基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体及其用途

摘要

一种基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体,它的结构为:序列特征:长度:684bp,类型:核酸,链数:双链几何结构:线性;分子类型:DNA(基因组);来源:阳性克隆的可变区分别属于人抗体VH5和Vλ1亚群;含有载体的宿主分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、CGMCC、No.0542。基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体用于检测病人血清地高辛浓度的应用,用于地高辛中毒的病人以拮抗地高辛所引起的毒性作用。

说明书

本发明涉及一种由基因工程制备的人单克隆抗体，更准确地说，是一种涉及从半合成噬菌体抗体库中克隆的、由人抗体重链可变区及轻链可变区通过一接头连接而组成的、用于检测病人血清地高辛浓度及解救病人地高辛中毒的人单克隆抗地高辛单链抗体。

地高辛是一种被广泛用于治疗充血性心力衰竭及某些心律失常的强心甙。由于地高辛的治疗指数狭窄，用药过量与用药不足时的症状相似，加之其个体差异大，故中毒的发生率高，是临床上最难掌握药物之一；在误服地高辛或由于企图自杀而大量吞服地高辛时可发生致命性的地高辛中毒，目前解除其毒性的最有效的方法是应用由地高辛免疫羊而制备的多克隆抗地高辛抗体的Fab片段。此外，采用抗地高辛抗体的免疫分析法监测血清/血浆地高辛浓度已成为当今治疗性药物监测的典范。监测血清地高辛浓度可为临床提供资料以便调整用药剂量及确定病人对药物的顺从性，另外可确定地高辛中毒时解毒剂的用量。测定血清地高辛浓度，尚可提供其不同个体间生物利用度及药效学差异方面的信息，目前被广泛用于判断地高辛中毒及指导临床用药，对于保证其治疗的有效性及安全性具有重要意义。

根据文献1“地高辛特异性抗体”(Bulter VP，Chen JP.Digoxin-specificantibodies.Proc Natl Acad Sci 1967；57：71-78)中记载，于1967年通过免疫动物成功地制备抗地高辛抗体以来，已相继制成了地高辛特异的血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体，在检测血清地高辛浓度及解救由于应用地高辛治疗时所引起的中毒特别是在误服地高辛或由于企图自杀而大量吞服地高辛所引起的致命性的地高辛中毒中发挥了重要作用，关于这一点，在文献2“放射免疫分析法测定血清地高辛浓度及中毒浓度”(Smith TW，Bulter VP，Haber E，etal.Determination of theraputic and toxic serum digoxin concentrations by byradioimmunoassay.N Engl J Med 1969；281：1212-1216)文献3“免疫方法处理中毒”(Rollins DE and Brizgys M.Immunological approach to poisoning.Ann EmergMed 1986；15：1046-1051)中有记载。但这些抗地高辛抗体有下列缺点：(1)由于均源自动物，作为异种蛋白用于人体时可引起免疫反应，既可导致过敏反应，又影响治疗效果，在重复用其治疗地高辛中毒时所产生的不良反应更为严重；(2)由于其分子较大，与地高辛结合后所形成的复合物不易经肾脏排除，既不利于地高辛从体内排除，又由于地高辛在体内滞留的时间长而易与血浆蛋白结合，有可能诱导人体产生抗地高辛抗体进而对地高辛产生封闭作用，使病人对地高辛的敏感性下降，需要加大地高辛的用量方可达到治疗效果，这样又极易发生地高辛中毒；(3)制备复杂、周期长，虽已有商品化的多克隆抗地高辛抗体Fab片段产品，但价格昂贵，使得国内外医院中作为地高辛中毒解毒药的抗地高辛抗体普遍储备不足甚至缺乏；(4)虽然已有应用鼠源性单克隆抗地高辛抗体测定血清地高辛浓度的报道，但尚未见用于治疗地高辛中毒，参见上述文献2“免疫方法处理中毒”及文献4“目前临床上常用的解毒剂”(BowdenCA and Krenzelok EP.Clinical appliccations of commonly used contemporaryantidotes.Drug Saf 1997；16：9-47)。由于人源性单克隆抗地高辛抗体无免疫原性，用于人体时不存在上述抗地高辛抗体所引起的不良反应，可重复用于治疗地高辛中毒，加之其小分子抗体如单链抗体具有清除速度快、组织穿透力强及半衰期短等优点，故是治疗地高辛中毒的理想制剂，但由于用抗原免疫人体存在着伦理学问题，也就说不能随意用抗原免疫人体，故其制备困难，参见文献5“人单克隆抗地高辛抗体的分离及其特点”(Ball WJ，Kasturi R，Tabet M，etal.Isolation and characterization of human monoclonal antibodies to digoxin.JImmunol 1999；163：2291-2298)因此，若能不经免疫制备廉价的人抗地高辛单克隆抗体特别是其小分子抗体如仅由抗体重链可变区及轻链可变区通过一接头组成的单链抗体，则有可能克服目前抗地高辛抗体的不足。

