丙酸菌在结肠中生产丙酸和/或丙酸盐的用途

摘要

本发明涉及根据低自溶和耐胆盐倾向选择的丙酸菌在制备可由人或动物吸收的最新食品组合物或药膳组合物中的用途,以这样一种方式制备的组合物使所述细菌至少部分很好地耐胃液酸度,该组合物含有至少10

说明书

本发明涉及丙酸菌以最佳方式在结肠处产生丙酸和/或丙酸盐且根据具体情况可以是乙酸和/或乙酸盐的用途。

近年来，营养专家建议他们的患者接受可产生有益于健康的生理和代谢作用的富含纤维的食物。

已知食物纤维耐小肠中的酶消化且仅在结肠处、即肠末端部分被降解和同化。因此，如果这种降解和这种同化作用在结肠这一末端前位置尽可能完全，那么才能够发挥上述有益作用。

能够确定这些生物反应是在结肠中微生物的作用下由食物纤维的厌氧发酵所导致的。这种发酵在产生短链脂肪酸类、氢、二氧化碳和生物质中达到高峰。

这些短链脂肪酸类主要是乙酸、丙酸和丁酸；它们在健康生物体中仅能够在结肠处产生，这是因为结肠是允许在上述物质合成基础上发酵的严格厌氧条件普遍存在的人体中的唯一位置，但不包括可以在肝区产生的极小量的乙酸。

不同的研究已经证实了这些有益于健康的短链脂肪酸类的重要性。

根据文献可以看出这三种短链脂肪酸的生理作用彼此不同：实际上，乙酸和丙酸直接定向于肝脏，其中全部丙酸被代谢，同时部分乙酸定向于不同组织，而丁酸更特别地用在结肠壁内。

因此，短链脂肪酸类的合成意味着一方面在结肠中存在基于纤维的易于通过食物产生的底物而另一方面存在以最佳和恒定方式出现的平衡和适应的菌群。

这种菌群可能来源于每个个体的连续的内源性菌群或来源于膳食。

实际上，众所周知的是对每一个体具有特异性且约相当于消化性转化过程中1-1.5kg食物的人消化道内含物中含有显著的微生物群体，它们由估计在结肠中可能有10¹¹-10¹²个细胞/克的大量种类的混合物组成；这种群体构成了一定重量的细菌团，仅通过目前简单的膳食难以完全且尤其是持久地改变细菌团的好或差的平衡。

然而，每天摄取的食物决不可能是无菌的且由此或多或少带有细菌(奶、发酵的奶产品、干酪、苹果汁、葡萄酒、啤酒、肉类等)。虽然如此，改变结肠菌群作为吸收这些细菌的结果可能仅是暂时性的。

还应注意的是已经提出尝试通过给予且特别是自愿摄取被认为是有益于健康的细菌细胞(称作益生菌)、尤其是乳酸菌或双歧杆菌来改变胃肠道中的微生物群体。

已经提出通过特定的膳食或通过直接摄取这些微生物细胞而将这些细菌的有效群体导入生物体，更具体地说是为了限制致病和腐败菌种的增长；实际上，已知存在于结肠中的内源性菌群被分成不同的细菌菌群，它们中的某些是无害的且实际上是有益的，而其它种类、特别是梭状芽孢杆菌属和腐败菌种可产生毒性物质且对健康具有负面影响。

本发明所基于的设想由下列步骤组成：通过口服途径定期将有效量的能够有利于短链脂肪酸类在结肠处正规合成的益生菌微生物菌群导入生物体。

在可以用于这种作用的微生物种类中，乳酸菌并非完全适合，因为根据其性质，它们首先且在最初产生乳酸且随之产生乙酸而既不产生丙酸也不产生丁酸。

相反，另一种类型的细菌丙酸菌能够产生大量的丙酸和乙酸，这两种短链脂肪酸是冲洗组织网状构造所需的，例如产生2/3比例的丙酸-1/3比例的乙酸。这些细菌存在于熟压干酪中；此外，它们比乳酸菌具有便于在结肠中产生良好活性的优点，其中总体是厌氧生活且还能够比乳酸菌和双歧杆菌更耐工艺压力。

