一种基于生物粘附性微球的口服生物大分子药物给药系统

摘要

本发明提供一种可生物降解的天然高分子多糖生物粘附性微球，这种微球的制备方法，该微球和治疗剂组成的治疗组合物，以及这种微球用于口服生物大分子药物时的药物给药系统载体。采用油水两相法制备该天然高分子多糖生物粘附性微球时，首先将果胶和黄原胶分散在油相中，加入几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)、聚卡波菲，接着进行交联，反应结束后分离、清洗和干燥后即得到多孔天然高分子多糖生物粘附性微球。本发明制备过程经济，得到的微球可生物降解、生物相容性好；而且具有很强的生物粘附性，可用于在口服生物大分子药物给药系统，以提高药物的生物利用度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可生物降解的天然高分子多糖生物粘附性微球，这种微球的制备方法，该微球和生物大分子治疗剂组成的治疗组合物，以及这种生物粘附性微球用于药物传递系统载体，制备口服生物大分子药物给药系统。

背景技术

药物的传递和释放系统是新药的开发研究中的关键环节。如何确保药物在体内最大程度地达到体外实验中所显示的疗效，同时对身体的其他组织、神经、器官的毒副作用最小，这是新药开发过程中必不可少的重要内容。

随着重组DNA技术的飞速发展，出现了越来越多的多肽类和蛋白质类药物，如近年来治疗贫血相关疾病的促红细胞生成素和干扰素药物在全球的销售额增加了20％。现今几乎所有的多肽和蛋白质类药物都是注射或者滴注的方式给药，所以这类药物传递系统的开发应用将具有巨大的商业潜力。在所有的非侵入式给药途径中，口服方式无疑是最为方便的一种，尤其是在慢性病的治疗之中。一方面方便病人使用，无痛苦，另一方面还可以杜绝由于注射或者滴注引起的感染。

但是对于生物大分子药物，在口服给药时，胃腔中的低pH值环境、以及胃肠道中的各种酶的水解作用导致了这类药物活性的降低甚至丧失；另一个主要因素就是粘膜上皮细胞的紧密结构(细胞间的紧密连接)对生物大分子通过的限制。这些因素是这类药物口服时释放、传递及吸收过程中的巨大障碍。因此，如何能克服或者避免胃腔中的低pH值环境、胃肠道中的各种酶的水解作用，同时延长药物在吸收位点的停留时间以提高药物释放和被吸收的时间，将是提高这类药物的生物利用度的重要途径。针对这些因素，研究者提出了一些相应的策略，如采用吸收促进剂、制成粘附片以提高在吸收位点的滞留时间等(Touitou E.J Control Rel 1992；21：139.44；Bai JPF.Int J Pharm，1994；111：147.52；Wang W.J Drug Target 1996；4：195.232)。据文献报道，采用一种生物粘附片(S.Eiamtrakarn，et al.，Biomaterials，2002(23)145-152)，口服释放G-CSF(重组人粒细胞集落刺激生长因子)时，生物利用度达到23％，达到了非常理想的效果。但是这些方法中，有些吸收促进剂对细胞有不可逆损伤，有些粘附片的制备工艺比较复杂，因而在实际应用上存在许多困难。

生物粘附性给药系统(Bioadhesion Drug Delivery System，BDDS)是指粘附性聚合物材料与机体组织粘膜表面产生较长时间的紧密接触，使药物通过接触处粘膜上皮产生较长时间的接触，使药物通过接触处粘膜上皮进入循环系统，发挥局部和全身作用的给药方式。BDDS一般包括经由口腔、鼻腔、眼、消化道、生殖道及直肠等部位给药，这些部位均覆有粘膜层。粘膜可分泌粘液，其主要成分为粘糖蛋白、糖蛋白、类脂、无机盐、水等，而粘糖蛋白可使粘液具有胶状、凝聚和粘合等特性。机体组织粘膜表面良好的润湿条件使可溶胀的聚合物材料与之产生紧密接触，粘附材料的分子链段嵌入细胞间隙或与粘液中的粘性链段互相穿透，通过机械嵌合、共价键、静电吸引力、范德华力、氢键、疏水键等综合作用，聚合物与粘膜紧密结合在一起，从而产生生物粘附现象，并可维持相当长的时间。粘附力强度与聚合物材料的电荷密度、分子量、分子空间构型、溶胀度、溶解度和浓度有关。此外，聚合物的表面极性、链段的柔顺性、用药部位的pH值、粘液量也会产生一定影响。

