超声造影剂和兼药物、基因靶向载体的超声造影剂

摘要

本发明公开了一种超声造影剂和一种兼药物、基因载体靶向超声造影剂，含气微泡，直径0.6微米－10微米，气微泡壳是由脂质、高分子可降解多聚体、表面活性剂组成，表面带正电荷。气微泡中空，含空气、氮气等非卤碳气体。用乳液共聚合方法，将丙烯酸及其衍生物进行乳液共聚。在表面活性剂参与下，调节气相与液相之表面张力，使气相进入聚合物乳微泡中。兼药物、基因载体靶向超声造影剂的气微泡是在上述超声造影剂的气微泡基础上含有多聚赖氨酸或多聚氨基酸，带有活性官能基团，基团与一些基因质粒的基团耦合使含气微泡的羧基与GP IIb/IIIa等血栓或抗血栓或溶栓物质的抗体藕联，制成携带IIb/IIIa等抗体的气微泡；气微泡包裹的抗肿瘤药物，在超声作用下破裂，药物在肿瘤局部释放。

说明书

一、所属领域

本发明属于临床心血管内科学，涉及肝脏、肾脏、脾脏、前列腺及乳腺等实质脏器肿瘤医学，化学和超声医学应用的超声造影剂。特别涉及超声造影剂和兼药物、基因靶向载体的超声造影剂。

二、背景技术1.超声造影剂研制现状：

声学造影剂是由类似红细胞大小的含气微泡组成，注入静脉后能到达红细胞所能到达的部位，在超声作用下，具有线性散射和非线性散射特性，因而能使血流丰富的实质器官如心肌、肝脏等在二维超声仪检测时产生较强对比显影。与X线等其它造影技术比较，具有无创、适时、床旁和价廉等优点。超声造影剂研制成功，对于心脑血管病和肿瘤的无创诊断具有广阔的应用前景和巨大的经济效益。

国外超声造影剂研制现状：Albunex和Optison均系声振白蛋白，美国FDA批准临床应用。Levovist在欧洲批准临床应用。但是心肌显影效果都欠佳，属于第1和第2代产品。近年正在研制脂质、高分子多聚体成膜材料、有弹性外壳的第3代超声造影剂，心肌显影良好，也能被肝脏网状内皮系统特异性吞噬而肝脏显影，实验和临床期研究已显示了良好的应用前景。

国内造影剂的研制状况：国内市场上只有德国产Levovist，是唯一被我国卫生部批准的临床应用的超声造影剂，以半乳糖为原料，心肌显影欠佳，价格昂贵，不易推广使用。北京阜外医院的谢峰曾做研究，目前仍未见相关产品。第一军医大学南方医院超声科正研制声振白蛋白氟碳气体超声造影剂，属于第2代产品，目前仍未投入市场使用。至今，无国产心脏超声造影剂临床应用的报告。因此，发展稳定、可靠、价廉的国产超声造影剂，是我国医学和相关技术领域面临的迫切任务。2.兼基因或药物靶向载体的超声造影剂研制现状(1)基因载体研制现状

随着人类基因图的组成和致病基因的不断发现，基因治疗研究的不断深入，心脑血管病和肿瘤的基因治疗已成为基因治疗研究中最活跃的领域之一。裸DNA由于易被机体胞外屏障和胞内屏障阻碍清除，主要通过直接的物理和机械方法导入部位，虽能有效转运并表达目的基因，但缺乏靶向性，只能局部作用，并且可能还需进行外科手术以暴露靶器官，临床应用受限。人们愈来愈认识到选择适当的载体，使基因靶向性和特异性的在一些人体组织部位表达，是基因治疗成功的关键。目前，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体。其中85％基因治疗临床项目是采用病毒载体，存在许多不足或危险，主要体现在免疫原性高、毒性大、插入性基因突变、目的基因容量小、靶向特意性差、制备较复杂及费用较高等。所以正积极研制非病毒载体。脂质体作为载体，虽然包裹DNA后直接注射安全、无免疫原性，但是无靶向性和特异性，体内基因转移效率低等缺点。纳米微粒是有希望的载体，但是靶向性仍然有待于研究解决。10年来，虽然有许多新的靶向特异性基因治疗，但是成功的基因治疗仍然是难以捉摸和具有挑战性的，最主要的障碍是缺乏无创、有效、靶向特殊器官和组织的载体释放系统。(2)溶栓药物和抗肿瘤药物载体研制现状