应注意文献中已经提出了为特别刺激双歧杆菌的发育使得丙酸菌在肠中吸收(文件WO 97/19689)或在人或底物消化道中释放一氧化二氮(文件WO 98/27991)。然而，到目前为止从来没有提出过使用这些细菌在结肠中产生短链脂肪酸类的设想。

因此，本发明涉及根据不很自溶的性质和耐胆盐的能力的功能选择的丙酸菌在制备可由人或动物吸收的最新食品组合物或膳食或药物组合物中的用途，所制备的组合物使所述细菌至少部分耐胃液酸度，该组合物含有至少10⁶个细胞/克所述细菌，这些细菌能够在结肠处通过厌氧细菌发酵显著刺激和增加丙酸和/或丙酸盐、且根据具体情况可以是乙酸和/或乙酸盐的合成。

为了使这些细菌应具有所预计的有益作用，选择不很自溶的能够达到结肠而不会产生损害、在此处能够发育并产生足量丙酸的菌株是必不可少的。

众所周知所摄取的细菌在其通过消化道上部过程中所经历的两种主要压力一方面与胃环境的酸度有关(pH4-1)，而另一方面与小肠中存在的胆盐有关(在十二指肠处至多约为15mmol/l)。

已经证实能够确定接触胃酸的细菌弱化且由此不能够抵抗胆盐，即使它们仍能够在胃的出口保持存活。

因此，根据本发明，必须使丙酸菌经过一种类型的处理，这种处理能够使得它们经历通常相当于“包裹”这样的胃部的逆境(stress)，所述的包裹例如就干酪类型的食品而言可能是自发的或非自发的。

因一种用于评价酸性pH和胆盐依次或分别对丙酸乳菌的两种菌株的存活力的影响的试验而给上述这种情况带来了光明，所述的丙酸乳菌的两种菌株属于LRTL(Laboratoire de Recherches de TechnologieLaitière-Rennes的INRA)的TL保藏中心，即属于P.freudenreichii种的亚种shermanii的菌株TL 162和TL 24。

如下描述该试验的结果。

在30℃下的YEL培养基中将细菌培养2天(稳定期的开始)。在650nm下对TL 162和TL 24测定的光密度分别为2.28和2.64。

-酸性逆境

将培养物按1/10稀释入pH2.5下的S培养基(胰蛋白胨-乳酸盐)(最终pH3.0)。在37℃下保温45分钟后，将培养物离心并使细菌溶于相同体积的YEL。在保温前和保温结束时进行计数且随后在37℃下对重新开始的生长测定DO、持续5天。

-胆汁逆境

将起始的培养物离心并使细菌溶于10倍以上体积的含有0.3％牛胆汁(~50％胆盐)的YEL。在37℃下保温90分钟后，将培养物离心并使细菌溶于相同体积的YEL。在保温前和保温结束时进行计数且随后在37℃下对重新开始的生长测定DO、持续5天。

-连续的酸和胆汁逆境

使细菌经历如上所述的酸逆境，但在离心后使细胞溶于含有0.3％胆汁的YEL。在37℃下的第二次保温90分钟后，将培养物离心并使细菌溶于相同体积的YEL。在保温前和保温结束时进行计数且随后在37℃下对重新开始的生长测定DO、持续5天。

一方面，将获得的结果报导在下面的表1中，该表描述了酸性和/或胆汁逆境对细菌存活率的影响，另一方面，将获得的结果报导在附图1中，附图1是代表不同逆境后生长重新开始的示意图。表1

存活率(cfu/ml)逆境前酸性逆境后胆汁逆境后单独的酸性逆境TL 162TL 243.0×10⁸4.0×10⁸9.7×10⁶1.0×10⁷    /    /单独的胆汁逆境TL 162TL 243.0×10⁸4.0×10⁸    /    /4.4×10⁸4.7×10⁸连续的逆境TL 1623.0×10⁸4.0×10⁸9.7×10⁶1.0×10⁷   2600   ＜10还能够确定：-酸度涉及细菌的主要死亡率(对TL 162而言是96.8％，而对TL 124而言是97.5％)，它说明就生长的重新开始而言存在一个足够长的延缓期(附图1)。-胆汁不涉及任何细菌的死亡率，由此生长极快地重新开始。-当在上述酸性逆境后使细菌接触胆汁时，这种情况使得细菌几乎全部死亡。完全未预计到的这一结果由此表明经过酸性逆境且虽然如此仍保持存活的细菌变得完全对胆汁敏感，而没有经过上述酸性逆境的这些相同的细菌完全耐胆盐。