粘膜给药类似透皮给药，具有血浓平稳、作用期长、使用方便等特点，可起局部或全身作用。而且粘膜不存在皮肤那样的角质层，粘膜下血管丰富，血流迅速，使得粘膜给药还具有使用剂量小、发挥作用迅速等优势。

口服用药后，制剂粘附在消化道粘膜表面将药物靶向机体特定区域，通过延长药物在消化道内的滞留时间，可延长药物的作用时间，在消化道内或具有特定吸收部位的药物能增加其吸收总量及吸收速率，提高药物的生物利用度；聚合物与吸收膜内部紧密连接，减少药物的扩散途径，增加了在胃肠道易受破坏的药物(如多肽类及蛋白质类)的总体渗透性，并可通过结肠定位释药避免破坏，亦可定位胃肠道病变部位，发挥局部治疗作用。

微粒给药系统若以粘附剂包衣或是直接制成微粒制剂则更为有利：用粘附剂修饰可改善微粒的表面特性，破坏粘膜纤毛清除机制，增加胃肠道滞留时间；微粒与粘膜紧密接触，减少酶对药物的降解和消除，促进颗粒被摄取。

药物的缓释控释技术的关键在于制备出相应的药物载体。常用的药物载体材料主要是高分子材料。作为载体，它们必须满足可生物降解，安全，毒副作用小等要求。目前国际上研究较多的是一些合成的生物降解型高分子聚合物，如聚酯、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦腈等。虽然它们可以在体内溶解、溶蚀，但是它们降解后的产物如有机酸单体在体内可能会产生毒副作用。与此同时，基于天然高分子聚合物的药物载体材料的研究逐渐兴起。天然高分子聚合物的安全无毒副作用，可生物降解等特点(如多糖类)，正好符合生物医用材料的要求。同时对于生物粘附性材料，为了保证良好的生物粘附性，聚合物必须具有很强的氢键作用(亦即较多的氢键形成基团)、足够的柔韧性以穿透粘液层或者组织缝隙，适合在粘膜组织表面润湿的表面张力特性，另外，还需有较高的分子量。

因为生物膜的结构特性，大分子、极性药物很难通过生物膜。吸收促进剂(透过促进剂)就是指一类能可逆、特异或非特异地增强药物胃肠道粘膜或者其他组织粘膜透过性的化合物。当吸收促进剂与药物共同服用时，就会增加药物的透过性，进而提高药物的生物利用度。作为药物吸收促进剂必须安全无毒、能可逆地提高药物的透过性。目前研究的吸收促进剂主要有胆汁酸盐、环糊精衍生物、脂肪酸盐和钙离子螯合剂等化合物，但是这些化合物因为体内安全性的原因，在作为药物吸收促进剂使用时在剂量上受到了一定的限制。

大量的实验都已证明几丁聚糖对药物跨上皮黏膜细胞的透过能力有很强的促进作用。一般认为，几丁聚糖的这种作用机理是由它的黏膜粘附性和对上皮细胞的紧密连接的调节作用综合的结果(Artursson，P.et al.，Pharm.Res.1994(11)：1358-1361；Dadane，V.et al.，Int.J.Pharm.，1999(182)：21-32)。几丁聚糖已经被证明是一种安全无毒、可以生物降解的、具有生物相容性的天然大分子。

