具有神经保护作用的7－羟基表雄酮

摘要

7－羟基表雄酮可用于保护急性或慢性神经损伤。

说明书

本发明涉及一类用于保护神经细胞免于死亡的7-羟基类固醇化合物的用途，因此它可用于治疗和预防如阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、非痴呆性认知损伤(Cognitive Impairment No Dementia)(CIND)、中风、脑外伤、脊髓损伤和周围神经损伤等疾病或其后遗症。而且它也可用于增强认知功能。

在体内，脱氢表雄酮的7α-羟基化代谢产物的产生于1959年在尿中被发现，并被鉴定为7α-羟基DHEA[J J Schneider，M L Lewbart，RecentProgr.Horm.Res.15(1959)201-230；L Starka et al，Clin.Chim.Acta.7(1961)309-316]]。此后报道了来自人的许多器官，包括成人肝和胎肝、睾丸、副睾、皮肤、乳腺组织、前列腺、脂肪基质细胞和扁桃腺等组织制品中3β-羟类固醇底物(包括DHEA和表雄酮-EPIA)的广泛7α-羟基化。在大鼠肝和大量的小鼠组织和器官中，DHEA在7位的羟基化也得到验证。所有这些研究中，7α-羟基-DHEA是迄今为止所产生的最主要的代谢物。事实上，Doostzadeh等[Steroids 63(1998)608-614]已报道通过小鼠肝微粒体生成7α-DHEA的速度比7β-DHEA快15倍。

而且表明EPIA，DHEA和孕烯醇酮在大鼠脑中也可快速广泛地转化为它们相应的7α-羟基代谢物[J M Guiraud et al，Steroids 34(1979)241-248；M Warner et al，Endocrinology 124(1989)2699-2706；Y Akwaet al，Biochem.J.288(1992)959-964]]。

WO97/37664公开了包括7α-羟基取代类固醇在内的一类特定化合物在治疗神经、免疫或内分泌失调方面的用途。在WO97/37664中建议可用这些化合物进行治疗的疾病包括阿尔兹海默氏病。但由于该病的作用机制是假设脑中缺少7α-羟基取代的类固醇而引起的，因此WO97/37664中所建议的治疗更改为用7α-羟基取代的类固醇来替代缺少的化合物。因此，WO97/37664描述的程序是治疗已有的疾病，而不是预防疾病或通过阻止神经元的进一步损伤来防止疾病的恶化。所以WO97/37664并没有描述一种神经保护作用。也没有建议这些化合物可用于防止由意外或创伤事件如中风而引起的损伤。

目前我们很惊讶地发现7-羟基表雄酮，无论α、β或混合物，均可用于防止由中风、脑外伤、蛛网膜下出血或心脏分流手术导致的大脑缺血等事件所引起的急性和慢性神经损伤。

对于长时间组织缺氧或缺血，可能会或不会造成低血糖，但都会产生不同程度的神经损伤。

典型地，在心脏病发作时会发生缺血情况，但此时造成的损伤基本上局限在心脏组织，而且已经研发了可靠的治疗方法。对于本发明，我们考虑的是脑部更长时间的缺血，如中风病人或头损伤病人的缺血。缺血的严重程度取决于中风或损伤的程度，但一致的是它们都产生脑部损伤，这是本发明强调的情况。

本领域中已知的各种神经保护制剂都尝试用来减缓脑损伤问题，但就目前而言，所有已知的制剂都有不利的副作用。例如，MK801(dizocilpinemaleate)是一种非常简单的分子，可以对缺血病人提供一定程度的神经保护作用。但MK801也具有一定的“神经恐慌效应”(Martindale)，以及不利的运动作用。神经保护作用在《脑研究》755(1997)36-46(Pringle，A.K.，等)中有详细介绍，其作为参考结合在此处。这些作者在早期文章中也介绍了海蜗牛毒素的神经保护作用，但尽管该化合物具有神经保护作用，在体内却观察到其不利的副作用。

