磷酸乙醇胺N－甲基转移酶基因及其应用

摘要

本发明构建了植物表达载体λ455，并以此载体构建了拟南芥的xΔNA表达文库。利用农杆菌介导转化拟南芥(Aραβιδоπσισ)，得到了一系列突变体。其中一个突变体表现为早衰、叶色淡绿以及雄性不育。通过基因克隆、序列测定和转基因分析，表明此基因是编码磷酸乙醇胺N－甲基转移酶пEAMT)的基因。该基因在表达水平上的抑制导致该突变体对高浓度盐、高温环境条件敏感，从而产生温敏型雄性不育性。该基因在植物抗盐、抗逆和利用雄性不育性配制杂交种子方面具有非常重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。进一步来说，本发明涉及植物表达载体λ455和正/反义植物表达文库的构建；涉及利用该技术体系克隆磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethano λamine N-methyltransferaseAtPEAMT)基因；涉及利用该基因提高植物抗盐能力和创造人工雄性不育农作物。

技术背景

盐胁迫条件下ΠEAMT的μPNA含量增加，酶活性能够增加10倍以上(1)。表明在盐胁迫条件下，植物需要大量胆碱的合成以满足植物在盐胁迫条件下对甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)的需要。作为一种渗透调节物质，有关甘氨酸甜菜碱在植物耐盐碱的研究已经非常深入(2-5)。但作为合成甜菜碱途径中的关键酶ΠEAMT及其基因ΠEAMT的功能研究较少。本发明采用特殊的植物表达载体利用正/反义表达系统首先得到该基因的突变体后，再利用突变体研究该基因的功能，相对于利用裂殖酵母功能互补的方法，更能够直接深入的研究植物基因的功能，同时根据突变体表型，能够发现该基因的新功能。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是利用一种新的植物表达载体和正/反义表达系统在模式植物拟南芥中得到突变体并克隆新基因。

本发明的另一个目的是通过该模式植物的突变表型以及同源基因的相关功能研究ΠEAMT基因及在植物耐盐碱和植物雄性不育上的作用。

本发明的又一个目的是将本发明的ΠEAMT基因转化植物(特别是具有重要生产应用价值的农作物)，培育出耐盐碱植物和创造新的雄性不育亲本，拓展杂种优势的利用。

为达到上述目的，实现本发明的具体技术步骤如下：

一、构建模式植物拟南芥χΔNA表达文库

如图一所示：利用质粒置换λΓEM-12的中间填充片段，得到λ455。λλ455质粒中含有XoλE1复制起始原点，编码βετα-λαχταμασε(BΛA)基因，籍此能够在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制和筛选。通过T-ΔNA，该载体能够将外源ΔNA片段整合插入到植物基因组中；两个串联的35∑启动子和NO∑终止子可使外源基因在转基因植物中高效表达；筛选标记基因新霉素磷酸转移酶(NΠT II)可甄别转基因植株的真伪。λ455中含有两个λοξ重复序列，能够在χρε蛋白的催化下进行位点特异性重组。在侵入菌株τρπX9830(λKX)(能够产生χρε蛋白)后，λ455能够环化生成可直接进行农杆菌介导的植物转化质粒。通过这个重组系统，得到λ455的χΔNA表达文库转化拟南芥。

二、产生正/反义表达的转基因植物及τ365的表型

构建拟南芥野生型χΔNA的λ455表达文库，大约得到～2×10⁶个重组体，经感染E.χολτρπX9830(λKX)后，收集χΔNA质粒文库并转化根癌农杆菌Γ3101(πMΠ90PK)。根癌农杆菌在固体培养基上生长3天，然后在液体培养基上28°X培养2小时，通过真空抽滤方法⁽⁶⁾转化拟南芥野生型植株。通过连续两代50μγ/Λ卡那霉素筛选，播种T2代种子观察表型。T3代种子分析并保留表型稳定遗传的株系。其中含有本发明涉及的突变体，命名为T365。其表型见附图2。

τ365突变体的遗传分析：通过对117个T2代植株的ΠXP检测，同时进行∑ουτηερνβλοτ鉴定，分离比例为88∶29符合预期的单位点插入比例(χ²＝0.0028；Π＞0.90)，分别播种观察含有T-ΔNA插入的野生表型τ365以及不含有T-ΔNA插入的野生表型τ365，含有T-ΔNA插入的突变体发生分离且分离比类似T1代转基因植株，没有T-ΔNA插入的野生表型植株后代均为野生型。上述结果表明τ365的突变表型是由于χΔNA的插入突变造成的。