迄今为止，用于检测病人血清地高辛浓度及治疗地高辛中毒的抗地高辛抗体均源自动物，用于人体时可引起免疫反应，既可导致过敏反应，又影响治疗效果，另外由于其分子较大，可延缓地高辛从体内排除，加之价格昂贵，大多数医院中储备不足，故其实际应用极为有限参见上述文献1、2、3、4。小分子的人源性单克隆抗地高辛抗体的获得是解决上述问题的有效方法，但其制备困难，参见上述文献5。在文献6“采用噬菌体表面呈现技术制备抗体”(WinterG，Griffith AD，Hawkins RE，et al.Making antibodies by phage display technology.Annu Rev Immuno 1994；12：433-455)中记载着通过噬菌体抗体库技术可不经免疫制备单克隆抗体，这样，使得制备地高辛特异性人单克隆抗体成为可能。

本发明的目是从半合成噬菌体抗体库中，不经免疫克隆仅由抗体重链可变区与轻链可变区通过一接头相连接而组成的小分子的人抗地高辛单链抗体，旨在提供价格低廉的适于临床上解救地高辛中毒及采用免疫分析法检测病人血清地高辛浓度的人源性单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：这种基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体结构为：

(a)序列特征

   长度：684bp；重链可变区为117个氨基酸残基，轻链可变区为111个氨基酸残基

   类型：核酸

   链数：双链

   几何结构：线性

(b)分子类型：DNA(基因组)

(c)来源：阳性克隆的可变区分别属于人抗体VH5和Vλ1亚群

(d)序列描述：人抗地高辛抗体的重链和轻链可变区DNA分子和氨基酸序列为：

VH为重链可变区，VL为轻链可变区，下列线处为CDRS，

其中，所述人抗地高辛抗体的重链和轻链可变区DNA分子还可以是其衍生物，或是人抗地辛抗体重链可变区、轻链可变区所形成的互补链及杂交DNA分子，且具有至少部分或全部人抗地高辛单链抗体生物活性；所述的氨基酸序列可以是人抗地高辛单链抗体DNA分子的表达产物的氨基酸序列的变异，并有至少部分或全部的人抗地高辛单链抗体的生物活性。

在本发明中，所述基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体为含有所述DNA分子的质粒或病毒载体，含有所述载体的宿主分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、CGMCC、No.0542。

由所述的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的病毒载体，转化或转染的原核宿主细胞，真核宿主细胞、或宿主细胞，所述原核宿主细胞为大肠杆菌，所述真核宿主细胞为哺乳动物细胞或酵母细胞，所述宿主细胞为植物细胞。

所述的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的用途，所述基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体用于检测病人血清地高辛浓度的应用，用于地高辛中毒的病人以拮抗地高辛所引起的毒性作用。

所述的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的制备方法，可以通过人工合成得到所述的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的DNA分子，并且具有至少部分或全部的人抗地高辛单链抗体的生物活性。

本发明的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗抗体是通过下述方法制备的。

(1)采用过碘酸氧化法制备地高辛-牛血清白蛋白偶联物。

(2)以固相化的地高辛-牛血清白蛋白偶联物对半合成噬菌体单链抗体抗体库进行筛选，通过ELISA筛选出能结合地高辛的抗体克隆并鉴定其活性，通过ELISA竞争抑制实验分析其特异性，对阳性克隆的DNA用PCGENE软件进行序列分析和同源性进行比较。