考虑到这种情况，进行预先合适的试验以便增加细菌的抗性。实际上已知预先的酸性逆境(pH4.5-5)可有效地使细胞抵御酸性逆境(pH2)。

因此，对TL 162进行三种适应试验：

-预先酸性逆境：在37℃和pH5下将细胞预保温30分钟

-预先胆汁逆境：在有0.08％胆汁存在的情况下保温30分钟

-预先酸性和胆汁逆境：在pH5和有0.08％胆汁存在的情况下保温30分钟。

实施与如上所述相同的方案并将获得的结果报导在下面的表2中：表2

    存活率(cfu/ml)逆境前连续逆境后没有预先适应3×10⁸    2600酸性预先适应3×10⁸    100胆汁预先适应3×10⁸    1400酸性和胆汁预先适应3×10⁸    ＜100

因此，能够确定酸性预先适应更能够使细胞弱化，而胆汁预先适应没有影响。

因此，这些结果能够证明如已经在本领域中进行的大部分研究中所述连续而非单独处理这些逆境的必要性。

然而，可以推断体内条件对所述细菌来说剧烈程度较低(食品在胃中的缓冲作用、含有磷脂类的微团形式的胆盐的较低杀菌作用)。

考虑到上述情况，为了增加存活细菌的数量，细菌对酸性pH的耐受性的改善并不有效，这是因为细菌保留了对胆盐作用的敏感性。

另一方面，通过防止细菌受到酸性逆境的影响、特别是通过摄取预包囊在耐胃液胶囊中的细菌，能够在粪便中发现天然耐胆汁的高浓度生存活率的细菌。

考虑到这些结果，进行补充试验以便比较不同菌株的丙酸菌在与胆盐接触后产生有效量丙酸的能力。

在本试验中，比较属于LRTL(Rennes的INRA)的TL保藏中心的丙酸乳菌的33个菌株在有胆汁存在的情况下存活且然后产生丙酸的能力：-20个菌株属于P.freudenreichii种的亚种shermanii-6个菌株属于P.freudenreichii种的亚种freudenreichii-7个菌株属于P.acidipropionici的种类操作方案如下：

将稳定期中的起始培养物(在30℃下的YEL培养基中保温2-3天)按1/10稀释入含有0.6％的牛胆汁(约7-8mmol/l的胆盐)的YEL培养基中。选择该浓度的胆汁是为了以最佳方式区别菌株并构成与在十二指肠中所遇到的相同的胆盐含量。

在37℃下将稀释液保温90分钟、然后离心。将细菌溶于YEL培养基(起始体积)并重新在37℃下保温。

在保温24小时后，测定650nm下的DO以便评价重新开始生长的情况。收集上清液、然后冷冻以便测定脂肪酸类。

就某些菌株而言，重复所述实验以便证实结果。

将胆汁逆境前和逆境结束后24小时650nm下的光密度值报导在下面的表3中：表3

菌株：胆汁逆境前的DO(起始DO/10)胆汁逆境后保温24小时的DO24小时的DO/起始DO的％P.shermaniiTL 125    0.32    2.02    63TL 134    0.29-0.26    2.60-2.04    90-78TL 144    0.39    3.62    93TL 146    0.27    1.56    58TL 147    0.28    1.23    44TL 148    0.23    0.04    2TL 160    0.36-0.32    4.67-4.03    130-126TL 167    0.26    1.05    40TL 168    0.32    0.57    18TL 4    0.32    0.29    9TL 14    0.23    0.73    32TL 17    0.29    0.55    19TL 22    0.28    1.39    50TL 24    0.28    1.65    59TL 162    0.20    2.08    104TL 34    0.26-0.27    3.40-3.87    131-143TL 50    0.26    2.05    79TL 61    0.23    1.31    57TL 63    0.27-0.26    3.26-3.55    121-137TL 40    0.30    1.46    49P.freudenreichiiTL 142    0.34-0.31    2.95-2.80    87-90TL 3    0.24    2.66    111TL 19    0.30    2.66    89TL 37    0.23    1.79    78TL 33    0.26    2.38    92TL 64    0.29    0.31    11P.acidipropioniciTL 2    0.38    2.30    61TL 9    0.34    2.29    67TL 15    0.34    3.09    91TL 54    0.34    1.39    41TL 47    0.20    0.22    11TL 223    0.29-0.38    2.59-2.91    89-77TL 249    0.44    3.40    77

