稳定腈水解酶活性及保存微生物细胞的方法

摘要

发展了保存含有腈水解酶活性的固定化或非固定化微生物细胞及稳定该固定化或非固定化微生物细胞的腈水解酶活性的方法。该固定化或非固定化微生物细胞被储存于含有约0.1M－饱和浓度的无机碳酸氢盐或碳酸盐的水溶液中,无机碳酸氢盐或碳酸盐包括它们的铵、钠及钾盐。含有至少100mM的碳酸氢盐或碳酸盐的水悬液限制储存的酶催化剂的微生物污染,也稳定非固定化或固定化细胞的期望腈水解酶活性。表现有腈水解酶特征及用该方法被稳定和保存的微生物包括敏捷食酸菌72－PF－15(ATCC55747)、敏捷食酸菌72－PF－17(ATCC55745)、敏捷食酸菌72W(ATCC55746)及含有腈水解酶活性的转化微生物细胞,优选用敏捷食酸菌72W腈水解酶活性转化的大肠杆菌SS1001(ATTCCPTA－1177)。

说明书

                       发明领域

本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地说，发展了一种方法用于稳定未固定化或固定化微生物细胞的腈水解酶活性和保存该微生物细胞的完整性，其中未固定化或固定化微生物细胞被贮存于含有一种从浓度大约0.100M至饱和浓度的无机碳酸氢盐或碳酸盐的水溶液，包括铵、钠、钾的碳酸氢盐或碳酸盐。

                       发明背景

腈水解酶的存在已经被广泛的描述。在此酶家族中，两个主要的类型已被普遍认识。第一类包括腈水合酶类，其催化一分子水到腈的加成，结果形成相应的酰胺：

                         反应1：

                   

第二类群包括腈水解酶，其催化向腈加和两分子水，结果直接形成相应的羧酸和氨，没有相应酰胺中间体的形成。

                          反应2：

                  

含有芳香族或脂肪族腈水解酶类的细胞已经被用于在水溶液中直接转化腈至相应的羧酸铵盐，而没有酰胺中间体的形成(Kobayshi等，FEMS Microbiol.Lett.120：217-234(1994))。具有腈水解酶活性的细胞包括紫红红球菌K22(Kobayashi等，Tetrahedron 46：5587-5590(1990)；Kobayashi等，细菌学杂志172：4807-4815(1990))，睾丸酮丛毛单胞菌(US 5,629,190和US 5,635,391；Lévy-Schil等，基因161：15-20(1995))，紫红红球菌NCIMB 11216(Gradley等，BiotechnologyLett.16：41-46(1994)；Bengis-Garber等，应用微生物与生物技术32：11-16(1989))和紫红红球菌J1(Kobayashi等，欧洲生物化学杂志182：349-356(1989))，在已被测序的腈水解酶中，一个独特的保守活性位点的半胱氨酸已被鉴定为负责腈水解的功能基团(Lévy-Schil等，基因161：15-20(1995))。稳定半胱氨酸催化的腈水解酶的典型方法在含有已分离的酶或整个细胞的水溶液中包括毫摩尔(mM)浓度的二硫苏糖醇(DTT)和/或乙二胺四乙酸(EDTA)。

保存细胞悬浮液或固定化细胞的方法已在EP0707061A1中被描述，其中贮存液含有至少一种选自包括磷酸，硼盐，硫酸、亚硫酸及盐酸一类的盐。盐的种类包括钠盐、钾盐和铵盐。这些盐的浓度为100mM至此无机盐的饱和浓度。应用这些无机盐保持土生戈登氏菌MA-1(Gordona terrae MA-1)的腈水解酶的活性已被证实。日本专利申请JP10042885A2描述了，在含有H₂CO₃或碳酸盐类的水相反应混合物中，通过用培养基，细胞，细胞制备物，酶，或来源于具有腈水解活性的微生物的酶制备物处理腈，酰胺和/或有机酸的产生。其中，H₂CO₃或碳酸盐的存在被报告为增加了腈水解酶对腈的观测活性。没有公开在长时间的保存中细胞腈水解活性稳定性的改进。

具有腈水合酶的细胞的腈水合酶活性的保存方法(其中脂肪族腈被酶促反应转化为酰胺而没有后继由酰胺至相应的羧酸铵盐的转化)已被US4,931,391和U.S4,900,672描述。这些用于未固定化或固定化微生物的腈水含酶活性的稳定保存的方法，向此未固定化或固定化细胞的悬浮液中加入至少一种选自含腈，酰胺或有机酸一类的化合物。

