一组新型抗肿瘤基因治疗药物短干扰核糖核酸

摘要

本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组与人类肿瘤相关的基因序列，并以RNA干扰技术为基础，设计出一组可能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学法合成一定量的siRNA，以此作为新型抗肿瘤药物具有高效、特异的特点，经MTT法检测，对siRNA对MCF－7、BEL7402、KB、HT－29等肿瘤细胞有明显的细胞毒作用，WesternBlotting检测siRNA能降低特异蛋白的表达水平达80％－90％，形态学观察表明siRNA能引起肿瘤细胞发生相应的形态变化和染色质浓缩，与以往药物相比，siRNA是一种机制全新、高效快速的抗肿瘤药物。

说明书

技术领域：

本发明涉及一组siRNA(短干扰核糖核酸)药物的设计、合成及其在肿瘤基因治疗中的应用。

背景技术：

抑制肿瘤发生相关基因的表达，是研究与开发新型抗肿瘤药物的一个重要思路。1998年发现的RNA干扰(RNAi)技术(Nature 1998；391：806-811)，已成为抑制靶基因表达的一个有效工具。RNA干扰被认为是从低等生物到高等生物都普遍存在的一种防御外源性核酸侵扰的生理机制，它能快速、特异地降解靶mRNA。因此，以这种生物体本身存在的RNA干扰为基础，人工设计并合成针对肿瘤相关基因的特异siRNA作为诱发RNA干扰的前体，使其有效降解肿瘤相关基因mRNA，降低肿瘤相关蛋白的表达水平，杀死肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

目前肿瘤基因治疗的基本策略是通过反义核酸或3’-5’A反义嵌合体引起靶mRNA部分特异或非特异降解，从而达到抑制靶基因表达的作用。前者导入细胞后在很短的时间内活性下降，且疗效难以判断，后者的稳定性和特异性也有待于进一步证实和提高。而新近发展起来的RNA干扰技术可以高度特异地降解靶mRNA。最近研究表明，质粒载体介导的RNA干扰作用在人类肿瘤细胞中可维持两个月，siRNA还可通过RdRP介导的级联放大作用更为快速地降解靶mRNA。

本发明的目的在于以RNAi为基础，利用人体基因库搜索技术、生物计算机信息技术设计针对肿瘤相关基因的siRNA药物，阐明siRNA药物对不同人类肿瘤细胞的细胞毒作用及其机制，为肿瘤的基因治疗提供更为有效的手段。

发明内容：

本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组与人类肿瘤相关的基因序列，并以RNA干扰技术为基础设计出一组可能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学法合成一定量的siRNA。该组基因分别为mdm-2、cdk-2、H-ras、bcl-2、PKCα、VEGF。根据GenBank中提供的cDNA序列，针对所述六种基因设计了长度为21个核苷酸的六种siRNA，每种siRNA的3’端有两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)呈单链悬挂状态，以此增强siRNA在体内和体外对RNAase的耐受性。本发明中的六种siRNA系由美国Dharmacon公司商业合成。本发明还涉及利用MTT法检测siRNA转染到四种不同的人类肿瘤细胞后的细胞毒作用，并计算siRNA药物对不同细胞的IC₅₀值，结果表明，六种siRNA中效能最强的为MDM-2，其IC₅₀值为174nM。另外结果表明，MDM-2、CDK-2、H-RAS、Bcl-2四种siRNA等比例混合再用脂质体包裹后，转染MCF-7细胞的IC₅₀值为332nM，而四种siRNA分别用脂质体包裹后再等比例混合转染MCF-7细胞的IC₅₀值为235nM，后者效能增强的原因可能是四种siRNA混合后相互作用形成复合体，影响siRNA的识别。本发明同时涉及用Western Blotting检测四种siRNA抑制靶基因蛋白表达情况，结果表明，四种siRNA均能有效降低靶蛋白表达水平。siRNA-MDM2在降低mdm-2基因表达的同时，使mdm-2的相互作用蛋白p53的表达量升高，证明siRNA-MDM2在降低靶蛋白表达量的同时能激活MDM2蛋白对p53的调节作用，促进细胞凋亡，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明还涉及用Hematoxylin & Eosin(HE)染色法，观察MCF-7细胞被siRNA-MDM2、siRNA-Bcl2转染后细胞核浓缩情况。结果表明，MCF-7细胞在转染siRNA-MDM2后，染色质浓缩，染色加深，细胞数明显减少，这与mdm-2基因参与细胞凋亡有关。本发明还涉及用MTT法检测siRNA对BEL-7402、KB、HT-29细胞的细胞毒作用，并计算其IC₅₀值。综上所述，本发明提供了获取靶基因序列并设计特异siRNA的方法，建立了检测siRNA降低靶蛋白表达量及其细胞毒作用的方法。