聚卡波菲(polycarbophil)是一种已经在药用辅料中得到应用的一种高分子聚合物，试验表明，聚卡波菲也是一种粘膜粘附性材料，而且它还能抑制肠道内一些蛋白酶的活性，从而提高生物大分子药物的稳定性。(H.L.Lueβen etal.，J.Contr.Rel.，45(1997)15-23)所以聚卡波菲也是一种较好的吸收促进剂。

利用天然高分子制备药物控制释放系统载体的研究较多，主要以海藻酸盐、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、阿拉伯胶、瓜而豆胶、透明质酸、硫酸软骨素、肝素和几丁聚糖等为原料，制成微球或微囊作为药物载体，或者制成含有药物的用于在体内包埋的凝胶。(Chen，Jun et.al.，Carbohydrate Polymers28(1)1995，69-76；Sinha，V.R.et.al.，International Journal ofPharmaceutics 224(1-2)，2001，19-38)。这类控释药物系统主要是针对小分子药物，利用多糖载体在体内包埋部位或者胃肠道内缓慢溶蚀、降解，或者载体对药物扩散的限制，影响药物在载体中的扩散系数，从而达到药物在体内控制释放的目的。利用天然高分子多糖制备生物粘附性微球给药系统，以实现生物大分子口服给药的研究的还未见文献报道。

如何针对生物大分子口服给药时限制因素，采取相应的策略以提高这类药物的生物利用度，将是生物大分子类药物剂型的重大革新，也将具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物可降解的，具有良好生物相容性的天然高分子多糖生物粘附性微球。

本发明的另一目的是提供一种制备这种天然高分子多糖生物粘附性微球的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗组合物，含有所述的天然高分子多糖生物粘附性微球和治疗剂。

本发明的还一目的是提供这种天然高分子多糖生物粘附性微球口服生物大分子药物给药系统中的应用。

本发明的目的是通过如下的方式实现的：

本发明涉及的天然高分子多糖生物粘附性微球具有如下特性：该微球粒径在0.1-3mm之间，微球包含有果胶，占30％-70％(w/w)，黄原胶占50％-1％(w/w)，聚卡波菲(polycarbophil)占10-30％，几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)占20-50％，余量为水份。密度不同，各成分所占比例亦不同。

所述的天然高分子多糖生物粘附性微球，优选果胶占50％-70％(w/w)，黄原胶占15％-5％(w/w)，聚卡波菲(polycarbophil)占15-20％，几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)占30-40％，余量为水份。 

所述的天然高分子多糖生物粘附性微球，优选包括有0.01-5％(w/w)的交联剂，交联剂可以是醛类交联剂和环氧氯丙烷中的一种或者其中的几种合用。

醛类交联剂优选戊二醛、甲醛、乙醛和甘油醛。

制备本发明所述的天然高分子多糖生物粘附性微球的方法包括如下步骤：

(1)配制果胶与黄原胶的混合溶液：取无毒性的油作为油相，加入到圆底烧瓶中搅拌，同时进行加热至30℃-90℃；加入果胶与黄原胶组成的水相，果胶溶液的浓度为0.5-50％(w/v)，黄原胶溶液的浓度为0.1-2％(w/v)，明胶溶液和黄原胶溶液两者的体积比为1∶0.1-1，并且上述的油相的体积为水相的4-15倍；加入浓度为0.1-6％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液；加入1-30％的聚卡波菲溶液。几丁聚糖、聚卡波菲溶液与果胶溶液的体积比分别为1∶0.1-0.5和1∶0.08-0.3。温度保持在30-90℃之间，搅拌0.1-1小时后，继续搅拌，直至自然冷却至室温后结束；

(2)离心分离、用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物。低温真空干燥后即得天然高分子多糖生物粘附性微球。