血栓性疾病与肿瘤已成为危害人类的主要疾病。许多血栓性疾病是由血栓所致，如心肌梗死、外周血管血栓形成、脑梗塞，需要溶栓和/或抗凝血治疗。但是，目前的溶栓剂和抗血栓药物如r-tPA、链激酶，尿激酶，都无血栓特异性，容易导致身体其它部位出血的严重副作用。迄今仍然没有发现特异性的作用于血栓部位的药物。因此，研制携带溶栓药和抗血小板药物，特异性靶向血栓的载体释放系统具有重要临床意义。同理，目前的抗癌药不但杀死癌细胞，而且也破坏正常的组织细胞。但是目前仍然没有特异性的、靶向的理想药物载体释放系统。

心肌声学造影是近年发展的一种影像新技术，将含有微气泡的造影剂注入静脉，当通过心肌微血管床时，用二维超声心动图心肌显影，由于微气泡通过心肌时完全保持在血管内，故它不但可在跳动的心脏上估计冠脉微循环和心肌存活性，而且气微泡作为载体，能将携带的基因或者药物等带到心肌微循环，超声空化作用气微泡破坏，使所携带基因或药物被释放在特定组织部位。国外已有有关携带抗血小板抗体的超声造影剂的实验论文发表，国内少有相关的研究。因此，研究可生物降解的高分子多聚体超声造影剂，其气微泡作为携带多种基因或药物的载体，超声介导在特定组织部位基因转染或者药物释放，填补基因导入和药物靶向性释放的空白。无疑它必将有广阔的应用前景和巨大的经济效益。

三、发明内容：

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明目的在于，研制单纯超声造影剂，以及在单纯超声造影剂基础上的兼有药物、基因载体的靶向超声造影剂。

本发明的目的之一：研制一种适用于静脉注射的超声造影剂。该造影剂具有如下作用：

1)急性心肌梗死的早期诊断，梗死范围及再灌注疗效损伤评价；

2)慢性缺血心肌的诊断；

3)心功能评价：超声心动图评价心功能需要清晰的心内膜界。而不少患者，单纯超声心动图不能清晰地分辨心内膜面，影响了心功能测定。超声造影剂增强了心内膜界，使心功能评价更准确。

4)诊断和鉴别诊断肝脏、肾脏、脾脏、前列腺、乳腺等实质性脏器肿瘤。

本发明的目的之二：研制一种既有超声造影作用，又是药物、基因载体的靶向超声造影剂。

该造影剂具有如下作用：

1)携带VEGF、bFGF等多基因的超声造影剂气微泡，在超声的作用下，在心肌缺血坏死组织部位气微泡破裂，VEGF等多基因被靶向释放在缺血心肌局部，转染心肌内皮细胞，促进心肌微血管及侧枝血管再通，即无创转基因治疗，实现无创性心肌内微血管“搭桥”。

2)靶向血管内血栓。在急性冠脉综合症的病因中，富含血小板的血栓是主要原因。血小板激活在急性冠脉综合症的病理生理过程中起着关键的作用。血小板膜糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受体是血小板激活过程中最终的介质，它的阻断可使急性冠脉综合症患者减少心脏并发症。人类血小板抗原研究最多的是GPIIIa和IIb。超声造影剂气微泡携带IIb/IIIa抗体和溶栓药，在经胸超声心动局部超声作用下，破坏气微泡，使携带的IIb/IIIa抗体和溶栓药特异性的在血栓部位释放，利用抗体与血栓的IIb/IIIa抗原特异性结合，特异性的抗血小板和溶栓，避免和减少全身出血的副作用。