(3)提取上述阳性克隆质粒、转化HB2151菌株感受态后，表达可溶性抗地高辛单链抗体，通过ELISA鉴定可溶性抗地高辛单链抗体的表达情况及其活性，通过ELISA竞争抑制实验分析其特异性。

(4)通过ELISA竞争抑制实验鉴定抗地高辛噬菌体抗体及可溶性抗地高辛单链抗体与地高辛类似物及地高辛活性代谢产物的结合活性。

实施例

1地高辛-牛血清白蛋白偶联物的制备

按照文献7“通过噬菌体呈现的抗地高辛抗体随机突变分析抗体重链互补决定区1(CDP1)在其地高辛结合活性的作用”(Huston JS，Levinson D，Hunter MMet al.Protein engineering of antibody biding sites：Recovery of specific activity in ananti-digoxin Fv analogue produced in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA1988，85：5879-5883)进行制备，具体方法：(1)第1天，在室温下将100mg地高辛悬浮在4.6ml无水乙醇中；向其中滴加4.6ml 0.1mol/L过碘酸钠，磁力搅拌25min；向其中加入0.6ml mol/L乙烯乙二醇；5min后，在磁力搅拌下，将上述反应混合物滴加至4.6ml 2.8％牛血清白蛋白水溶液中(提前用0.09ml 5％ K₂CO₃将pH调至9.5)并进行磁力搅拌，向其中滴加0.46ml 5％ K₂CO₃使pH维持在9.0～9.5的范围；45min后pH稳定，加入4.6ml新配制的1.5％硼酸钠；3h后加入1.7ml 1mol/L的蚁酸将pH调至6.5，1h后加入0.34ml 1mol/L NH₄OH将pH提高至8.5，全部反应混合液在37℃对冷水透析过夜。(2)第2天向上述反应混合液中加入0.48ml 0.1mol/L HCI，将pH从6.85调至4.5，在室温下放置1h及4℃放置4h后大部分蛋白质沉淀；将上述悬浮液在4℃下离心(1,000×g，1h)，弃上清液；将沉淀用1.15ml 0.15mol/L NaHCO₃溶解。(3)第3天至第6天：对冷水透析4天。最后将所获产品分装冷冻干燥，-20℃保存备用。

2、抗体库的筛选

将地高辛-牛血清白蛋白偶联物以0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释到50μg/ml，取2ml包被Immuetube(丹麦NUNC公司)，4℃过夜。次日以3％牛血清白蛋白37℃封闭1h后加入0.5ml噬菌体抗体库液(约1013cfu，以1％牛血清白蛋白按1∶4稀释)，室温下静置90min后以0.05％Tween-PBS及PBS分别洗涤(第一轮各10次，以后各20次)，加入1ml 0.1mol/L三乙胺，室温下洗脱10min，然后加入0.5ml 1mol/L pH7.4 Tris-HCI中和，取0.25ml加0.75ml1.5％牛血清白蛋白在另一支Immuetube中37℃孵育30min去除非特异结合的克隆，取上清加入9ml对数增殖期的新鲜TG1菌液37℃感染30min，，取少许铺盘测定回收率，其余细菌加入9.5ml含1％葡萄糖和30μg/ml氨苄青霉素(Amp)的2YT培养液，37℃培养1h后，补加Amp至100μg/ml，37℃培养1h，加入0.5ml VcsM13 37℃孵育30min超感染，然后离心弃上清液，将沉淀重悬于50ml 2YT(含50μg/ml Amp及18μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜，次日收集上清制备次级库进行下一轮筛选。如此筛选共重复4次。并且测定每轮吸附前抗体库的滴度和洗脱回收的滴度，计算回收率，发现回收率逐轮增高，结果显示在对抗体库的筛选过程中有明显的富集。