U.S.4,343,900描述了选用具有腈水解酶活性(即一种腈水合酶)的微生物从丙烯腈产生丙烯酰胺的过程，其包括反应混合物中的碱金属碳酸盐或碳酸氢盐。此碳酸盐或碳酸氢盐被加入以防止由于反应过程固定细胞的膨胀造成的酶活性的丢失，并且当生理盐水或磷酸盐缓冲液加入反应混合物时，这种活性丢失通常不会被观察到。在同样的方法中，为了从丙烯腈产生丙烯酰胺，与加入有机羧酸盐相结合优先选用向反应混合物中加入碱金属碳酸盐或碳酸氢盐，因此在丙烯腈被转化成丙烯酰胺时，较长时间维持了酶的活性。

需要解决的问题是稳定腈水解酶的活性并且减少微生物的污染或悬浮液中未固定化或固定化细胞的腐败。不同的方法已被用于稳定具有腈水合酶或者腈水解酶活性的细胞，其中这两种酶活性是由不同类型的酶产生的，此不同类型的酶具有不同的机制分别催化腈水解成酰胺或酸。不同羧酸盐对腈水解酶保存活性的影响的检测没有能防止如腈水合酶中所见的，腈水解酶活性的丢失。相类似的，以前公开的作为保存微生物腈水解酶或腈水合酶的不同无机盐的应用，也没能稳定本发明关于水悬浮贮存的微生物细胞的腈水解酶的活性。

                      发明概述

本发明解决了以上表述的问题。它是一种保存具有腈水解酶活性微生物和稳定其中腈水解酶活性的方法，其方法包括向具有腈水解酶活性的固定化或未固定化微生物细胞水悬浮液中，加入选自无机碳酸盐和无机盐酸氢盐化合物至少之一，其中水悬浮液中此无机盐的最终浓度为100mM-此无机盐的饱和浓度。具有腈水解酶活性的微生物细胞选自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)。另外，含有腈水解酶活性的转化的微生物细胞在本发明中也是有用的，这种转化的微生物细胞的例子就是大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)，其含有敏捷食酸菌72W的腈水解酶活性。无机碳酸盐和碳酸氢盐，优选选自碳酸氢铵，碳酸氢钠和碳酸氢钾的一种或多种。此方法的条件包括具有腈水解酶活性的微生物细胞水悬浮液的PH值是大约pH6-10，以及微生物细胞水悬浮液的温度大约0℃-45℃。优选，微生物细胞固定化于聚丙烯酰胺胶，藻酸盐或角叉菜聚糖中。在一种优选实施方案中，细胞被固定在角叉菜聚糖中，无机碳酸氢盐选自碳酸氢铵、碳酸氢钠，并且水悬浮液中此无机碳酸氢盐的浓度为大约100mM-1000mM。在该方法的另一种优选实施方案中，该微生物细胞没有被固定化，化合物是碳酸氢钠，并且水悬浮液中碳酸氢钠的最终浓度为大约100mM-1000mM。在另一种优选实施方案中，微生物细胞被固定于藻酸盐中，加入水悬浮液中的化合物是选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾的一种或多种，此过程包括向水溶液中加入大约2mM-5mM钙盐(优选乙酸钙的形式)的其它步骤。

                    生物保藏简述

按照布达佩斯条约的规定，申请者已作了以下生物保藏。保藏者鉴定参考号        国际保藏名称      保藏日期敏捷食酸菌72-PF-17      ATCC 55745        1996.3.8敏捷食酸菌72W           ATCC 55746        1996.3.8敏捷食酸菌72-PF-15      ATCC 55747        1996.3.8大肠杆菌SS1001          ATCC PTA-1177       2000.3.11

其中，“ATCC”指位于10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209的国际保藏机构美国典型培养物保藏中心。“国际保藏名称”指保藏于ATCC的培养物的入藏号。

                      发明详述

本发明发展了一种稳定未固定化细胞或固定化微生物细胞中腈水解酶活性的方法，其中，细胞被贮存于大约0.100M-此盐饱和浓度的至少一种无机碳酸氢盐或碳酸盐的水溶液中，无机盐包括但不仅限于铵、钠和钾的碳酸氢盐或碳酸盐。含有至少100mM碳酸氢盐或碳酸盐的贮存溶液显著地限制了微生物污染或贮存的酶催化剂的腐败，并且稳定了预期的未固定化和固定化细胞的腈水解酶活性。具有腈水解酶活性特性的并且用此方法可被稳定保存的微生物包括但不仅限于敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)，敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)以及为使其含有腈水解酶活性而被转化的微生物(例如，转化有敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的大肠杆菌SS1001)。

在此公开内容中，许多术语和缩写被运用，提供以下定义：

“高压液相色谱”被缩写为HPLC

“聚丙烯酰胺凝胶”被缩写为PAG

术语“腈水解酶”指一种在水溶液中能被用于直接转化腈到相应的羧酸而没有酰胺中间体的形成的酶()。

术语“稳定”指维持整个未固定化或固定化微生物细胞中酶催化剂的活性，以使得相对于初始的酶催化活性，在很长时间里酶活性没有连续性的丢失。其效果就是保持酶的活性在与酶催化剂制备后0天所观察到的相似的水平，从而延长酶催化剂的有用寿命。