因此本发明在于7-羟基表雄酮(7-羟基-EPIA)用于生产保护急性或慢性神经损伤的药剂的用途。

该化合物可用分子式(I)表示：7α和7β互为异构体，分别是：

本发明也包含这些化合物的前体及在体内代谢产生这些化合物的物质的用途。

α和β异构体可单独或混合使用。如果混合使用，可以以任意比例使用。但由于7β异构体具有更高的活性，因此是优选存在的。

众所周知，本发明中的化合物从母体类固醇开始，可通过各种方法进行制备。例如，可通过上述所列参考文献中的方法进行制备，这样可得到7β和相应的7α化合物的混合物，然后可通过已知的技术分离该混合物。

作为实施例，在用传统方法保护DHEA的3β-羟基和17-酮基后，可通过烯丙基的氧化作用来得到7α和/或7β-羟基EPIA。然后产物用可溶性金属化合物催化剂(如氢化钠)进行还原，并对3β-羟基和17-酮基去保护。如果需要，然后可用传统方法，如柱层析，分离7α-羟基和7β羟基差向异构体，而且可通过结晶纯化7α-和7β-羟基EPIA。

作为选择，7α-和7β-羟基-EPIA可通过以下列出的反应路线进行制备：

在该反应路线中，DHEA(II)乙酰化得到相应的式(III)的乙酸酯，然后其与乙二醇反应，得到式(IV)的缩酮。然后缩酮(IV)如实施例3所述进行氧化，得到相应的7-酮基化合物(V)，然后该化合物进行脱乙酰化，得到式(VI)的化合物。该化合物还原得到式(VII)的7-羟基-17-缩酮基-EPIA，然后它用酸处理来除去缩酮基而得到7-羟基-EPIA，最后通过层析法分离成7β-和7α-异构体，得到7α-羟基-EPIA(IX)和7β-羟基-EPIA(X)。

本发明中的化合物可用于治疗可能有缺血危险，特别是中风或头损伤危险的病人，或治疗可能会发展为神经退化性疾病的病人，如阿尔兹海默氏病或CIND，可能由慢性阈下脑缺血或减少神经元能量产生而促使发病，这种情况常在老化的大脑中观察到。在这种情况下，预防药是很有用的。而且应注意到，即使在缺血情况发生后，使用本发明中的化合物也是有用的，但推荐尽早用药，以尽可能避免神经元的恶化。在有些情况下，特别是在病人仍处于缺血危险中时，可以使用重复的剂量。

为了尽早得到期望的效果，用药的合适方式一般是注射。因此，静脉注射是特别优选的，但在有些情况下，优选的用药方式是直接将化合物注射到脑脊髓液中。

本发明中化合物的剂量可根据很多因素进行改变，包括年龄、体重和病人病况、及用药方式、频率和途径。但一般推荐的剂量是从0.01到50mg/kg体重，更优选的是从0.05到20mg/kg体重的剂量。可以一次的剂量或分开的剂量进行用药。

本发明通过下面无限制的实施例进一步描述，其中实施例1到20描述的是本发明中化合物的制备，实施例21和22描述的是它们的活性。在实施例1到20中，罗马数字代表上述反应路线中的分子式。

实施例1DHEA-3-乙酸酯(III)

50ml吡啶和50ml含10g DHEA(II)(34.72mmol)的乙酸酐溶液加热回流4小时。将反应介质冷却，倾注到水中并用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相中并蒸发至干燥。用乙醇重结晶后获得11.0gDHEA-3-乙酸酯(III)(33.33mmol，96％)。

实施例217-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(IV)

将100ml含5g DHEA-3-乙酸酯(III)(15.15mmol)的甲苯溶液，5ml乙二醇和催化数量的对-甲苯磺酸用Dean-Stark设备在蒸汽中加热回流24小时。将反应介质倾注到100ml 10％(w/v)碳酸钾水溶液中。滗去有机相。水相用乙酸乙酯萃取。有机相合并后，蒸发至干燥。用乙醇重结晶后获得5.10g 17-缩酮-3-DHEA-乙酸酯(IV)(13.64mmol，90％)。