3、阳性抗地高辛噬菌体抗体的获得  随机挑取40个第3轮和第4轮所获单克隆集落制备噬菌体抗体后，先用用ELISA测定其与地高辛-牛血清白蛋白偶联物的结合，共得到22个阳性克隆；再用人心肌肌凝蛋白重链、人皮肤角蛋白及牛血清白蛋白等无关抗原检查其特异性，其中有1个克隆能特异性地结合地高辛-牛血清白蛋白偶联物，即获得了一株可结合地高辛的阳性克隆。

4、抗地高辛噬菌体抗体的制备

将上述一株可结合地高辛的阳性克隆，接种到2ml含1％葡萄糖的Amp-2YT中，37℃培养过夜，吸取30μl过夜菌液转种到2ml Amp-2YT中，37℃培养1h后加入30μl辅助病毒，30℃培养过夜，离心收集上清，即得到噬菌体抗体，4℃保存备用。

5、可溶性抗地高辛单链抗体的制备

用噬菌体抗体表达质粒转化HB2151，铺Amp-TYE盘，37℃培养过夜，挑取单个菌落，接种到2ml含1％ GS的Amp-2YT中，37℃培养过夜。取30μl过夜菌液转种到Amp-2YT中，37℃培养至A600≈0.2时加入IPTG至1mmol/L，30℃培养过夜，离心收集上清，即得到可溶性的单链抗体，4℃保存备用。

含有包括所述DNA分子的载体的宿主已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)进行保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、CGMCC、No.0542。

6、通过ELISA检测

6.1噬菌体抗体的检测  将地高辛-牛血清白蛋白偶联物、人心肌MHC、人皮肤ker及牛血清白蛋白以1μg/ml包被ELISA板，50μl/孔，1％牛血清白蛋白封闭后加入经等量1％牛血清白蛋白稀释的待测噬菌体抗体液，孵育洗涤后以HRP-抗M13着染，OPD底物显色，测定A492。

6.2可溶性抗地高辛单链抗体的检测  同上包被ELISA板，1％牛血清白蛋白封闭后加入可溶性单链抗体，孵育洗涤后，加入9E10单抗，再孵育洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG着染，OPD底物显色，测定A490。

6.3竞争抑制性ELISA(1)将地高辛-牛血清白蛋白偶联物包被ELISA板，1％牛血清白蛋白封闭后，加入抗地高辛噬菌体抗体(25μl/孔)，分别加入下列抑制剂：地高辛、digitoxin、digitoxigenin、lanatoside C、oubain或acetylstrophanthidin[以乙醇/水(3/1)稀释，其最终浓度为为100μg/ml]，按1∶10～1∶1010稀释后加入(25μl/孔)。同时将乙型肝炎表面抗原包被ELISA板，加入抗乙型肝炎表面抗原噬菌体抗体(Fab)(25μl/孔)，同上加入抑制剂，作为系统对照。最后按上述检测噬菌体抗体的方法进行ELISA。(2)同上包被ELISA板(50μl/孔)，1％牛血清白蛋白(200μl/孔)封闭后，分别加入待测的可溶性单链抗体(25μl/孔)，同上加入地高辛、digitoxin、digitoxigenin、lanatoside C、oubain或acetylstrophanthidin，按前述检测可溶性单链抗体的方法进行ELISA。

7、通过ELISA的检测结果

7.1可溶性抗地高辛单链抗体的表达及检测结果

上述的阳性克隆质粒、转化HB2151菌株感受态以表达可溶性抗地高辛单链抗体，通过ELISA对表达的可溶性抗地高辛抗体的活性及特异性所进行的检测结果显示，经转化的HB2151菌株能成功地表达可溶性抗地高辛单链抗体并将可溶性抗地高辛单链抗体分泌至细胞培养基及宿主菌的周质腔中，所表达的可溶性抗地高辛单链抗体只与地高辛-牛血清白蛋白偶联物发生特异性结合，而不与人心肌肌凝蛋白重链、人皮肤角蛋白及牛血清白蛋白等无关抗原发生结合。