术语“保存”(preserve)或“保存”(preservation)指防止或限制具有腈水解酶的微生物细胞的腐败(微生物污染或细胞裂解)，其效果就是相对于没有用此方法处理的细胞，通过维持细胞完整不裂解，显著地限制未定化或固定细胞水悬浮液的污染。

U.S.5,814,508和U.S.5,858,736描述了从脂肪族α，ω-二腈制备五元环内酰胺或六元环内酰胺的方法，其中运用具有脂肪族腈水解酶(EC3.5.5.7)活性的微生物细胞，在水溶液中首先将脂肪族α，ω-二腈转化为ω-腈基羧酸铵盐，随后通过加氢作用在水溶液用直接转化ω-腈基羧酸的铵盐至相应的内酰胺。在制备和贮存具有腈水解酶活性的未固定化或固定化细胞的过程中，对于该方法是悬浮于含有，例如，磷酸盐缓冲液或生理盐水的水溶液中，发现这些解决方案中的许多没能在大约5℃至30℃的范围内防止所贮存催化剂的微生物污染或腐败。在那些没有观察到微生物污染或腐败的例子中，在贮存过程中腈水解酶活性的显著丢失仍然发生。固定化细胞催化剂的冷冻典型地引起固定化基质的毁坏，而且尽管非固定化细胞能被冷冻保存而数月内没有显著的活性丢失，伴随着此方法的是相当大的成本，因为在制备后使用前，期望这些微生物贮存数个星期或数月而没有酶活的丢失或腐败，所以在保存当中稳定保存未固定化或固定化微生物细胞催化剂的方法是一直寻求的。

一个不同无机盐对未固定化或固定化敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶活性贮存稳定性影响的检查，包括那些EP0707061中描述的土生戈登氏菌MA-1的稳定保藏的一部分，被实施。含有不同浓度磷酸钾，硫酸铵或氯化铵的贮存液，不能防止随着时间过去的腈水解酶活性的丢失(见所附例子)。尽管腈水合酶和腈水解酶是按不同机制将腈分别水解为酰胺或酸的不同类型的酶，以前报道的稳定微生物细胞的腈水合酶的有机酸的盐如醋酸盐或丙酸盐也同样被检查。如所附例子中所公开的，乙酸铵或丙酸铵在保存未固定化或固定化敏捷食酸菌72W细胞的腈水解酶活性中是无效的。

发现碳酸盐和碳酸氢盐，包括但不仅限于碳酸氢铵，碳酸氢钠和碳酸氢钾对于1)防止具有腈水解酶活性的未固定化或固定化细胞悬浮液的明显微生物污染和腐败(尤其是，敏捷食酸菌72W细胞以及包括具有腈水解酶活性的转化的微生物，例如，敏捷食酸菌72W腈水解酶活性的转化微生物)，和2)稳定这些悬浮液的腈水解酶活性都是有效的，象所附例子中公开的结果证实的那样。

潜在表达腈水解酶基因的生物：

已知许多不同的属表达腈水解酶活性或者含有被认为是表达腈水解酶蛋白的基因。表达腈水解酶活性的格兰氏阴性细菌(例如，丛毛单胞菌属，食酸菌属，克莱伯氏菌属[McBride等，应用与环境微生物，52：325-330(1986)]，不动杆菌属[Yamamoto等，农业生物化学，55：1459-1466(1991)]，产碱菌属[Yamamoto et al.，J Ferm Bioeng 73：425-430 1992])和格兰氏阳性细菌(例如，红球菌[Bhalla等，生物技术学报，15：297-306(1995)]，节杆菌属[Bandyopadhyay等，应用与环境微生物，51：302-306(1986)]，戈登氏菌属[来自土生戈登氏菌的编码特异腈水解酶的DNA，NCBI GenBank入藏号E12616，专利：JP1997037788-A1 10-FEB-1997]，芽孢杆菌[Cramp等，微生物143：2313-2320(1997)]都已被认识。从植物上(烟草[Tsunoda，NCBI GenBank，ACC，#D83078]，拟南芥[Zhou等，植物生理110，1048(1996)])和真菌(例如，腐皮镰刀菌[Harper，生物化学杂志167：685-692(1977b)])也已知有大量的报道。

在更高等的生物(果蝇，新杆线虫，智人)中，发现了看来是编码腈水解酶蛋白的基因[Pekarsky等，美国科学院院报95(15)，8744-8749(1998)]，这些基因的具体功能没有报道。然而，它们与已知的腈水解酶基因保持高的同源性，并且被预期表现典型的腈水合酶活性。迄今测序的腈水解酶基因在活性位点保持有共同的结构(Novo et al(1995)FEBS lett 367：275-279)，因此预期对通过本发明保存是敏感的。