实施例37-酮基-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(V)

将70ml含5g 17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(IV)(13.37mmol)的吡啶溶液和催化数量的Bengal Rose用具有氧气鼓泡的中压汞蒸汽灯进行照射。24小时后向反应介质中加入催化数量的乙酸铜。再经过24小时后，将反应介质蒸发至干燥。残余物用快速层析法(SiO₂/乙酸乙酯：环己烷3/7)进行纯化。从而获得3.11g 7-酮基-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(V)(8.02mmol，60％)。

实施例47-酮基-17-缩酮-DHEA(VI)

将50ml含1％氢氧化钾的甲醇溶液和1g 7-酮基-17-缩酮-DHEA-3-乙酸酯(V)(2.58mmol)加热回流2小时。然后将反应介质冷却、中和并用乙酸乙酯进行萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发至干燥。用甲醇重结晶后获得802mg 7-酮基-17-缩酮-DHEA 5(2.32mmol，90％)。

实施例57-羟基-17-缩酮-EPIA(VII)

将10g 7-酮基-17-缩酮-DHEA(VI)(28.90mmol)加入到-33℃的含2.65g钠的液氨溶液中。4小时后，加入氯化铵至蓝色消失。然后加入2.65g钠。4小时后，再次加入氯化铵至蓝色消失。然后加入水并使氨蒸发。用乙酸乙酯萃取反应介质。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发至干燥。从而获得6.07g 7-羟基-17-缩酮-EPIA(VII)(17.34mmol，60％)。实施例67-羟基-EPIA(VIII)

将100ml含5ml水的丙酮溶液，10g 7-羟基17-缩酮-EPIA(VII)(28.57mmol，50％)和催化数量的对-甲苯磺酸加热回流4小时。将该反应介质冷却，倾注到100ml 10％(w/v)碳酸钠水溶液中，然后用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机相，然后蒸发至干燥。残余物用快速层析法(SiO₂/乙酸乙酯)进行纯化。从而获得5.24g 7-羟基-EPIA(VIII)(17.14mmol，60％)。

实施例77α-羟基-EPIA(IX)和7β-羟基-EPIA(X)

7α和7β异构体比例为65/35的7-羟基-EPIA(VIII)(5g)通过快速层析法(Al₂O₃/CHCl₃)进行纯化。在7α-羟基-EPIA(IX)(1.34g)之前首先得到7β-羟基-EPIA(X)(2.5g)。7β-羟基-EPIA(X)和7α-羟基-EPIA(IX)用乙酸乙酯进行重结晶。

实施例8研究低氧神经元损伤的实验流程

使用做了如下修改的Pringle等(1996，1997)的基本方法制备器官型海马切片培养物：

将Wistar幼鼠(8-11天)斩首，并将海马很快分散到冰冷的且补加4.5mg/ml葡萄糖的Gey’s平衡盐溶液中。分离切片并放在Millicell CM培养内眼板中(每孔4个)，在37℃/5％CO₂条件下维持14天。维持培养基包含25％加热灭活的马血清，25％Hank’s平衡盐溶液(HBSS)及50％含有补加1mM谷氨酸和4.5mg/ml葡萄糖的Earle’s盐的最低必需培养基(MEM)。培养基每隔3-4天更换一次。

如前所述进行实验性缺氧操作(Pringle等，1996；1997)。简要来说，将培养物转移到含有5μg/ml荧光排斥染料碘化丙锭(PI)的无血清培养基(SFM-75％MEM，补加1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％HBSS)中。成象前培养物在SFM中平衡60分钟。然后用装有一套若丹明滤光片的Leica倒置显微镜检测PI荧光。该步骤中任何可检测到PI荧光的培养物在以后的实验中舍弃。将培养物转移到已用95％N₂/5％CO₂饱和的SFM(+PI)中来诱导缺氧。然后将培养皿(无盖)封口成密闭室，其中的空气已在密闭前通过以10L/min的速度连续鼓气10分钟用95％N₂/5％CO₂饱和了。然后在培养箱中放170分钟(因此缺氧总时间为180分钟)。在缺氧阶段的最后时刻，将培养物放回到含PI的含氧量正常的SFM中，再将其放回培养箱中维持24小时。

