11,11'－二去氧沃替西林的医学用途

摘要

本发明提供11，11’－二去氧沃替西林(11，11’－dideoxyverticillin A)的医学新用途，经药理试验，它具有对新生血管生成的抑制作用和抗肿瘤作用，可在抗实体瘤药物中应用或新生血管生成抑制剂中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及11，11’-二去氧沃替西林的医学用途，更具体地说是它的新生血管生成抑制作用及抗肿瘤作用

背景技术

11，11’-二去氧沃替西林(11，11’-dideoxyverticillin A)为一已知化合物，分子式C₃₀H₂₈N₆O₄S₄。结构式为：

  11，11′-dideoxyverticillin A

该化合物原为从海洋青霉属真菌中获得，文献报道该化合物具有细胞毒作用，体外对HCT-116人结肠癌瘤株的IC₅₀为30ng/ml[B.W.Son，P.R.Jensen，C.A.Kauffman，W.Fenical，New Cytotoxic Epidithiodioxopiperazines Related toVerticillin A from a Marine Isolate of the Fungus Penicillium，Natural ProductLetters，1999，13(3)，213-222]。

中药竹黄在我国南方民间用来治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、坐骨神经痛等。我们从该中药中分得化合物11，11’-二去氧沃替西林，结构经单晶X-衍射及核磁共振、质谱等方法鉴定，波谱数据与文献报道完全一致。

发明内容

我们通过对该化合物进行药理活性筛选，发现该化合物对新生血管生成有明显抑制作用，对小鼠S-180肉瘤及裸鼠A-549人肺癌的生长也有明显抑制作用。

本发明的目的是利用我国中药独特资源获得11，11’-二去氧沃替西林，寻找该化合物新的医学用途，特别是抗肿瘤及新生血管生成抑制作用。

本发明通过如下的药理试验证明化合物11，11’-二去氧沃替西林具有抗肿瘤及新生血管生成抑制作用。

药理药效学实验：

一.11，11’-沃替西林对新生血管生成的抑制作用实验

材料：

DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；Matrigel购自Becton Dichinson，USA；其它试剂为国产分析纯。

细胞培养  人微血管内皮细胞株(human microvascular endothelial cell line，HMEC-1)；NIH-3T3购自American Type Culture Collection；细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2孵箱中培养。待细胞处于对数生长期时进行实验。

1.内皮细胞增殖实验

HMEC-1细胞2×103cells/100□l/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的11，11’-二去氧沃替西林，每个浓度三个复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。加药在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷三氯醋酸(TCA)固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的磺酰罗丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine，SRB，Sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液(购自Sigma公司)，酶标仪540nm波长下读数。

2.内皮细胞管腔形成抑制实验

Matrigel胶在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使胶凝固。每孔加入HMEC-1细胞悬液5*103cells/100μl/孔。同时分别加入不同浓度11，11’-二去氧沃替西林，使其最终浓度为10μM，2μM，0.4μM，0.08μM，0.016μM。在37℃、5％CO2、95％湿度下培养24小时。在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(^*100)，每个照片的管腔总长度用图形处理软件Adobe Photoshop 6.0(购自Adobe公司)测量，并计算抑制率。

3.内皮细胞迁移抑制实验

1∶3倍稀释的Matrigel胶20□l铺于Transwell膜(8□m孔径Boyden Chambertranswell，Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥。将含不同药物浓度(10μM，2μM，0.4μM，0.08μM，0.016μM)的HMEC-1细胞悬液2*104cells/100□l/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室含相同浓度药物的DMEM培养基。37℃、5％CO2、95％湿度下培养48小时。用棉签小心去除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染色。在相差显微镜(Olympus Japan)下观察并拍照(^*100)，随机选5个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率。

结果：

1. 11，11’-二去氧沃替西林能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖，其IC50为0.025□M，作用效果成明显量效关系。

2. 11，11’-二去氧沃替西林在0.016□M仍然明显抑制(＞60％)内皮细胞的管腔形成，作用效果成明显量效关系。

3. 11，11’-二去氧沃替西林在0.016□M仍然明显抑制(＞60％)内皮细胞的迁移。作用效果成明显量效关系。

二.11，11’-二去氧沃替西林体外对多株肿瘤细胞增殖的抑制作用实验

材料和方法：

DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；磺酰罗单明B(sulforodamine B，SRB)，四氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；三氯醋酸(TCA)、醋酸(HAc)和Tris base unbuffer均为国产分析纯。