腈水解酶基因的转化和表达

转化宿主的腈水解酶活性的异源表达已被报道(Kobayashi等，1993，美国科学院院报90：247；Kobashi等，1992；生物化学杂志，267：20746；Kobayashi等，1992生物化学31：9000-9007；U.S.4,810,648)。在一些情况下，宿主必须被特异地修饰以表达良好的酶活(Levy-Schil等1995，基因161：15-20；U.S.5,830,693；U.S.5,635,391)。在良好的腈水解酶活性被发现的例子中，转化宿主表达的酶保持了野生型酶的腈水合酶活性。本发明将保存这种转化宿主表达的腈水合酶的活性，如被例11中数据所证实的那样，其中敏捷食酸菌72W腈水解酶被转化到大肠杆菌中。

异源宿主细胞

具有活性的敏捷食酸菌72W的腈水解酶蛋白可以在异源宿主细胞中产生，优选，在微生物宿主中。在本发明中特别有效的将是已经适合于大量发酵方法的细胞。这些生物在工业生物工艺中是被熟知的，这样的例子可以在“工业和农业应用重组微生物”中找到，Murooka等，编著，Marcel Dekker，Inc.New York，NY(1994)，而且包括发酵的细菌及酵母和丝状真菌。宿主细胞可以包括但不仅限于丛毛单胞菌，棒杆菌，短杆菌，红细菌，固氮菌，柠檬酸杆菌，肠杆菌，梭菌，克莱伯氏菌，沙门氏菌，乳酸杆菌，曲霉，酵母，按合酵母(Zygosaccharomyces sp.)，毕赤酵母(Pichia sp.)，克鲁维酵母，念珠菌，汉逊酵母，Dunalielle sp.，德巴利酵母(Debaryomyces sp.)，毛霉菌，圆红酵母，甲基细菌，芽孢菌，埃希氏菌，假单孢菌，根瘤菌，链霉菌，优选大肠杆菌。含有指导高水平表达外源蛋白的调控序列的微生物表达系统及表达载体对于本领域技术人员是众所周知的。

具体菌株：

敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)分离于收集自Orange TX的土壤。以下面的培养基(E2基本培养基，pH7.2)进行标准的富集程序：E2基本培养基      g/LKH₂PO₄         1.4NaH₂PO₄        0.69柠檬酸钠          0.1CaCl₂·2H₂0    0.025KCl               0.5NaCl              1.0MgSO₄·7H₂O    0.5FeSO₄·7H₂O    0.05CoCl₂·6H₂O    0.01MnCl₂·4H₂O    0.001ZnCl₂           0.0005NaMoO₄·2H₂    0.0025NiCl₂·6H₂O    0.01CuSO₄·2H₂O    0.005生物素            0.0002叶酸              0.0002盐酸吡哆醇        0.001核黄素            0.0005盐酸硫胺素        0.00005烟酸              0.0005泛酸              0.0005维生素B₁₂        0.00001对氨基苯甲酸      0.0005

为了以上描述的富集，对E2基本培养基做了以下补充：

菌株              富集氮源                其它补充物

敏捷食酸菌72W     0.2％(V/V)乙基琥珀腈    0.3％(V/V)甘油

首先根据在富含腈的培养基上的生长及铵的产生筛选菌株。分离物通过反复涂布细菌用脑心浸汁琼脂(DIFCO，Detroit，MI)纯化，然后通过富含腈的培养基产氨来筛选。用革兰氏阴性测试平板基于在Biolog(Hayward CA)测试系统上它们的碳源利用情况来鉴定纯化的菌株。

腈水解酶活性

为了测定腈水解酶活性，加入10克/升葡萄糖的E2基本培养基被用于敏捷食酸菌72W的生长。培养基中补充了25mM的(+)-2-甲基戊二酸腈。10毫升这种补充培养基被接种了0.1毫升冷冻的储存物，在摇瓶中250转/分室温(22-25℃)培养过夜。该10毫升培养物被加入装在2升烧瓶的990毫升新鲜培养基中。细胞在足以使培养基形成气泡的高转速搅拌下室温培养过夜。离心收集细胞，用50毫升pH7.2的磷酸缓冲液/15％的甘油洗一遍，浓缩的细胞沉淀立即用干冰冷冻，储存于-65℃。10mM脂肪腈也被用于一升发酵液中。发酵在16-20小时生长后被终止。细胞悬液4℃离心收集，用0.05M磷酸缓冲液配制的15％甘油溶液洗涤后冻存于-60℃。