按前述方法(Pringle等.，1996；1997)用Apple IIsi计算机运行NIHImage 1.60或Macintosh G4/400计算机运行OpenLab 2.1(Improvision)对神经元损伤进行评估。图像用单色相机拍摄，并保存在光盘中以备脱机分析。在加入药品之前拍摄光透射图像，而在24小时缺氧后的恢复期结束时拍摄PI荧光图像。CA1细胞层的范围可从透射图像中确定。而CA1中的PI荧光区域可用NIH Image或Openlab中的密度分割功能进行计算。神经元损伤以PI荧光高于背景的CA1的百分比来表示。

类固醇化合物是通过制造最初的溶在乙醇中的1mg/ml溶液并进一步在SFM中稀释制得的。在缺氧之前、缺氧之中及缺氧之后的恢复期将化合物加入到培养物中45分钟。对照实验由只用载质处理的培养物构成。结果实验1：

进行最初的实验是用来确定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高浓度下是否具有神经保护作用。缺氧在25.5±6.4％的CA1中产生损伤。如下面的表1所示，在缺氧之前、之中及之后，7αOH-EPIA和7βOH-EPIA均可显著降低这种损伤。

                        表1

化合物N在CA1中的％损伤对照缺氧17 25.5±6.4缺氧+100nM 7αOH-EPIA16 4.0±2.9**缺氧+100nM 7βOH-EPIA16 9.0±4.7*实验2：

已确定70H-EPIA的α和β异构体均具有神经保护作用，我们推测这种作用具有浓度依赖性。对照组缺氧对31.9±4.7％的CA1造成神经损伤。7αOH-EPIA在100nM具有显著的保护作用。在10nM可观察到轻微的神经损伤，但并不是统计意义上显著降低量，并且在1nM没有作用。相反，7βOH-EPIA在10nM和100nM均具有显著的神经保护作用，但在浓度降低到1nM时活性丧失(见表2)。

                            表2

    化合物    N  在CA1中的％损伤    对照缺氧    29    31.9±4.7  缺氧+1nM 7αOH-EPIA    14    28.8±5.8  缺氧+10nM 7αOH-EPIA    15    21.9±8.1  缺氧+100nM 7αOH-EPIA    16    11.8±2.8**  缺氧+1nM 7βOH-EPIA    15    20.6±7.2  缺氧+10nM 7βOH-EPIA    12    11.9±4.7*  缺氧+100nM 7βOH-EPIA    13    14.3±5.0*实施例8大鼠全脑缺血实验(4血管闭塞法)

通过4血管闭塞法(4VO)在雄性Wistar大鼠(250-280g)中诱导脑缺血。两个椎动脉在戊巴比妥麻醉(60mg/kg腹腔注射)下通过电烙术进行闭塞。然后允许动物在自由进水但无食物的情况下恢复24小时。第二天颈动脉在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露在2％氟烷中，并用微脉管钳闭塞10分钟。随后，松开二只钳子，并检查二个动脉以进行立刻的再灌注。在手术时和随后的3小时中，通过用连有温度计的恒温控制的电热毯来维持其正常体温(37.5±0.5℃)。对于对照组，假手术动物的两个椎动脉在戊巴比妥麻醉下被电烙，两个普通的颈动脉在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露于氟烷但第二天不被夹紧。伤口用利多卡因胶处理，然后进行缝合。动物在环境温度30℃的情况下保持在加热灯下直至恢复意识。

共研究了7组动物：

1.(n＝8)类固醇化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通过尾静脉注射，共注射3次：分别在诱导缺血前15分钟、缺血中及再灌注后5分钟)；