三、基因克隆：(附图3)：

根据35∑启动子和NO∑终止子的序列设计引物，ΠXP反应可以扩增出插入到植物基因组中的χΔNA片段(附图3A)，或者利用质粒拯救的策略克隆T-ΔNA插入涉及的基因组序列。利用ΠXP扩增得到的χΔNA片段作探针，筛拟南芥的χΔNA文库，得到21个克隆，其中最长的克隆为1.457κβ含有22 A碱基的ΠολψA片段。5-PAXE和序列分析证明筛到全长χΔNA片段(图4)。比较χΔNA和基因组ΔNA的序列，发现τ365基因含有12个外显子，编码492个氨基酸，分子量为56.1KΔ。BΛA∑T分析拟南芥基因组中含有3个拷贝。同源序列分析表明τ365与菠菜中编码∑-αδενοσψλ-Λ-μετηοννε-πηοσπηοετηανολαμνεN-μετηψλτρανσφερασε

(ΠEAMT)蛋白具有86％的氨基酸同源性，证明τ365基因在拟南芥中编码磷酸乙醇胺N-甲基转移酶。Nορτηερν Bλοτ分析τ365突变体表型的产生是由于转入植物中的χΔNA片段与内源同源基因共抑制的结果。

功能研究表明：τ365突变体在盐胁迫条件下出现叶片漂白甚至死亡的现象。(图5)不同温度连续光照条件处理，τ365突变体表现温敏不育的表型。在20.条件下为可育，在26.条件下表现为雄性不育(图6)证明该基因与温敏雄性不育现象有关。构建含有突变体插入χΔNA片段的植物表达载体转化野生表型拟南芥得到雄性不育表型植株，证明τ365基因能够通过转基因技术得到雄性不育转基因植物。

我国目前存在人均耕地面积不断减少，土地盐碱化程度和面积不断增加的问题，同时大面积的沿海滩涂和盐碱化土壤闲置无用，耐盐碱种质的创造和品种的选育将有巨大的开发潜力。

随着杂种优势的不断利用，迫切需要解决杂种一代制种过程中人工去雄造成的成本高、效率低的问题。杂交水稻的成功关键在于光、温敏雄性不育系的筛选成功。基因工程技术的发展使得应用τ365基因可导致植物温敏雄性不育的功能在人工创造雄性不育转基因植物成为可能。

下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。

附图说明

附图1.植物表达载体λ455以及植物表达文库构建

附图2.T365基因突变体表型，其中(A)和(B)分别表示生长35的野生型对照和τ365突变体植株，τ365突变体表现叶色淡绿(B)；(X)和(Δ)分别表示生长40天野生型对照和τ365突变体的莲蓙叶，其中τ365植株表现早衰的现象(Δ)；(E)和(φ)表明野生型和τ365突变体植株开花结实的时期，其中τ365突变体果荚(φ)没有种子；(Γ)和(H)分别是野生型和突变体的花器官的放大图，(H)表明τ365植株雄性不育。

附图3.基因克隆策略(A)通过35∑和NO∑设计引物通过ΠXP即可扩增出插入的χΔNA片段。

(B)邻近T-ΔNA插入位点的基因组ΔNA可以通过质粒拯救方法分离。B，BαμHI；X，XλαI；H，HνδIII；P，EχοPI；∑，∑αχI；Ξ，ΞηολI.附图4.T365基因序列及编码氨基酸序列附图5. NαXλ胁迫条件下χολ-0野生型(A)和T365基因突变体(B)表型附图6.不同温度条件下χολ-0野生型(A)和T365基因突变体(B)表型附图7.同源比较拟南芥T365和菠菜ΠEAMT蛋白质

具体实施方案  1、植物表达载体λ455的构建用于构建的质粒：π∑E936⁽⁷⁾，πBλυεσχρπτII K∑(+/-)(Stratagene)，pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)，pUC118(BoehringerMannheim)，和pSS⁽⁸⁾。Bgl II(blunt ended)-Sal I(blunt ended)双酶切pSE936获得lox位点转入pBluescript II KS的EcoR V酶切位点，得到pJL420；EcoR I和Sac I酶切pBI101得到NOS终止子，连接到pJL420的EχοPI-∑αχI的酶切位点生成；用ΔNA聚合酶I的Kλενοω片段(Προμεγα)破坏的EχοPI酶切位点生成；经∑αχI-∑αλI(βλυντενδεδ)酶切，所得片段连接到到πYX118的∑αχI和∑μαI的酶切位点上生成经BαμH I-EχοPI双酶切替换BαμH I-EχοPI双酶切(来自π∑∑经Kλενοωφραγμεν(Πρoμεγα切去NοτI酶切位点)的片段生成；经NοτI线性化后与NοτI酶切的λΓEM-12(Προμεγα)连接生成χΔNA表达载体λ455。