3)携带特异性抗体或基因或特异性抗肿瘤药物，靶向实质器官的肿瘤，特异性治疗肝脏、肾脏、脾脏、前列腺、乳腺等实质器官肿瘤，避免全身用药的毒副作用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

1.一种静脉注射的超声造影剂，其特征在于，按以下方法制备：

1)首先制备表面带正电荷的气微泡

该气微泡的泡壁是由脂质、可生物降解的聚合体，表面活性剂组成，气微泡中空，内含空气、氮气等非卤碳气体，将丙烯酸及其衍生物进行乳液共聚；在表面活性剂的参与下，调节气相与液相之表面张力，使气相进入聚合物乳微泡中，或者使气微泡的泡壁具有胺基、酰胺基、羧基、醚基和硫键，或者使气微泡的脂质含有羟基；

2)将气微泡与血管内皮生长因子、硷性成纤维细胞生长因子质粒重组，以40-100∶1重量比混合搅拌，制备成携带血管内皮生长因子、硷性成纤维细胞生长因子基因的含气微泡的超声造影剂；

3)将气微泡与GPIIb/IIIa抗体以30-100∶1重量比混合搅拌，使含气微泡与GPIIb/IIIa抗体通过二硫键共价藕联，制成携带IIb/IIIa抗体的气微泡。

本发明的其它一些特点是：

所述气微泡采用乳液聚合法制备，其配方为：

氰基丙烯酸酯                       100份

烷基酚聚氧乙烯(10)醚               2.0份

N-酰基谷氨酸钠                     1.5份

多聚胱氨酸钠                       1.5份

过醋酸                             4份

蒸馏水                             300份

在强力搅拌下进行乳液聚合，并向料液中通入氮气，聚合反应在65℃-78℃下进行反应，时间为6h-8h；气微泡的粒径为0.6微米～10.0微米。

所述可生物降解的聚合体为聚氰基丙烯酸酯或氰基丙烯酸酯——丙烯酰胺共聚物。

所述表面活性剂为磷脂或烷基酚聚氧乙烯(10)醚或N-酰基谷氨酸钠或多聚胱氨酸钠或上述各活性剂的复合。

兼药物或基因靶向载体超声造影剂，按以下方法制备：

1)首先制备好如权利要求书1所述的静脉注射的超声造影剂；

2)将气微泡和多聚氨基酸、血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)质粒混合搅拌，在15℃条件下进行反应，使气微泡通过与多聚氨基酸、血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因亲和，按次价力进行结合。

所述气微泡还可以通过与GPIIb/IIIa抗体以30-100∶1重量比混合搅拌，制成携带IIb/IIIa抗体的气微泡。

所述气微泡还可以通过与抗纤维蛋白溶解酶原激活物t-PA单克隆抗体混合搅拌，制成携带溶栓药物的载体。

所述气微泡还可以通过利用抗体的硫键等活性基团与微泡壁的活性基团化学结合，制成多种具有血栓特异性的抗血栓剂的气微泡。

血管内的血栓主要是由纤维蛋白、血小板及血细胞组成，其中许多物质可以克隆为抗体。

含气微泡包裹抗肿瘤药物，可以在超声作用下释放。

本发明的超声造影剂和兼药物、基因靶向载体的超声造影剂，具有以下效果：(一)心脏和心肌超声造影：

1.所发明的超声造影剂可明确坏死、缺血心肌的范围；

2.心肌再灌注损伤评分；

3.增强了心内膜界面的清晰度，提高了超声心动图心功能评价的准确性；

4.可探查到的大血管腔内(如颈和股动静脉等)、心腔内特别是经胸超声心动图不易探查到的心耳内血栓诊断；(二)理想的药物和基因的载体具有靶向性和特异性：

1.载体携带血小板及血栓特异性抗体靶向血小板和血栓，用于血管内血栓和冠脉血栓的溶解。

2.载体携带血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因，在超声作用下，在心肌局部释放基因并转染心肌内皮细胞，促进缺血、坏死心肌组织微血管再生，即“微血管搭桥”。