2.(n＝8)类固醇，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述静脉注射3次)；

3.(n＝8)类固醇，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述静脉注射3次)；

4.(n＝8)NBQX(二钠盐，因为有更多的可溶水)作为参照物和阳性对照(TOCRIS，德国，30mg/kg，如1所述腹膜注射3次)；

5.(n＝8)标准载质(0.9％NaCl，含100μl乙醇)，如1所述静脉注射3次)；

6.(n＝8)单独缺血；

7.(n＝8)假手术对照组。

NBQX是2，3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并(F)喹喔啉，并已知具有神经保护作用[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.：TheneuroprotectiVe action of 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a rat focal ischaemia model.BrainRes.580，35-43，1992]。

7β-OH EPIA是本发明的化合物7β-羟基表雄酮。

将上述物质溶解在100μl乙醇中，最后用0.9％NaCl稀释。

缺血后经过7天的生存期，所有动物用4％多聚甲醛穿心灌注固定。然后小心地除去脑并在相同的固定液中后固定2小时。脑在30％蔗糖中超低温保护后，放到异戊烷中快速冷冻并保存在-80℃。将含有海马结构的20微米低温恒温器部件用甲苯胺蓝或Neuro Trace荧光进行Nissl染色。数据分析：

Nissl染色后，通过存活神经元的数量可评价缺血后海马CA1区域神经损伤的严重程度。计算每组CA1区域中每400μm长度上形态学完整的神经元的平均数。用装有20倍物镜的光学显微镜对每只动物的3-5个连续切片进行细胞计数，并对每个切片的400μm CA1区域进行6次计数。通过成对的Student’s t-测试对数据进行统计分析。数据以平均值±SEM来表示。结果和讨论

结果如附图1至3所示。

形态学完整的海马CA1神经元在Nissl染色(甲苯胺蓝或NeuroTrace，如图2)后根据以下标准来体现：清晰的神经元核周体形状，带有阳性标记的核仁的大核，在具有Nissl染色的核周围的小细胞质区，表明具有完整的含核糖体的粗糙内质网，因此具有完整的蛋白合成系统。

全脑缺血10分钟(轻度缺血)及7天的生存期导致海马CA1区域锥体细胞的选择性神经变性(图1A-1C)。在假手术动物的CA1中，锥体细胞平均数目为121.5±4.3(设为100％)。因此，在全脑缺血10分钟后，60％CA1神经元死亡(图1B)。缺血并如实验所述用载质(NaCl+100μl乙醇)进行静脉注射的动物组神经元数目与单独缺血动物组进行比较(图1A，1B)。NBQX(30mg/kg，如实验所述静脉注射三次)与缺血组比较，CA1锥体细胞中表现出显著的(p＝0.03)神经保护作用。与单独缺血组比较，NBQX表现出47.5％的神经保护作用，而与假手术组动物相比较，保护作用为68.5％。NBQX引起的神经保护作用与Gill等，1992和Gill 1994的结果是一致的，表明我们实验中所用的全脑缺血模式是有效的。7β-OH EPIA在全脑缺血10分钟和7天生存期后，对海马CA1锥体细胞具有浓度依赖性的神经保护作用(图1A)。T-测试分析表明，7β-OH EPIA在浓度为0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)时具有非常显著的神经保护作用。与假手术组相比较，7β-OH EPIA对CA1锥体细胞分别表现出74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神经保护作用(图1C)。但7β-OH EPIA在浓度为1.0mg/kg时仅表现出神经保护的趋势，但作用不显著。

在缺血之前、之中和之后用7β-OH EPIA进行静脉注射的所有实验中，我们从未观察到动物的任何行为异常。

附图说明：大鼠全脑缺血7天后及在不同化合物影响下的形态学完整的海马CA1锥体细胞的数目。数据以CA1区域每400μm长度的完整神经元的平均数目±SEM表示。数据以CA1区域每400μm长度的完整神经元与假手术动物的百分比表示，假手术组动物的完整神经元设为100％。当缺血组存活神经元数目设为0而假手术组设为100％时，数据以神经保护作用的绝对百分比表示。