以下列举一些实施例作为对本发明的进一步说明，但不限制本发明。实施例1：siRNA的序列设计

从siRNA的长度和悬挂突出序列的长度等几方面对siRNA的沉默效率进行分析表明，最有效的siRNA双链是由21个核苷酸的正义链和反义链组成，每条链的3’端都悬挂突出两个核苷酸，中间19个核苷酸互补配对(PNAS 2001；98：14428-14433.)。悬挂突出的两个脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸同样有效，但前者合成更便宜，而且可耐受更多的核酸酶，因此本发明选择悬挂突出为dTdT的siRNA序列。

从特定基因完整cDNA序列起始密码子下游的50-100个核苷酸中选择靶区域更为有效(Genes and Development 2001；15：188-200.)。由于5’或3’的非翻译区及起始密码子附近调节蛋白结合位点较多，所以一般不选择这些部位。非翻译区的结合蛋白和翻译起始复合物可能会对siRNP(short interferingRibonucleoprotein)和RISC(RNA-induced silencing complex)核酸内切酶复合物的结合有影响。所用的序列一般是前两个为AA后两个为TT且G/C含量约为50％的21核苷酸序列。如果cDNA中不含有这样的序列，也可采用仅前两个核苷酸为AA的21核苷酸序列。这种情况下，在合成siRNA时需将其正义链3’端后两个核苷酸变为TT。正义链和反义链3’端的悬挂突出序列TT是对称的。siRNA正义链悬挂突出部分的修饰不会影响其对靶mRNA的识别，而反义链该部分的修饰则可引导其对靶mRNA的识别。同时3’悬挂突出部分用dTdT的方式也可提醒合成者采用正确的合成方向。

如果靶mRNA上没有前两个为AA的21核苷酸序列，则可采用仅第二个核苷酸为A的21核苷酸序列。

若所选择的siRNA双链无沉默作用，其原因可能是序列上的错误、基因多态性以及所用细胞系是否是真正从设计种系得来的[。siRNA识别特异性研究表明，siRNA双链配对区上一个单一的点突变即可解除siRNA对mRNA的降解。

根据上述原则，本发明从GenBank中获得了六种基因序列，它们在GenBank中的登记号以及对应的siRNA序列相对于起始密码子的位置分别如下：bcl-2(Acc.No.M13995)   562-580mdm-2(Acc.No.NM_002392)22-40H-ras(Acc.No.AF493916) 310-328Cdk-2(Acc.No.AF512553) 4080-4098VEGF(Acc.No.AY047581)  315-333PKCα(Acc.No.NM_002737)259-277六种siRNA的靶mRNA序列及siRNA寡核苷酸序列如下：siRNA-MDM2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC AGC ACC AUC AGUAGG UAC-3’(SEQ ID No1)Oligo Sequence：

5’-C AGC ACC AUC AGU AGG UACdTdT-3’(SEQ ID No2)3’-DTdTG UCG UGG UAG UCA UCC AUG-5’(SEQ ID No3)siRNA-HRassiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAG CAC GUC AUC CGA GUC CUU-3’(SEQ ID No4)Oligo Sequence：