3.携带特异性抗体或抗肿瘤药物，在超声作用下，在肝、肾等实质器官的肿瘤部位释放。

四、附图说明

图1是可生物降解聚合体气微泡化学聚合示意图。

图2是兼药物、基因靶向载体的超声造影剂实施例流程示意图。

五、具体实施方式

以下结合附图和发明人给出的具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

图1是可生物降解聚合体气微泡化学聚合示意图

按本发明的技术方案，静脉注射的超声造影剂，按以下方法制备：

1)制备含直径1-10微米的含气微泡；

气微泡壳层(即气微泡的泡壁)是由脂质、可生物降解的聚合体(如聚氰基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯——丙烯酰胺共聚物等)，表面活性剂(如磷脂、烷基酚聚氧乙烯(10)醚、N-酰基谷氨酸钠、多聚胱氨酸钠等)组成。表面活性剂(再此亦称为乳化剂)，我们是采用多种表面活性剂复合使用。聚合体单体与表面活性剂用量的比例为100∶4-6(重量份)。表面活性剂的分子中含有一个较大的中性烃基结构和极性末端，中性烃基结构能溶于聚合体的单体中，对空气、氮气亦有亲和性，其极性端则亲水。在乳液聚合中采用水为分散介质，表面活性剂用以减少单体与分散介质间的界面张力，使单体乳化成为单体乳胶粒，并增加单体于水相中的溶解度，使容纳于表面活性剂胶囊中的单体成为增溶溶液。同时也减少了气体(空气、氮气)与分散介质间的界面张力，使气体能更多的容纳于表面活性剂的胶囊中，再进入聚合体—单体乳胶粒中，而最后形成为气微泡乳胶粒子。在水溶液中表面活性剂将憎水基朝向单体液滴或聚合体粒子，在他们的周围造成保护层，阻止粒子并合而保证了乳液的稳定，同时也提供了气体在聚合体—单体乳胶粒中的较稳定的环境。(附图1)。

2)带正电荷的气微泡与带负电荷的VEGF、bGFG基因质粒混合；或者气微泡的泡壁具有胺基、酰胺基、羧基、醚基和硫键，或者气微泡的脂质有羟基，与VEGF、bGFG的氨基基团耦联，制备成携带VEGF、bGFG基因的含气微泡；

3)使含气微泡的羟基与GPIIb/IIIa抗体藕联，制成携带IIb/IIIa抗体的气微泡。

兼药物或基因靶向载体超声造影剂，按以下方法制备：

1)首先制备好如权利要求书1所述的静脉注射的超声造影剂；气微泡的外层分布着表面活性剂烷基酚聚氧乙烯(10)醚，N-酰基谷氨酸钠以及多聚胱氨酸钠的分子束，使气微泡的泡壁具有胺基、酰胺基、羧基、醚基和硫键，对多聚氨基酸、血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因均具有亲和作用，可按次价力进行结合；使气微泡既是超声造影剂，同时也可成为基因、药物靶向载体；

2)同时气微泡的泡壁具有的多种活性官能基与多聚赖氨酸、VEGF、bFGF等基因中的活性官能基在15℃条件下进行反应，发生结合或生成化学键；使气微泡既是超声造影剂，同时也可成为基因、药物靶向载体；

3)将气微泡与血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因质粒混合，以40-100∶1重量比混合搅拌，制备成携带血管内皮生长因子、硷性成纤维细胞生长因子基因质粒的含气微泡的载体，同时也是超声造影剂；

