素的氨基酸序列(hPTH(1-84))<400>1Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1                5                  10                  15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

         20                  25                  30Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser

     35                  40                  45Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu

 50                  55                  60Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65                  70                  75                  80Ala Lys Ser Gln<210>2<211>34<212>PRT<213>人<223>C-末端截短的人甲状旁腺激素的氨基酸序列(hPTH(1-34))<400>2Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1                5                  10                  15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

         20                  25                  30Asn Phe