用QuickPrep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)提取拟南芥Columbia野生型的地上部分，经TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)合成cDNA。用Wizard Lamda Preps DNA Purification System(Promega)制备λ455 DNA。50μΛ酶切体系，30单位的EχοPI，完全酶切4μγλ455ΔNA，经HKπηοσπηατασε(Eπχεντρε Tεχηνολογεσ)30°X水浴1小时脱磷处理，加入5μΛοφ3M NαAχ和110μΛ-20°X预冷乙醇，20°X保温，16,900γ离心，加入1μΛ70％乙醇清洗沉淀，吹干后悬浮在8μΛ TE缓冲液中。2μγ经EχοPI酶切，磷酸化处理的λ455ΔNA载体与15μΛχΔNA在25μΛ连接体系中过夜连接，经oneReady-To-Go Lamda Packaging Reaction System(Pharmacia)包装。

2、根癌农杆菌介导转化拟南芥λπηαγε感受态细胞(参照方法制备)，与1μΛ新制备的菌株τρπX9830(λKX)⁽¹⁰⁾在1μΛ ΛB培养基(含10μM MγXλ2)37°X共培养30分钟后，取150μΛ涂板(50μγμΛ^-1和50μγμΛ^-1κανκμψχν)，37°X培养过夜，悬浮于250μΛΛB(含和)培养基中，37°X摇床振荡培养1小时，用πολψετηψλενε γλψχολ提取纯化质粒ΔNA⁽⁹⁾。电激转化根癌农杆菌菌株Γ3101(πMΠ90PK)，用真空抽滤方法转化拟南芥Xολ-0野生型。植株转化前培养在1/3的B5培养基、23°X、连续光照条件下。转化植株(T₀)自花授粉后收到T₁种子，采用50μγμΛ^-1在1/2M∑培养基上筛选。抗的植株转移到土壤中单株收种得到T2代种子。

3、遗传分析与分子生物学鉴定

利用  35S-F₂(5’ACCACGTCTTCAAAGCAAGTG3’)和  NOS-R₂(5’TATGATAATC

ATCGCAAGACCG3’)片段作引物，提取突变体DNA进行PCR检测。反应条件如下：94°X变性3分钟，45个循环(94°X1分钟，58°X退火1分钟，72°X延伸1分钟)最后72°X延伸10分钟。同收ΔNA片段作探针，southern blot鉴定。T365 cDNA的5’端使用5’-RACE Kit(BoehringerMannheim)鉴定。采用的3个引物：SP₁(5’GTTTGTGAGCACTGGTGGAC3’)、SP₂ 5’TGGCCAAAGACACGCTCATAG3’)、P3(5’GACATAAGCTCCAATGCACTTG3’)。克隆PCR产物于pBluescriptII SK(+)(Stratagene)载体，用37 3A DNA测序仪和ΔψEναμχΔρεχτδΓTΠ∑εθυενχνγKτ(Aμερσηαμ)测序。为验证τ365是否与突变表型共分离，利用T-ΔNA载体引物35∑-Ф₂和T365χΔNA片段特殊引物T365-R(5’GATGAGAA-CTTTACCTCCCG3’)PCR扩增突变体基因，构建植物表达载体再转化拟南芥Xολ-0野生表型植株，在T1、T2代得到τ365的表型证明突变表型与τ365基因有关。提取植物基因组ΔNA与PNA，常规σουτηερν和Nορτηερν βλοτ鉴定突变基因的转录和表达的情况。

4、播种Xολ-0和τ365突变体，在连续光照((80το 120μE μ^-2 σεχ^-1)，20°X、23°X、26°X条件下分别培养，观察雄性不育表型。结果表明20°X条件下突变体可育，26°X条件下突变体完全不育，该基因受温度诱导。

5、播种Xολ-0和τ365突变体于同一个营养钵中，喷施50μM、100μM、200μM、400μM、500μM浓度的NαXΛ，观察表型并照相。试验结果显示低浓度(50μM)NαXΛ即可诱导明显的表型差异，突变体叶片漂白死亡。该基因在表达受到抑制时，突变体明显不耐盐碱。该基因与盐逆境有关。

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