4)使含气微泡与血小板GPIIb/IIIa抗体通过二硫键共价藕联

将微泡与GPIIb/IIIa抗体以30-100∶1重量比混合搅拌，制成携带IIb/IIIa抗体的气微泡；

5)使含气微泡与抗纤维蛋白溶解酶原激活物t-PA单克隆抗体混合搅拌，制成携带溶栓药物的载体；

6)利用抗体的硫键等活性基团，与微泡壁的活性基团化学结合，从而制成多种具有血栓特异性的抗血栓剂的气微泡。

图2是兼药物、基因靶向载体的超声造影剂的实施例流程示意图。

首先将单体、复合乳化剂、引发剂、分散介质和水混合；在强力搅拌下乳液聚合，生成泡壁有多种活性官能基，泡内含有聚合体及气体的气微泡乳胶粒，加入有活性基团的基因(VEGF、bFGF质粒)，制备成能携带基因的气微泡，经静脉注射入血液循环，经心脏冠脉及其微循环，在体表心脏部位持续超声作用下，气微泡释放，达到如下作用：1、心肌显影；2、气微泡释放基因入心肌，基因转染心肌内皮细胞，在心肌内表达，使缺血、坏死心肌血管再生。

实施例：

气微泡是采用乳液聚合法制备的，其配方为：

    氰基丙烯酸酯                         100份

    烷基酚聚氧乙烯(10)醚                 2.0份

    N-酰基谷氨酸钠                       1.5份

    多聚胱氨酸钠                         1.5份

    过醋酸                               4份

    蒸馏水                               300份

在强力搅拌下进行乳液聚合，并向料液中通入氮气，聚合反应在65℃-78℃下进行。反应后获得的产物用电镜分析测试，乳胶粒子(即气微泡)的粒径基本上为0.6微米～10.0微米。乳胶粒包容有一定量的空气如氮气，乳胶粒的聚合物即聚氰基丙烯酸酯为可生物降解的聚合物。乳胶粒子的外层分布着乳化剂(即表面活性剂)烷基酚聚氧乙烯(10)醚，N-酰基谷氨酸钠以及多聚胱氨酸钠的分子束，使气微泡的泡壁具有胺基、酰胺基、羧基、醚基和硫键，对多聚氨基酸、血管内皮生长因子(VEGF)、硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因(注：VEGF和bFGF是促血管生长因子，已证实VEGF、bFGF等血管生长因子基因特异性地促进内皮细胞分裂增殖，血管通透性增加，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供基质，是新生血管的始动因素，促进缺血组织血管再生及侧枝微血管生长，使遭到破坏的心肌内微血管重建。)均具有亲和作用，可按次价力进行结合。同时气微泡的泡壁具有的多种活性官能基与多聚赖氨酸、VEGF、bFGF等基因中的活性官能基在适当条件下也可以进行反应，发生结合或生成化学键。因此气微泡既是超声造影剂，同时也可成为基因、药物靶向载体。

将气微泡与VEGF、bFGF基因质粒混合，由于气微泡的泡壁具有多种极性官能基，而基因质粒中也含有极性基因，泡壁与基因质粒间即具有范德华力的作用且有生成氢键的可能，泡壁附有的氨基酸的羧基基团并可与VEGF、bFGF基因质粒的活性基团藕联，或者带正电荷的气微泡与带负电荷的VEGF、bFGF基因质粒结合，将微泡与VEGF、bFGF质粒重组以40-100∶1重量比混合慢速搅拌，制备成携带血管内皮生长因子、硷性成纤维细胞生长因子基因质粒的含气微泡的载体，同时也是超声造影剂。

作为携带血管生长因子的载体的超声造影剂的气微泡注射入静脉，随血液流经心肌，在超声空化作用下，气微泡在心肌局部破坏，释放出其内的气体，不但产生线性散射和非线性散射，使心肌血液灌注好的区域显影增强，心肌血液灌注不好的区域则不显影或显影不好。从而实现心肌造影，可成为无创、床旁、适时和可重复的急性或慢性缺血性心脏病新的良好诊断技术。而且超声空化作用破坏气微泡，使气微泡所携带的血管生长因子基因释放到心肌局部，转染血管内皮细胞，营造血管再生的微环境，促进血管内皮细胞增长，最终使缺血、坏死的心肌血管再生，实现无创性心肌内微血管“搭桥”。