优选采用油相为矿物油和植物油，进一步优选采用葵花籽油、菜籽油、大豆油、花生油等。

进一步优选可以在步骤(1)之后，继续搅拌0.1-3小时，再加入1-10％(V/V)(占水相体积)，浓度为0.01-2M的交联剂(醛类交联剂和环氧氯丙烷交联剂中的一种或几种)进行交联，反应0.1-3小时后停止。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物。挥发性有机溶剂优选石油醚、乙醚、乙醇和异丙醇等。

优选上述步骤中的醛类交联剂为戊二醛、甲醛、乙醛、甘油醛。

本发明的关键技术有下面几点：一是天然高分子原料的选择：果胶是一种天然高分子聚合物，结构中含有大量的羧基、羟基，具有很强的形成氢键的能力。黄原胶是一种细菌多糖，也含有大量的羧基、羟基基团。二者皆具有很好的生物粘附性。几丁聚糖分子链上的氨基与黄原胶分子链中的羧基发生化学作用，从而使得微球稳定。关键技术之二是确定黄原胶溶液与果胶溶液的浓度以及二者相互之间的体积比：因为这是制备天然高分子多糖生物粘附性微球的先决条件。本发明制备方法中选择的果胶溶液的浓度为0.5-50％(w/v)。黄原胶溶液的浓度为0.1-2％(w/v)，果胶溶液和黄原胶溶液两者的体积比为1∶0.1-1。关键技术之三是采用油水两相法，升温的方法制备天然高分子多糖生物粘附性微球，这样有利于微球的形成，并且粒径分布较均匀，提高了防聚性。关键技术之四是通过调节果胶和黄原胶的使用量的摩尔比，可以实现对制备的微球的密度的控制。关键技术之五是在制备过程中温度的控制，加热时温度过高，不利于生物大分子的稳定，过低则不能使得黄原胶大分子链的伸展，不利于果胶、几丁聚糖以及聚卡波菲与黄原胶之间的化学作用的形成。本发明中采用的温度为30-90℃。关键技术之六是在制备过程中经过交联反应等步骤的处理，醛类交联剂可与几丁聚糖分子链上的胺基反应形成希夫碱；而环氧氯丙烷可与羟基发生交联反应，经过交联反应后，有利于提高微球的强度，从而提高抗压性，并可同时改善微球表面的物理化学性质或者引入新的功能基团，有利于进一步对微球进行修饰改性。在本发明中，交联剂使用量很少，而且可以通过后处理过程进一步除掉残留的交联剂；另外在制备过程中，没有引入有毒性的有机溶剂或者反应试剂；再者，果胶、黄原胶和几丁聚糖均为天然高分子具有很好的生物可降解性和生物相容性，而且已经应用于食品、医药行业。

本发明的再一目的是提供一种治疗组合物，含有所述的天然高分子多糖生物粘附性微球和治疗剂。治疗剂是指化学合成药物、生物工程药物，以及从生物体中提取的药用活性成分。如G-CSF(重组人粒细胞集落刺激生长因子)、茶碱等。

本发明的还一目的是提供这种天然高分子多糖生物粘附性微球在口服生物大分子药物给药系统中的应用。在制备载药微球时，先配制果胶溶液与黄原胶溶液二者的混合溶液，再向混合溶液中加入一定量的治疗剂并搅拌均匀，然后按照制备天然高分子多糖生物粘附性微球的方法制备载药天然高分子多糖生物粘附性微球。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，干燥后即得载药天然高分子微球。

另一种载药的方法是将微球浸入药物溶液中，通过扩散作用，将药物吸附、包裹在微球载体内。包封在微球载体中的治疗剂的量将随该药达到的治疗目的而改变。

最后再将制得的载药微球装入肠溶胶囊，即可得到口服剂型的生物大分子药物。另一种方法就是将载药微球再进行肠溶包衣。这样制得的生物大分子药物给药系统一方面可以避免胃腔内的低pH值环境，另一方面可以利用其很强的生物粘附性，吸附在肠道粘膜上，延长滞留时间，进而提高药物的生物利用度。