融化的细胞沉淀被用于测定腈水解酶活性。这种微生物所具有的想要的腈水解酶活性能在不存在腈水化酶和酰胺化酶活性干扰时，区域特异性地水解二腈化合物。微生物往往容易突变。有些突变株可能有利于预期的腈的转化。所以即使是某些天然菌株的突变体也可能被用于本发明的方法中。

本发明不仅仅限于上述特定的微生物，还包括其具有想要的特性的变异株和突变株的使用。这些变异株和突变株可由出发菌株通过不同的熟知的方法如X-射线照射、紫外线照射及化学诱变剂等得到。

在水解2-甲基戊二酸腈成为4-氰基戊酸的过程中，能产生不受欢迎的副产物2-甲基戊二酸的具有还原能力的敏捷食酸菌72W(ATCC55746)突变株可基于它们不能利用2-甲基戊二酸腈作为碳源和能源而选择出来。尤其当在LB/琥珀酸培养基(1％(W/V)细菌-蛋白胨(DIFCO，Detroit，MI)，0.5％(W/V)细菌-酵母粉(DIFCO)，1％(W/V)NaCl，0.5％(W/V)六水合琥珀酸钠)上生长过夜的敏捷食酸菌72W培养物被暴露在100微克/毫升的亚硝基胍诱变剂中约30分钟，这样导致培养物中的存活细胞减少99.9％。突变细胞在无菌的1M磷酸缓冲液(pH7.2)中洗涤离心除去诱变剂。洗涤后的细胞用LB/琥珀酸培养基悬浮在30℃培养过夜，然后用无菌的50mM磷酸钠缓冲液洗涤并重悬于含有0.2％(V/V)2-甲基戊二酸腈和抗生素环丝氨酸，0.2毫克/毫升，哌啶氨比西林，40毫克/毫升的E2基本培养基(无葡萄糖)。细胞在30℃培养过夜后再用无菌的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)洗一遍。洗后的细胞被涂布在非选择性培养基的琼脂平板上，培养基为：E2基本培养基(无葡萄糖)加0.2％(V/V)2-甲基戊二酸腈、0.5％(W/V)六水合琥珀酸钠。细胞浓度为每平板40-100个菌落。平板在30℃培养约48小时形成菌落。长出的菌落被影印到选择性培养基的琼脂平板上，培养基为：E2基本培养基(无葡萄糖)加0.2％(V/V)2-甲基戊二酸腈。平板在30℃培养48小时形成菌落。具有合乎需要的特性的突变株在选择性培养基上不能正常生长。所以，48小时后影印平板，在作比较后将只在非选择性培养基平板上生长的菌株保存以备进一步检验。

共有89个平板上的约5120个菌落被检测并确定有19个菌株具有合乎需要的特性。这些突变株生长在E2基本培养基(无葡萄糖)加0.2％(V/V)2-甲基戊二酸腈的液体培养基中以作进一步验证。在此培养基上表现出轻微生长或不生长的菌株由于具有在含有E2基本培养基(无葡萄糖)加0.2％(V/V)2-甲基戊二酸腈和0.5％(W/V)六水合琥珀酸钠的液体培养基中生长时产生2-甲基戊二酸的能力而被挑选出来。作为此方法的结果，两株被确定为敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF17(ATCC55745)的突变株因其产生2-甲基戊二酸的能力大大降低而被选出作进一步开发。

为了生产稳定化研究的生物催化剂，下述培养基可被使用。菌株        培养基72-PF-15    LB培养基(细菌-蛋白胨10克/升+细菌-酵母粉5克

        /升+NaCl，10克/升)+0.5％W/V)六水合琥珀酸钠72W         E₂+1％(W/V)葡萄糖+0.4％(W/V)己二酸胺

初始生长时，10毫升合适的培养基被接种0.1毫升冷冻的储存物，28℃下250转/分振荡培养过夜，生长细胞的悬液被转入装在2升烧瓶中的1升相同培养基中继续在28℃振荡培养。这1升生长的细胞悬液被加入装9升相同培养基的10升发酵罐中继续生长。发酵条件为：大于等于80％的氧饱和度，25℃，pH7.2及300-1000转/分。20-91小时后，发酵罐被冷却至8-12℃并离心收集细胞。浓缩的细胞沉淀立即用干冰冷冻并存于-70℃备用。许多其它在E2基本培养基中作为细胞生长的碳源和氮源的添加物是本领域技术人员所熟知的。这些培养基以及复杂营养培养基可被用于生产生物催化剂。上述特定的培养基不应被视为限制。

具有腈水解酶活性的细胞被从培养液中收集起来用于细胞悬液储存或用于制备固定化细胞然后再存于细胞悬液。在储存或用于固定化之前，细胞可不经洗涤直接使用，也可用储存所用的缓冲液洗涤后再用于储存或固定化。细胞也可从培养液中分离出来经过冷冻再用于细胞悬液储存或固定化细胞悬浮物。