5’-G CAC GUC AUC CGA GUC CUU dTdT-3’(SEQ ID No5)3’-dTdTC GUG CAG UAG GCU CAG GAA-5’(SEQ ID No6)siRNA-Bcl2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC UCC GUU AUC CUG GAU CCA-3’(SEQ ID No7)Oligo Sequence：

5’-C UCC GUU AUC CUG GAU CCA dTdT-3’(SEQ ID No8)3’-dTdTG AGG CAA UAG GAC CUA GGU-5’(SEQ ID No 9)siRNA-CDK2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC CGAAAG AUC CGG AAG AGC-3’(SEQ ID No10)Oligo Sequence：

5’-C CGA AAG AUC CGG AAG AGC dTdT-3’(SEQ ID No11)3’-dTdTG GCU UUC UAG GCC UUC UCG-5’(SEQ ID No12)siRNA-PKCαsiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAG UCC CUU AUC CGC ACC CGG-3’(SEQ ID No13)Oligo Sequence：

5’-GUC CCU UAU CCG CAC CCG GdTdT-3’(SEQ ID No14)3’-dTdTCAG GGA AUA GGC GUG GGC C-5’(SEQ ID No15)siRNA-VEGFsiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAA GGU UUG AUC CGC AUA AUC-3’(SEQ ID No16)Oligo Sequence：

5’-A GGU UUG AUC CGC AUA AUCdTdT-3’(SEQ ID No17)3’-dTdTU CCG AAC UAG GCG UAG UAG-5’(SEQ ID No18)

21个核苷酸的RNA适宜将核苷的氨基磷酸化保护后用化学法合成，也可用传统的DNA/RNA合成仪合成。本发明所使用的siRNA是由Dharmacon公司合成，siRNA双链纯度＞97％。用水溶解RNA双链后，可直接用于转染。这种方式可保证双链复合体以适当形式存在并易于转染。

实施例2：siRNA的转染

本发明使用LipofectAMINE^TM2000脂质体(Life Technologies，产品货号：11668-027，商标为Invitrogen，http：//www.invitrogen.com)进行转染，转染后18-45小时进行沉默效应测定。所有操作均符合11668-027.pdf file所描述的96孔板操作规程。将合成的siRNA粉末用水溶解，配成4000nM的储备溶液。实验细胞是在转染前18-20小时用200μl含10％胎牛血清的无抗生素DMEM组织培养液以8000-10000个/孔接种到96孔板中。将4000nM的siRNA用无抗生素无血清的DMEM培养液分别稀释至120nM、400nM、1200nM、2000nM、4000nM各75μl，在另外五个试管中，分别取2μl脂质体与73μl无抗生素无血清的DMEM培养液混匀，五分钟之内将各浓度的siRNA溶液分别与脂质体稀释液轻轻混匀。在此过程中，不能剧烈震荡以免脂质体生成氧化物。siRNA与脂质体复合物于室温静置20分钟后，把50μl siRNA-脂质体复合物加到细胞培养板(细胞生长覆盖率为80％-90％)中。细胞在给药前用无抗生素无血清的DMEM培养液洗一遍后，再加入新的50μl无抗生素无血清DMEM培养液。这样，转染后每孔溶液终体积为100μl。各孔中siRNA的给药浓度分别为30nM、100nM、300nM、500nM、1000nM，每个浓度同时作三个平行孔，每次实验至少重复三次。转染后五小时，每孔中补加100μl含20％胎牛血清的无抗生素DMEM培养液。第一次转染后每间隔15小时，同样方法进行第二次、第三次转染。所采用的细胞有：MCF-7、BEL7402、KB、HT29细胞。转染后用MTT法测定细胞存活率，计算IC₅₀值。

另外结果表明，MDM-2、CDK-2、HRas、Bcl-2四种siRNA等比例混合用脂质体包裹后转染效果不如四种siRNA分别用脂质体包裹后再等比例混合进行转染，其原因可能是四种siRNA混合后相互作用形成复合体，影响siRNA的识别。实施例3：用MTT法检测siRNA对肿瘤细胞的细胞毒作用