本发明制备的天然高分子多糖生物粘附性微球同现有的常见的微球药物载体相比，其明显的优点是：制备过程经济，对设备要求不高；制备出的微球具有生物相容性，可以生物降解；微球上活性基团多，易于修饰改性，可制备出具有不同表面性质的微球；制备的微球具有很强的生物粘附性，在进行口服给药时，可以提高药物的生物利用度；由于微球还含有聚卡波菲、几丁聚糖(或者几丁聚糖衍生物)作为药物吸收促进剂，促进生物大分子药物的传递、吸收，从而可以进一步提高药物的生物利用度。

具体实施方式

实施例1

取液体石蜡150ml，搅拌(n＝300rpm)同时进行加热，当温度上升到80℃时，加入10ml 15％(w/v)果胶溶液与10ml 1％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在80-90℃之间，搅拌10分钟后，加入浓度为2％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液5ml；加入20％的聚卡波菲溶液10ml。室温自然冷却，继续搅拌直至温度降到室温时停止。用石油醚、去离子水充分洗涤生成物，30℃干燥后即得多孔天然高分子多糖生物粘附性微球。微球粒径为0.95-1.30mm(＞80％)。

实施例2

取葵花籽油400ml，搅拌(n＝400rpm)同时进行加热，当温度上升到40℃时，加入10ml 30％(w/v)果胶溶液与20ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在40℃左右，搅拌20分钟后，加入浓度为3％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液10ml；加入10％的聚卡波菲溶液10ml。继续搅拌20分钟后加入1ml 0.025M的戊二醛。停止加热，交联反应1.5小时后停止。用乙醚、去离子水充分洗涤生成物，在20℃干燥后即得天然高分子多糖生物粘附性微球。微球粒径为0.86-1.00mm(＞80％)。

实施例3

取花生油300ml，搅拌(n＝300rpm)同时进行加热，当温度上升到50℃时，加入10ml 30％(w/v)果胶溶液与5ml 1.5％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在50℃左右，搅拌40分钟后，加入浓度为4％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液8ml；加入15％的聚卡波菲溶液12ml。继续搅拌20分钟后停止加热。用挥发性有机溶剂(如石油醚、乙醚、乙醇和异丙醇等)、去离子水充分洗涤生成物，再将微球在0.01M的环氧氯丙烷碱性溶液中(pH＝10)交联2小时，然后用挥发性有机溶剂、去离子水洗涤，在15℃干燥后得到交联的天然高分子多糖生物粘附性微球。微球粒径为0.98-1.42mm(＞85％)。

实施例4

取花生油200ml，搅拌(n＝300rpm)同时进行加热，当温度上升到40℃时，加入10ml 25％(w/v)果胶溶液与20ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，在混合溶液中加入BSA(牛血清白蛋白，模拟蛋白质药物)0.015g并搅拌均匀，温度保持在40℃左右，搅拌20分钟后，加入浓度为2％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液5ml；加入20％的聚卡波菲溶液10ml。停止加热，继续搅拌直至温度降到室温时停止搅拌。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，干燥后即得载药多孔天然高分子多糖生物粘附性微球。微球粒径为0.88-0.98mm(＞80％)。

实施例5

取液体石蜡150ml，搅拌(n＝300rpm)同时进行加热，当温度上升到80℃时，加入10ml 15％(w/v)果胶溶液与10ml 1％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在80-90℃之间，搅拌10分钟后，加入浓度为2％的几丁聚糖(或几丁聚糖衍生物)溶液5ml；加入20％的聚卡波菲溶液10ml。室温自然冷却，继续搅拌直至温度降到室温时停止。用石油醚、去离子水充分洗涤生成物，30℃干燥后即得多孔天然高分子多糖生物粘附性微球。微球粒径为0.95-1.30mm(＞80％)。将100mg微球浸入到1mg/ml的BSA溶液中，12小时后分离收集微球，即得到载药微球。