应注意：就某些菌株而言，最终的DO高于起始的DO，这种情况可以由在37℃下生长重新开始且最初在30℃下没有生长来解释。

作为所获得结果的函数，可以通过图解方式区分三组菌株：-通过开始快速重新生长而彼此区分的菌株，表明因胆汁而导致的细胞的低死亡率(其中包括TL 34、TL 160、TL 63、TL 33、TL 15、TL 3、TL 162)；-耐胆汁能力极低的菌株，表明重新开始生长极难或为0(TL 148、TL 4、TL 64、TL 47)；-特征在于因胆汁造成中等程度的死亡率的中等菌株(TL 146、TL 147、TL 167、TL 168、TL 14、TL 17、TL 22、TL 24、TL 61、TL 40、TL 54)。

仅选择具有大于60％(任意选择的阈值)比例[(24小时时的DO/起始DO)×100]的菌株用于通过在冷冻上清液中的HPLC测定乳酸盐、乙酸盐和丙酸盐。YEL培养基的起始乳酸含量为11.4g/l。

下面的表4中列出了保温24小时后回收的上清液中乳酸盐、乙酸盐和丙酸盐的浓度。表4

 菌株：消耗的乳酸盐产生的乙酸盐产生的丙酸盐                        (按g/l计) P.shermanii TL 125    5.6    0.6     2.4 TL 134    8.9-7.3    0.9-0.9     4.0-3.4 TL 144    8.8    1.1     4.6 TL 160    9.9-8.8    1.3-1.1     4.7-4.6 TL 162    5.3    0.6     2.3 TL 34    9.7-10.1    1.0-1.2     4.9-4.7 TL 50    6.6    0.6     3.7 TL 63    9.1-10.0    1.0-1.1     4.4-4.4 P.freudenreichii TL 142    8.1-8.2    0.9-0.9     4.5-4.0 TL 3    7.8    0.9     3.6 TL 19    6.6    0.7     3.7 TL 37    5.5    0.6     2.5 TL 33    7.2    0.8     3.4 P.acidipropionici TL 2    2.7    0.4     1.5 TL 9    5.3    0.6     2.4 TL 15    3.7    0.4     2.0 TL 223    2.8-3.8    0.4-0.4     1.8-1.7 TL 249    5.2    0.6     3.2

该表表明所产生的丙酸盐的量以可预计的方式与乳酸盐的利用程度相关。

一般来说，在24小时内属于P.acidipropionici种类的菌株产生的丙酸低于P.freudenreichii种类的菌株产生的丙酸。

鉴于上述结果，就胆汁起作用后产生的丙酸盐而言，证明某些菌株是较好的候选物。它们是在上述条件中至少产生2g/l丙酸盐的菌株：

TL 134、TL 50、TL 3、TL 19、TL 33、TL 249；且优选产生4g/l以上的丙酸盐的菌株：

TL 160、TL 144、TL 34、TL 63、TL 142。

另外对健康志愿者进行一种实验，目的在于检验耐胃液胶囊的有利影响以便改善以冻干形式摄取的丙酸干酪菌菌株(TL162)在肠中的存活率。

对总计7个个体进行本实验，其中共有3个各为4周的治疗期，各治疗期之间有3周的间隔。

治疗期1由摄取2周包装在不耐胃液的胶囊中的5×10⁹cfu/j细菌的步骤组成。

治疗期2由摄取2周包装在不耐胃液的胶囊中的5×10¹⁰cfu/j细菌的步骤组成。

治疗期3由摄取2周包装在耐胃液的胶囊中的5×10⁹cfu/j细菌的步骤组成。

对每个治疗期来说，取4份粪便样品以便借助于选择培养基(Palpropiobac，Standa-Industrie，与4mg/l甲硝唑混合)检测丙酸菌。取样日期为：-S1：恰在摄取期限前；-S2：摄取开始后1周；-S3：摄取开始后2周；-S4：摄取期限结束后1周；-HP(就第3个期限而言)：摄取期限结束后3周。