腈水解酶检测

未固定化细胞的腈水解酶活性或通过将苯甲腈转化为苯甲酸后用分光光度计测定245nm处的吸光值增加来测定，或通过用高效液相色谱测定2-甲基戊二酸腈转化为4-氰基戊酸铵来测定。在苯甲腈法测定中，每毫升5毫克冷冻的湿细胞沉淀被悬浮在0.1M的磷酸缓冲液(pH7.0)中。苯甲腈被加入至终浓度1mM。悬液在30℃，250转/分振荡，0.5，1，2和4分钟时取样加入4倍体积的0.04M的磷酸缓冲液中终止反应。5分钟后15800xg离心，最终的上清液用分光光度计测定。根据缓冲液和终止液中苯甲腈和苯甲酸的经验测定的消光系数，腈水解酶的单位活性可由下式计算，其中x指比色池长度，单位厘米(用稀释液作参比)：

        ΔC(摩尔)＝ΔO.D.₂₄₅/1.81摩尔^-1cm^-1(X)

在2-甲基戊二酸腈法测定中，在0.100M磷酸氢二钾(pH7.0)缓冲液中的每毫升50毫克干重的1毫升细胞悬液(约每毫升200毫克冷冻的细胞沉淀)被加入25℃3.0毫升0.4M的2-甲基戊二酸腈的去离子水的溶液中。反应混合物通过搅拌保持在25℃，0.180毫升的几等份被取出与用去离子水配制的5微升6.0N的盐酸及20微升外标液(0.75M的N-甲基丙酰铵)混合，最终的混合物被立即混匀，然后12000转/分离心2分钟，上清液用高效液相色谱法测定，检测器为示差折光检测器，柱子为SupelcosilLC-18-DB柱(25cm×4.6mm直径)，用含有10mM乙酸钠、10mM乙酸和7.5％甲醇的水溶液作流动相。

固定化细胞的腈水解酶活性通过在25℃混合16.5克固定化细胞催化剂和10.8克2-甲基戊二酸腈及72.1毫升20mM的磷酸缓冲液来测定。几等份(0.180毫升)被取出并与用去离子水配制的5微升6.0N的盐酸和20微升外标液(0.75M的N-甲基丙酰铵)混合，最终的溶液被立即混匀，然后12000转/分离心2分钟，上清液通过上述的高效液相色谱法测定4-氰基戊二酸盐。

固定化

含有腈水解酶的细胞可以用本领域技术人员熟知的任何方法和程序来固定化。这些方法包括，但不限于用藻酸盐，角叉菜聚糖，聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶固定化以及用离子交换树脂、硅藻土(塞立特)、活性炭、硅、多孔玻璃珠、氧化铝、氧化锆、氧化钛等吸收或吸附来固定化。

稳定化合物

本发明中用于稳定腈水解酶及保持非固定化或固定化细胞完整性(防止微生物污染或细胞裂解)的化合物选自无机碳酸盐或碳酸氢盐。典型的无机盐包括，但不仅限于钠盐、钾盐和铵盐。从这些化合物中选出一种化合物用作腈水解酶的稳定剂，或选出两种或多种共同用于保护液。含有碳酸盐或碳酸氢盐的溶液也可以通过用合适pH的调节物滴加于含有二氧化碳的缓冲液中就地制备出。在角叉菜聚糖固定化细胞的情况下，优选铵盐或钾盐，因为这些阳离子有助于增加角叉菜聚糖凝胶的交联度。在藻酸盐固定化细胞的情况下，可选地将任何高达5mM钙离子(例如以乙酸钙的形式)加至碳酸盐或碳酸氢盐，因为钙离子有助于增加藻酸盐凝胶的交联度。优选添加钙离子的浓度为约0.2-0.5mM。除了稳定非固定化或固定化细胞的腈水解酶活性外，碳酸盐和碳酸氢盐的使用也防止非固定化或固定化细胞悬液的微生物污染或腐败。

运用戊二醛和聚乙烯亚胺来对非固定化微生物细胞(U.S.4,288,552和U.S.4,355,105)和固定化微生物细胞(Takata等，生物工艺与技术。16：53-65(1993)；Tosa等，生物技术与生物工程。21：1697-1709(1979)；Bahulekar等，酶与微生物技术。13：858-868(1991)；Chao等，生物技术与生物工程。28：1289-1293(1986))进行化学交联以显著增加这些催化剂在多种应用反应条件下，包括生产高浓度羧酸盐中的酶活稳定性已被报道。进行化学交联并随后储存于不含碳酸盐或碳酸氢盐的缓冲液中的非固定化或固定化细胞长时间并不能阻止腈水解酶活性的损失。碳酸盐或碳酸氢盐也可被用于稳定用戊二醛和聚乙烯亚胺化学交联的非固定化或固定化细胞的腈水解酶活性或保持其完整性(防止微生物污染或细胞裂解)。