按上述实施例2方法转染的细胞在37度，含5％CO₂空气及100％湿度的温箱中孵育45小时左右。MTT用PBS缓冲液配成2mg/ml溶液，每孔加50μl，37度温育4小时，使MTT还原为Formazan。吸出上清液，加入150μl DMSO(二甲基亚砜)使Formazan溶解。用酶标仪(Model3550，Bio-Rad)在560nm处测定每个孔的光密度OD₅₆₀。将各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加MTT，无细胞)或空白药物孔OD值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞)，各重复孔的OD值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C％表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。细胞存活率％＝(加药细胞OD/对照细胞OD)×100，求出T/C＝50％时的药物浓度即IC₅₀。siRNA对MCF-7、BEL-7402、KB、HT29等细胞的剂量反应曲线和IC₅₀如表1和图1至图4所示。

表1.siRNA对不同细胞的IC₅₀实施例4：用Western Blotting检测siRNA抑制靶基因表达情况

用2ml含10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司产品)培养液在35mm细胞培养皿中于5％二氧化碳100％湿度培养箱中分别培养MCF-7细胞，覆盖率达到80％-90％时，按照LipofectAMINE^TM2000脂质体操作方案转染500nM siRNA于细胞中，37-42小时后，将细胞用预冷的1×PBS(本实施例中各种试剂和常规操作方法按照“分子克隆实验指南”第二版中相关说明部分配制)涮洗两遍，加入120μl新鲜配制的细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mM Na₃VO₄；1mM NaF)，立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30分钟至1小时。4度、13,000rpm离心15分钟收集上清于新的EP管中，用标准Bradford法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白(20-50μg)分别加入等体积的2倍上样缓冲液，沸水煮沸变性5分钟后于7.5％-12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离各蛋白，按照“分子克隆实验指南”第二版中相关部分说明转移印迹蛋白到PVDF膜上。转完的膜浸于含5％(w/v)脱脂奶粉TBS溶液中后室温振摇封闭过夜，TBS(10mM Tris HCl，pH7.5，150mM NaCl)室温润洗5次，每次5分钟，装入杂交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀释第一抗体，室温孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。装入新的杂交袋内，用二抗(兔抗HRP-辣根过氧化物酶)温育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz Biotechnology公司产品)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统ChemiImager5500(AlphaInnotech.)捕获图像。四种siRNA均能抑制MCF-7细胞中相应蛋白的表达(图5-图8)。其中siRNA-MDM2在降低Mdm2蛋白表达量同时，也解除了Mdm2蛋白对p53蛋白的抑制，使p53蛋白的表达量升高(图9)。在转染siRNA-Bcl2、siRNA-MDM2的同时检测PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白表达量，以保证各组样品总蛋白上样量的一致(图10、图11)。各种抗体的稀释比例如下，小鼠单克隆Mdm2抗体(sc-5304)1/150稀释，小鼠单克隆HRas抗体(sc-29)1/200稀释，兔多克隆p53抗体(sc-6243)1/200稀释，兔多克隆CDK2(sc-163)抗体1/200稀释，小鼠单克隆Bcl-2抗体(Oncogene Product，OP60)1/200稀释，小鼠单克隆PCNA抗体(Oncogene Product，NA-03)1/200稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体(ZB-2305)和辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(ZB-2301)1/3000稀释。实施例5：HE染色法观察细胞染色质浓缩和死亡情况