在整个实验过程中，志愿者不能食用含有大量丙酸菌的干酪(Emmental，Comté，Leerdammer，Gruyères Suisses，...)而食用软干酪。

表5表示粪便中丙酸菌的存活率结果。

看起来使用剂量为5×10⁹cfu/j(期限1)的常规胶囊不足以在所有志愿者中找到以显著量存活的丙酸菌。另一方面，使用5×10¹⁰cfu/j的剂量(期限2)从治疗的第1周开始就在所有志愿者的粪便中发现了5 logcfu/g以上的存活丙酸菌。然而，使用该剂量观察到的最高存活水平并非不同(~7 log)。

应用耐胃液的胶囊(期限3)尤其改善了在志愿者粪便中丙酸菌的存活率，在这些志愿者中的第1个治疗期时几乎没有发现丙酸菌(志愿者1、2和6)。实际上，就期限2而言，所获得的存活水平平均是相等的。由此在一定数量的个体(志愿者1、2、6)中证明以5×10⁹cfu/j为基础应用耐胃液胶囊是合理的，而对其它人而言，该剂量下的耐胃液凝胶不会改善存活率或仅能够轻度改善存活率(志愿者3、4和5)；它们产生了与含有5×10¹⁰cfu的常规胶囊几乎等价的结果。

通过气相色谱法测定粪便中的短链脂肪酸类。粪便中丙酸盐的量如表6中所示．为了进行统计学分析，将2组数值进行成对的比较：就将所有治疗和期限合并而言是相当于未检测丙酸菌的粪便样品的数值(＜4log)和相当于统计丙酸菌为6 log cfu/g以上时的粪便样品的数值。在第一种情况中，丙酸盐的平均量为5.06±2.56ìmol/g(n＝25)而在第二中情况中丙酸盐的平均量为7.19±3.18ìmol/g(n＝30)。这2个数值在p＜0.02时具有显著性差异(斯氏检验)。对其它短链脂肪酸类而言没有显著性差异。因此，本实验表明在摄取TL 162后的结肠中存在的大量(＞6 log cfu/g)丙酸菌可显著增加粪便中丙酸盐的量。然而，由于没有证明菌株TL 162是使结肠中丙酸产生最佳化的最佳候选物(参照体外选择标准)，所以使用根据上述标准选择的菌株改善所述结果是可能的。表5：3个治疗期时粪便中乳酸菌的计数(以log cfu/g新鲜粪便计的结果)n*＝可以计数丙酸菌的个体数量带阴影的方格：所有的数值均高于6log cfu/g。表6：新鲜粪便中的丙酸盐浓度(以μmol/g计)带阴影的方格：所有数值均相当于具有丙酸菌高于6log cfu/g的样品

考虑到上述情况和本发明的优选特征，所用的丙酸菌选自产生生理有效量丙酸的菌株且特别是选自至少产生2g/l丙酸和/或丙酸盐且优选4g/l以上丙酸和/或丙酸盐的菌株，此前已经对这些菌株进行了下列步骤的处理：在30℃下含有约11.4g/l乳酸盐的YEL培养基中培养了2-3天、然后将其按1/10稀释入含有0.6％牛胆汁的YEL培养基、在37℃下保温90分钟、离心、溶于YEL培养基并在37℃下再保温24小时。

另一种可以按照本发明考虑的选择标准符合所述菌株对结肠细胞的粘着特性：具有良好粘着特性的菌株实际上具有在结肠中停留较长时间的优点，这使得它们有更多时间合成丙酸；此外，成为固定的菌株可以取代病原体。

应注意为了获得所寻找的作用，并非关注使丙酸自身被吸收，这是因为由于人的代谢链而导致它不能够达到结肠且另外已经证实它在高剂量下对胃有害。

由在结肠处合成的短链脂肪酸类且特别是乙酸和上述所有因丙酸产生的有利作用中，需注意的是它们在同化主要矿物且尤其是钙、铁、锌或镁中的作用；实际上已经能够确定丙酸有利于这些矿物的结肠吸收和由生物体对所吸收部分的利用而乙酸对这些矿物的结肠吸收和生物体对所吸收部分的利用的有利作用程度较低。

