微生物同步发酵正十四烷生产十二烷1,12－二羧酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用微生物同步发酵正十四烷(nC

说明书

本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产α，ω-二元酸的方法，尤其是发酵正十四烷(nC₁₄)高产十二烷1，12-二羧酸(DC₁₄)的方法。

C₁₀以上的长链二元酸是化工合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档热溶胶、高温电介质、高级油漆和涂料、润滑油添加剂、耐寒性增塑剂、树酯、医药和农药的重要原料。尤其是十二碳二元酸(DC₁₂)和十四碳二元酸(DC₁₄)，它们分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。

如果说DC₁₂还可以丁二烯为原料，在高温高压催化剂条件下，经过九个步骤进行合成，那么，DC₁₄化工上至今还没有经济可行的合成方法。微生物学家应用生物工程技术，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下，发酵石油中的正十四烷一步加上四个氧原子，生成十四碳二元酸，弥补了化工上的不足，开辟了DC₁₄的新来源。

在二十世纪七十年代以前，各国科学家对微生物发酵生产长链二元酸的研究，只处于理论研究阶段；从七十年代开始，进入应用研究阶段；八十年代进入小规模工业生产阶段，1984年日本建成年产200吨二元酸的生产工厂；九十年代以来，中国培育出一批新的高产突变株，通过代谢调控研究，使DC₁₂发酵产酸水平达到170-200g/L，最多达到208g/L。1999年在山东淄博建成年产1000吨二元酸的生产工厂，成为一种新兴的绿色化学工业，为香料和尼龙工程塑料及其助剂行业提供了丰富的物美价廉的原料。

九十年代以来，出现了几个有实际生产价值的专利文献：中国专利87105445.0，用-株热带假丝酵母突变株UH-3-9，高产DC₁₆，在16升自控罐中发酵5天，DC₁₆为123g/L；CN 1046757A，用一株热带假丝酵母突变株NP-260，高产DC₁₇，在16升自控罐中，发酵6天，DC₁₇为133g/L；CN 1092108A，用一株热带假丝酵母突变株NP-6-126，高产DC₁₅，在2.5m³通用式发酵罐中，发酵6天，DC₁₅为178g/L；CN 1130685A，用一株热带假丝酵母UH-2-48突变株，生产DC₁₂，在3m³发酵罐中，发酵5天，DC₁₂为145g/L；中国专利ZL97103876.7，用一株热带假丝酵母突变株P-12-242，高产DC₁₃，在2.5m³发酵罐中，发酵161小时，DC₁₃为205g/L。中科院微生物所陈远童等以UH-2-48突变株为出发株，经过反复诱变，培育出一株高产DC₁₂的新的优良生产突变株HP-12，在20m³发酵罐中，发酵160小时，DC₁₂达到200g/L，最高为208g/L。

对DC₁₄的研究，报道的不多，专利申请号98121084，公开号1257126的文献，报道一株热带假丝酵母突变株PF-UV-56，发酵生产DC₁₄，120小时，DC₁₄为148g/L。

本发明所用的菌株为热带假丝酵母(candida tropicalis)NP-6-5，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980)为出发菌株，通过紫外线和亚硝酸的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C₁₁-C₁₈的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十四烷(nC₁₄)，高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母NP-6-5(以下简称NP-6-5)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.0669。

NP-6-5的生理特征如下：

一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，a-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。

三、生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。

四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，雄果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：

在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭园细胞。

本发明的种子培养基：

(1)、10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)、10个巴林的麦芽汁液体培养基；

(3)、烷烃种子培养基包含：KH₂PO₄6-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蜡40-70mL/L，自来水配制，自然PH。

培养种子的过程为：取一接种环NP-6-5酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7mL培养基，放成斜面)，于28-30℃培养40小时。各取一支上述培养好的NP-6-5菌种分别刮入装有25mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃，220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或10L罐发酵种子。