细胞株：

P-388小鼠淋巴瘤^*  HL-60人白血病^*

MOL-4人白血病^*  A-549人肺癌

SGC-7901人胃癌  MKN-28人胃癌

BEL-7402人肝癌  MCF-7人乳腺癌

1.SRB法    根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(购自Sigma公司)4mg/ml溶液100□l/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150□l/孔的Tris溶液(购自Sigma公司)，酶标仪520nm波长下测定OD值。

2.MTT法    按不同肿瘤生长速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90□l/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后加入药液10□l/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。另设无细胞调零孔、如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(购自Sigma公司)液5mg/ml用生理盐水配制20□l/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/lHCl)50□l/孔，于CO2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。

3.按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC50值采用Logit法计算。肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％

结果：

11，11’-二去氧沃替西林能明显抑制8株不同来源肿瘤细胞的增殖，且作用效果成明显的量效关系。

                                   IC₅₀(nM)细胞株

       P-388  MOL-4  HL-60  A-549  MKN-28  SGC-7901  BEL-7402  MCF-7浓度(μM)  4.30   20.2   13.9   3.37   25.7    13.1      34.1      39.6三.11，11’-二去氧沃替西林的休内抗肿瘤作用

1.动物瘤实验方法

将处于生长旺盛期的小鼠瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约4.5-5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔注射给药。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤生长抑制率并进行T检验。

2.裸小鼠实验方法

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-300mm3后(剔除移植瘤过大、过小以及未生长的裸小鼠)将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周2次，每次测量同时还称鼠重。实验组及阳性对照组每周腹腔给药3次，共给药3周，阴性对照组同时给等量生理盐水。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下： $>>T>/>C>>(>\%>)>>=>{{}_{}}_{}$>

TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。

结果：

11，11’-二去氧沃替西林在1mg/kg剂量时对小鼠S180肉瘤和小鼠肝癌H22有明显的生长抑制作用，抑制率分别为59％和60.7％，对人肺腺癌A-549的最好T/C为50.4％。

本发明的优点是：(1)对中药竹黄的利用开辟了新的用途；(2)对肿瘤的治疗有望提供新的药物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1

11，11’-二去氧沃替西林对小鼠S-180肉瘤的实验治疗作用

实验材料：(1).动物：KM小鼠18-22g，雌性。由中科院上海动物中心提供。

                    合格证编号：中科第005号。

          (2).瘤种：S-180肉瘤由中科院上海药物研究所提供。

          (3).测试物：11，11’-二去氧沃替西林。

给药方法及疗程：选用18-22克雌性KM小鼠及生长良好的7-11天的S-180瘤种，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约1-2.5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔给药七天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。实验结果：组别              剂量       给药      动物数         体重        瘤重      抑瘤率    P值

                         途径   开始     最后   开始    最后    x±SD       ％NS                ----               20       20    20.3    28.1  1.85±0.52   -        -11，11’-二去氧

              0.5mg/kg   i.p     10       10    20.1    20.4  0.51±0.23   72.4     ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧

              0.75mg/kg  i.p     10       10    20.2    21.6  0.69±0.24   62.7     ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧

              1mg/kg     i.p     10       9     20.1    25.0  1.08±0.44   41.6     ＜0.01沃替西林5-氟尿嘧啶        40mg/kg    i.p     10       10    20.3    22.0  0.55±0.34   70.3     ＜0.0111，11’-二去氧沃替西林0.75mg/kg给药5次，1mg/kg给药2次。

实施例2：11，11’-二去氧沃替西林对小鼠肝癌H22的实验治疗作用实验材料：(1).动物：KM小鼠18-22g，雌性。由中科院上海动物中心提供。

          合格证编号：中科第005号

      (2).瘤种：H22由中科院上海药物研究所提供。

      (3).测试物：11，11’-二去氧沃替西林。

给药方法及疗程：选用18-22克雌性KM小鼠及生长良好的7-11天的H22瘤种，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约1-2.5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔给药七天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。实验结果：组别              剂量        给药       动物数          体重        瘤重      抑瘤率    P值

                          途径     开始    最后   开始   最后      x±SD       ％NS                ----                  20      20    19.9   27.8    1.97±0.61   -        -11，11’-二去氧

              0.5mg/kg     i.p      10      10    20.0   19.8    0.44±0.23   77.7     ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧

              0.75mg/kg    i.p      10      10    19.7   22.1    0.64±0.33   67.5     ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧

              1mg/kg       i.p      10      10    19.9   26.8    1.11±0.29   43.7     ＜0.01沃替西林5-氟尿嘧啶        40mg/kg      i.p      10      10    19.8   20.7    0.53±0.27   73.1     ＜0.0111，11’-二去氧沃替西林0.75mg/kg给药5次，1mg/kg给药2次。