鉴于对矿物的同化作用由诸如经对因铁导致的贫血或因钙导致的骨骼矿化进行校正的实例这样的功能作用来完成，所以上述作用是一种特别有意义的作用。

已经进行的实验和临床研究提供了支持丙酸和丙酸盐对这些矿物代谢的有利作用以及乙酸和乙酸盐对这些矿物代谢的较低程度的有利作用的确定论据的主体；当消化条件差和需求高时，这种作用可能更为重要，当消化条件差时这种作用使得通过小肠到结肠区未吸收的矿物的量相当大。

通过使用可溶性纤维进行的研究特别提示在短链脂肪酸类与矿物的代谢之间存在相关性。因此，已经能够确定并非由消化酶类消化且由此被结肠菌群发酵成短链脂肪酸类(尤其是丙酸盐)的多糖类和寡糖类增加了诸如钙、铁或锌这样的矿物的吸收，而如果条件是病理性的(缺乏、胃切除术...)，那么这种增加会更加显著。

结肠灌注研究和另一方面结肠切除的受试者中作用的缺乏已经能够证实结肠处作用部位的局限化。

还证实这些作用通过降低pH和减少短链脂肪酸类的合成来完成；这提示通过发酵来干扰这些酸类反而更好，这是因为已经证实不能发酵的不溶性纤维没有作用。此外，已经确定盲肠过度增大且结肠血流增加，这为一种营养作用提供了证据。

对这一主题进行的临床研究几乎没有，而这些临床研究能够证实通过结肠发酵获得的可溶性纤维的作用且直接证实了短链脂肪酸类对矿物吸收的作用。

在这些研究中，所提及的内容由下列公开出版物构成：Trinidad TP，Wolever TMS，Thompson LU，“乙酸盐和丙酸盐对钙从人直肠和(ad)远端结肠吸收的作用”(Effect of acetate and propionate on calciumabsorption from the rectum ad distal colon of humans)-《美国临床营养学杂志》(Am J Clin Nutr)1996 63/574-578，该文献对试验进行了报导，其中对健康受试者的远端结肠直接灌注生理浓度的乙酸、丙酸或其混合物；由此确定短链脂肪酸类加速了该从结肠口的消失，而丙酸能够以实质上更为显著的方式达到这一目的；本研究还证实了剂量作用以吸收的非饱和系统为基础。作者提示更为亲脂的丙酸可能比乙酸有利于其吸收且通过消化口在结肠细胞中释放质子可有利于钙的吸收。

考虑到上述情况，本发明还涉及根据不很自溶的性质和耐胆盐的能力的功能选择的丙酸菌在制备可由人或动物吸收的最新食品组合物或膳食或药物组合物中的用途，所制备的组合物使得所述细菌可至少部分抵抗胃的酸度，它含有至少10⁶个细胞/克所述细菌，这些细菌能够有利于结肠处主要矿物的同化、特别是钙和/或铁和/或锌和/或镁的同化。

根据本发明的变化形式，还提出了将这种用途用于获得一种具有在结肠处抗真菌特性且特别是能够减少念珠菌属/假丝酵母类致病菌膜发育的组合物。

实际上，这种用途利用了丙酸特别是在治疗因抗生素导致的念珠菌病中的极佳抗真菌特性。

应注意本发明所用的组合物可以含有其它细菌、特别是能够与丙酸菌起协同作用的乳酸菌和/或双歧杆菌，这将视具体情况而定，按照这样一种方式可通过给它们提供乳酸盐作为发酵底物来增加上述作用。

本发明所用的组合物可以由干品或水合制品组成，其存在形式是各成分约为100mg-1g、优选200-500mg、优选含有至少10⁸个细胞；特别有利的是以耐胃液的胶囊形式存在。

根据本发明的另一个特征，该组合物还可以由配制的制品组成，其中加入了丙酸菌或混合了可发酵的底物、尤其是食物纤维或添加或混入液体、糊状或固体食品。

在这类制品中，丙酸菌可以起双向作用，即在第一个阶段通过对食品发酵起工艺上的作用而在第二个阶段起功能上的作用，这是因为一旦摄入丙酸菌，它们就可达到结肠并在那里起上述益生菌作用，特别是就使丙酸合成最佳化和使矿物的同化最佳化而言更是如此。