保护液中的无机碳酸盐或碳酸氢盐浓度可从约0.10M至饱和浓度。每种盐的饱和浓度随温度和浓度而变化，对稳定固定化催化剂来说，优选0.25-1.0M。在非固定化细胞中观察到碳酸氢盐的浓度大于或等于0.5M时，尽管腈水解酶活性并未损失，但细胞悬液发生了异质化，所以稳定非固定化细胞的无机盐浓度，优选0.10-0.50M。

优选悬液pH为5-10，更优选6.5-8.0。储存液的pH可用合适的酸，如乙酸、盐酸、硫酸或磷酸或合适的碱，如氨水、氢氧化钠或氢氧化钾来调节。

非固定化和固定化细胞在含有一种或多种碳酸盐或碳酸氢盐溶液中稳定保存的温度可以从约0℃(或稍高于保护液的冰点)-45℃，优选5-30℃。

本发明在下述实施例中被进一步详细说明。应当理解的是，当提到本发明的优选实施方案时，这些实施例仅通过例证来给出，从上述讨论和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征。在不偏离其实质和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以将其应用于不同用途和条件。

                        实施例

适合细菌培养物保持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于以下实施例中的技术可以参见普通微生物学方法手册(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W。Nester，WillisA.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，编辑)，美国微生物学会，华盛顿(1994)或Thomas D.Brock编著的生物技术：工业微生物学教科书，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。所有用于细菌细胞生长和保持的试剂和材料都购自Aldrich C hemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboraries(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有说明。

缩写的意思如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“d”指天，“l”指微升，“ml”指毫升，“l”指升，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔每升，“mmol”指毫摩尔。

                       实施例1

     非固定化敏捷食酸菌细胞腈水解酶活性储存稳定性

敏捷食酸菌72W细胞通过离心从培养液中分离出来，然后悬浮在pH7.3的磷酸钾溶液(0.10或1.00M)、乙酸钠溶液(0.10或1.00M)或碳酸钠溶液(0.10或0.30M)中，浓度为1-5％细胞干重，最终悬浮液在5℃储存于加盖玻璃瓶中，长时间后从细胞悬液中取样分析腈水解酶活性。

表1说明了储存的细胞悬液的相对腈水解酶活性，保存0天的悬液的腈水解酶活性被定义为100％。与存于0.10M或1.0M乙酸钠或磷酸钾溶液相比，存 于0.10M或0.30M碳酸钠溶液中的细胞92天仍保持相当高百分比的初始腈水解酶活性。

                            表1

腈水解酶活性(％)天磷酸二氢钾乙酸钠碳酸氢钠0.10M1.00M0.10M1.00M 0.10M 0.30M 0100100100100 100 100 3993868782 97 -- 41-------- -- 106 6496867282 104 -- 69-------- -- 92 9281786376 95 95

                     实施例2

      敏捷食酸菌72W在角叉菜聚糖颗粒中的固定化

敏捷食酸菌72W湿细胞沉淀(45g)与45ml 0.88％的氯化钠混合，最终悬液50℃加热1小时以失活不受欢迎的腈水合酶活性。然后50℃的细胞悬液伴随混合被加入55℃ 135.0g5％重量百分比的PronovaISAGEL300角叉菜聚糖溶液。最终悬液立即降温至5℃冰/水浴1小时而凝胶化。最终的凝胶被切成直径约2mm的颗粒，且固定化的细胞颗粒在450ml 0.30M的氯化钾、20mM磷酸二氢钾(用氢氧化钾调pH7.0)溶液中5℃保持18小时而硬化。通过用5mM的氯化钾、20mM磷酸二氢钾(pH7.0)在5℃洗涤固定化细胞颗粒三次去除硬化溶液。

                       实施例3

      敏捷食酸菌72W在聚丙烯酰胺凝胶颗粒中的固定化

25℃溶于15ml水中的13.8g丙烯酰胺和1.20g亚甲基双丙烯酰胺溶液被伴随搅拌加入10℃ 30g(细胞湿重)敏捷食酸菌72W伴随搅拌加入82ml 0.10M磷酸二氢钾(pH7.0)的悬液中。最终混合物被加入至25℃二氨基丁烷(0.45ml)和7.5ml 5％(重量体积比)的过硫酸钾溶液中。最终的聚合物凝胶在10℃冰浴保存1小时，然后切成直径约2mm的颗粒。该固定化细胞颗粒在5℃用50mM的磷酸二氢钾(pH7.0)溶液洗涤两次。