7.2 ELISA竞争抑制实验

在以地高辛-牛血清白蛋白偶联物包被ELISA板，以游离的地高辛作为竞争抗原所进行的ELISA竞争抑制实验显示，游离的地高辛可产生与剂量相关的抑制效应，而无关抗原氨鸟嘌呤则不能抑制抗地高辛噬菌体抗体及其可溶性单链抗体与地高辛-牛血清白蛋白偶联物的结合。

7.3抗地高辛噬菌体抗体及其可溶性单链抗体对地高辛类似物及地高辛活性代谢产物的反应

在以地高辛-牛血清白蛋白偶联物包被ELISA板，以游离的地高辛、digitoxin、digitoxigenin、lanatoside C、oubain及acetylstrophanthidin作为竞争抗原所进行的抑制性ELISA实验的结果显示，除oubain对地高辛与抗体的结合抑制率很低外，其它地高辛类似物及地高辛的活性代谢产物(digitoxigenin)均可产生较明显的与剂量相关的抑制效应，表明抗地高辛噬菌体抗体及其可溶性单链抗体能与地高辛的活性代谢产物及大多数地高辛的类似物发生不同程度的交叉反应。而以乙型肝炎表面抗原包被ELISA板后所进行的对照实验显示，地高辛、地高辛的类似物及地高辛的活性代谢产物不影响抗乙型肝炎表面抗原噬菌体抗体(Fab片段)与乙型肝炎表面抗原的结合。

8、DNA序列分析测定

由上海博亚生物技术有限公司完成DNA序列测定。用PCGENE软件进行序列分析和同源性进行比较。

根据测定DNA序列分析表明，阳性克隆的可变区分别属于人抗体VH5和Vλ1亚群。人抗地高辛抗体的重链和轻链可变区DNA和氨基酸序列见前述DNA分子和氨基的序列图。

在文献7“抗体结合位点的蛋白质工程：大肠埃希氏菌产生的抗地高辛抗体可变区类似物活性的恢复”(Huston JS，Levinson D，Hunter MM et al.Proteinengineering of antibody biding sites：Recovery of specific activity in an anti-digoxinFV analogue produced in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA 1988，85：5879-5883)，报导已有根据抗地高辛抗体的氨基酸序列人工合成了具有相应序列的基因并成功地表达了具有抗地高辛抗体。在文献8、9“采用细菌表面呈现技术进行抗体亲和力成熟”(Daugherty PS，Chen G，Olsen MJ，et al.Antibodyaffinity maturation using bacterial surface display.Protein Eng，1998，11(9)：825-32])、(Short MK，Jeffrey PD，Kwong RF，et al.Contribution of Antibody HeavyChain CDR1 to Digoxin Binding Analyzed by Random Mutagenesis of Phaged-dispayed Fab 26-10.J Biol Chem 1995；270：28541-28550)，报导了通过突变的方法获得了具有不同亲和力及特异性的抗地高辛抗体，因此，通过上述技术可对本发明的获得的阳性的抗地高辛单链抗体进行改造，所以本发明的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的DNA分子还可以是人抗地高辛抗体重链可变区、轻链可变区所形成的互补链及杂交DNA分子，或是人抗地高辛抗体的重链和轻链可变区DNA分子的衍生物，即具有人抗地高辛单链抗体的生物活性的类似物的DNA分子。以及对抗地高辛单链抗体DNA分子的表达产物的氨基酸序列进行变异，并具其至少部分或全部的人抗地高辛单链抗体的生物活性。通过文献8、9的技术，可以通过人工合成得到所述的基因工程人单克隆抗地高辛单链抗体的DNA分子，并且具有至少部分或全部的人抗地高辛单链抗体的生物活性。

在文献10“快速地从大肠埃希氏菌制备重组抗地高辛单链抗体”(BurksEA，Iverson BL.Rapid，high-yield recovery of a recombinant digoxin binding singlechain Fv from Escherichia coli.Biotechnol Prog，1995，11(1)：112-4)报导了通过不同的表达方式如在包函体以及不同的表达载体及宿主细胞可提高表达量。因此，可以采用上述方法提高本发明获得阳性的抗地高辛单链抗体的表达量。