细胞接种于含有盖玻片的培养瓶中，放入CO₂孵箱培养18-20小时，使细胞覆盖80％-90％瓶底面积，转染300nM siRNA-MDM2处理约20小时，取出长有细胞的盖玻片，用PBS洗3次。将盖玻片浸入95％酒精固定15分钟。PBS洗2次，每次数分钟。浸入苏木精染液，染色5-10分钟，自来水浸洗。浸入稀盐酸酒精溶液进行分色，数秒钟即可，自来水浸洗。浸入淡氨水中，使细胞核蓝化3-5分钟，自来水浸洗。浸入伊红染液，染色5-10分钟后，自来水浸洗。经70％、80％、90％酒精各1次、95％酒精2次和100％酒精3次逐级脱水，每次1分钟。通过二甲苯3次，每次1分钟。在载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。用Leica显微成像系统(Leica Q500IW)拍摄细胞染色质浓缩图像(图12)。

发明效果

本发明提出一种全新的肿瘤基因治疗药物—siRNA的设计与体外药效学研究方案，合成了针对六种基因序列的siRNA，用MTT法检测了其对三种人类肿瘤细胞的细胞毒作用，用Western Blotting检测四种siRNA降低其靶蛋白表达水平可达80％以上，HE染色观察到siRNA-MDM2、siRNA-Bcl2可以引起MCF-7细胞的明显死亡和染色质浓缩现象。因此，siRNA药物对肿瘤的基因治疗有着广泛的发展前景。

附图说明图1.六种siRNA对MCF-7细胞的剂量-反应曲线，其中：

Bcl2：siRNA-Bcl2

CDK2：siRNA-CDK2

HRas：siRNA-HRas

PKCα：siRNA-PKCα

MDM2：siRNA-MDM2

VEGF：siRNA-VEGF

Mix1：siRNA-Mix1，四种siRNA先混合后再用脂质体包裹图2.四种siRNA混合后对MCF-7细胞的剂量-反应曲线，其中：

Mix1：siRNA-Mix1，四种siRNA先混合后再用脂质体包裹

Mix2：siRNA-Mix2，四种siRNA先分别用脂质体包裹后再混合图3.五种siRNA对MCF-7细胞的IC₅₀值，其中：

1：siRNA-Bcl2

2：siRNA-CDK2

3：siRNA-HRas

4：siRNA-PKCα

5：siRNA-MDM2

6：siRNA-Mix1，四种siRNA先混合后再用脂质体包裹

7：siRNA-Mix2四种siRNA先分别用脂质体包裹后再混合图4.siRNA对BEL-7402细胞的剂量-反应曲线，其中：

MDM2：siRNA-MDM2

Bcl2：siRNA-Bcl2图5.Western Blotting检测siRNA-HRas引起MCF-7细胞靶蛋白表达水平降低，

其中：

C：以水作为siRNA-HRas的空白对照

1：siRNA-HRas图6.Western Blotting检测siRNA-CDK2引起MCF-7细胞靶蛋白表达水平降

低，其中：

C：以水作为siRNA-CDK2的空白对照

1：siRNA-CDK2图7.Western Blotting检测siRNA-Bcl2引起MCF-7细胞靶蛋白表达水平降低，

其中：

C：以水作为siRNA-Bcl2的空白对照

1：siRNA-Bcl2图8.Western Blotting检测siRNA-MDM2引起MCF-7细胞靶蛋白表达水平降低，其中：

C：以水作为siRNA-MDM2的空白对照

1：siRNA-MDM2图9.Western Blotting检测siRNA-MDM2引起MCF-7细胞P53蛋白表达水平升高，其中：

C：以水作为siRNA-MDM2的空白对照

1：siRNA-MDM2图10.Western Blotting检测siRNA-Bcl2转染后MCF-7细胞PCNA蛋白表达水平，以此确证各组样品总蛋白上样量相等，其中：

C：以水作为siRNA-Bcl2的空白对照

1：siRNA-Bcl2图11.Western Blotting检测siRNA-MDM2转染后MCF-7细胞PCNA蛋白表达水平，以此确证各组样品总蛋白上样量相等，其中：

C：以水作为siRNA-MDM2的空白对照

1：siRNA-MDM2图12.siRNA-MDM2引起MCF-7细胞死亡和染质浓缩，其中：

A：以水作为siRNA-MDM2的空白对照

B：siRNA-MDM2