用本发明的NP-6-5菌株生产长链二羧酸，特别是十四碳二羧酸的具体方法是：把发酵的种子接入PH5.5-9.0，最好为6.5-7.5的含有15-45％(V/V)的C₁₁-C₁₈的正烷烃和85-55％(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐6-14g/L，最好为7-10g/L，氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好为3-5g/L，玉米浆0.5-3g/L，尿素0.5-2.5g/L最好为1.0-2.0g/L，硝酸盐5-15g/L，最好为6-12g/L，蔗糖10-30g/L，最好为15-25g/L，VC为0.05-0.3g/L，最好为0.08-0.15g/L，消泡剂为0.4-1.2g/L以及一些其他公知的营养源，在PH5.8-7.5之间将上述混合物在25-32℃，最好在27-31℃通气发酵48-170小时。28小时内，PH控制在6.8以下，以菌体生长为主，产酸为付，此时菌株生长光密度OD达到0.5左右，产酸达到20-30g/L，在28-60小时，PH控制在7.5以下，产酸为主，菌体生长为付，此时OD达至0.7左右，产酸达到75-85g/L，从60小时以后，每隔6-8小时用NaOH溶液调一次PH至7.5-8.5，菌体量不再增加，而产酸量继续迅速增加，然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时，混合液中正烷烃含量为10-20％(V/V)，以后在适当时间补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)为准。碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄，NaH₂PO₄ K₂HPO₄和Na₂HPO₄中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。

发酵结束后，加入适量的水，加碱至PH10-12，加热至85-90℃进行破乳分层，上层为残油，回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤或离心，合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃，脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至60-70℃，加HCL或H₂SO₄至PH3-4进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，用空气吹干，60℃烘干，得白色十四碳二羧酸结晶。

用本发明的NP-6-5菌株和发酵方法，可以生产C₁₁-C₁₈的各种单一和混合二羧酸。其中在10升自动控制罐中，从正十四烷发酵生产十四碳二羧酸，发酵6天，产酸量高达201g/L，后处理总收率达到80％，纯度达到96％以上。

                     实例一

(1)、取一接种环NP-6-5菌种，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。

(2)、取上述菌种一支，接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中于30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时。烷烃种子培养基中KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3g/L，蔗糖10g/L，尿素3g/L，重蜡50mL/L，自来水配制，PH5.0。

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述种子液，在220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小

时用NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基含KH₂PO₄ 8g/L，酵母膏2g/L，玉米浆3g/L，氯化钠1.0g/L，尿素1.3g/L，VC0.12g/L，正十四烷200ml/L，泡敌0.5g/L，KNO₃7g/L，自来水配制，PH7.5，在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后用HCl调PH至3，用100ml乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二羧酸含量。结果DC₁₄产量为87.2g/L，经气相色谱分析，DC₁₄纯度为97.4％。

                     实例二

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₂，结果DC₁₂的产量为80g/L，纯度为98.1％。

                     实例三

按照实例1的方法，只是正烷烃用nC₁₇结果DC₁₇的产量为70.5g/L，纯度为97.6％。

                     实例四

按照例1的方法，只是正烷烃用nC₁₆，结果DC₁₆的产量为75.2g/L，纯度95.5％。

                     实例五

种子培养基和培养方法同实例一，发酵培养基同实例一。把培养两天，经镜检无杂菌的1.2L NP-6-5种液接入装有6L发酵培养基，其中nC₁₄1.2L，经121℃灭菌40分钟的10L自控罐中，29℃，600转/分，罐压0.8Kg/Cm²，通气量1：0.8，28小时以前，PH控制在6.8以下，28-60小时，PH控制在7.5以下，60小时后每隔8-6小时，用NaOH溶液调一次PH至7.5-8.5，从第三天开始，每天补加正十四烷1L，共3次，发酵6天多(161小时)，发酵清液中十四碳二羧酸含量为201g/L。发酵结束后，加入自来水，加热至80℃，加碱调PH至11，静置分层，放出上层残油，回收使用，下层菌层通过压滤，除去菌体，滤清液与中层清液合并，加入0.7％活性炭，90℃脱色15分钟，压滤除去活性炭，脱色滤清液加水至DC₁₄浓度为4％，加热至70℃，加入浓H₂SO₄酸化至PH3，冷却降温至30℃左右，压滤，抽干，固形物在60℃烘干，得白色DC₁₄，转化率82％，纯度为97.8％。