                       实施例4

         固定化敏捷食酸菌腈水解酶活性储存稳定性

敏捷食酸菌72W细胞(5％细胞干重)如例2一样被固定于PronovaISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中，且最终的固定化的催化剂颗粒悬浮于pH7.3的1.0M的磷酸钾、乙酸铵、丙酸铵、碳酸氢铵或硫酸铵或50mM含有1.0M氯化钠的磷酸钾溶液中。最终的固定化催化剂悬液存于5℃加盖玻璃瓶中，随时间过去取样测定固定化敏捷食酸菌72W细胞的腈水解酶活性。

表2说明了储存的固定化细胞悬液的相对的腈水解酶活性，定义0天的活性为100％。与存于pH7.35℃1.0M的磷酸钾、乙酸铵、丙酸铵或50mM含有1.0M氯化铵的磷酸钾溶液相比，存于1.0M碳酸铵溶液中的固定化细胞保持了相当高百分比的初始腈水解酶活性。

                            表2

天                         腈水解酶活性(％) 碳酸氢铵 (1.0M) 磷酸二氢钾 (1.0M) 乙酸铵 (1.0M) 丙酸铵 (1.0M) 氯化铵 (1.0M) 磷酸二氢钾 (50mM) 硫酸铵 (1.0M)0 100 100 100 100 100 10015 -- -- -- -- -- 9323 96 71 78 84 83 --27 -- -- -- -- -- 7243 -- 53 -- 79 -- --45 98 -- 67 -- -- --46 -- -- -- -- 67 --56 102 -- 60 -- -- --60 -- -- -- -- 62 --74 -- -- -- 73 -- --81 99 -- 50 -- -- --95 -- -- 40 -- -- --98 107 -- -- 66 -- --

                         实施例5

固定化敏捷食酸菌腈水解酶活性的储存稳定性

敏捷食酸菌72W细胞(5％的干细胞重)如例2一样被固定于Pronova ISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中，最终的催化颗粒悬浮于pH7.3的1.0M碳酸氢铵中。最终的固定化催化悬浮液于25℃储存于一个加盖玻璃瓶中，并随时间的过去而取样且测定敏捷食酸菌72W细胞的腈水解酶活性。

表3显示了储存的固定化细胞悬液的相对腈水解酶活性，定义0天的活性为100％。

         表3

天腈水解酶活性(100％)碳酸氢铵 0 100 10 94 23 94 38 92 59 93 78 88 105 91

                        实施例6

固定化敏捷食酸菌悬液的微生物污染

敏捷食酸菌72W细胞(5％的干细胞重)如例2一样被固定于Pronova ISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中或如例3一样被固定于聚丙烯酰胺凝胶(PAG，10％重量百分比)中，且最终的催化颗粒悬浮于如下物质的水溶液中：a)50mM磷酸钾(pH7.0)；b)1.0M乙酸铵(pH7.3)；c)1.0M碳酸氢铵(pH7.3)；或d)50mM磷酸钾/1.0M氯化铵(pH7.3)。最终的固定化催化悬浮液于5℃储存于一个加盖玻璃瓶中，并随时间的过去取储存溶液的样品。通过测定在600nm处的光密度(OD)改变检查样品的微生物污染。

表4显示了5℃储存于1.0M碳酸氢铵中的固定化细胞比储存于1.0M磷酸钾、乙酸铵、丙酸铵、或含有1.0M氯化铵的50mM磷酸钾的保留了引人注目地更高的初始腈水解酶活性的百分率。通过测定随时间过去储存缓冲液光密度增加说明的微生物污染，发生于储存于50mM磷酸钾中的固定于聚丙烯酰胺凝胶或RG300角叉菜聚糖的细胞，但储存于1.0M乙酸铵、碳酸氢铵、或1.0M氯化铵/50mM磷酸钾中的细胞没有观察到足够的微生物污染或腐败。三种没有显示污染或腐败的储存悬液中，仅有储存于1.0M碳酸氢铵中固定化细胞没有显示腈水解酶活性的显著降低(见例4，表2)。

                       表4

天                            OD(600nm) PAG 磷酸二氢钾 (50mM) RG300 磷酸二氢钾 (50mM) RG300 乙酸铵 (1.0M) RG300 碳酸氢铵 (1.0M) RG300 氯化铵(1.0M) 磷酸二氢钾 (50mM) 1 - 0.026 0.055 0.045 0.054 2 0.061 - - - - 5 0.047 0.075 - - 0.035 8 0.079 0.137 - - 0.017 11 0.207 - - - - 12 - 0.115 0.008 0.001 0.040 15 0.360 - - - - 16 - 0.276 - - 0.067 18 0419 - - - - 19 - 0.221 - - 0.033 23 - 0.521 - - 0.050 26 - - 0.029 0.073 - 33 - - 0.027 0.082 - 46 - - 0.048 0.104 - 47 - - - - 0.032 57 - - 0.085 0.072 - 61 - - - - 0.033

                       实施例7

敏捷食酸菌72W在用戊二醛/聚乙烯亚胺交联的角叉莱聚糖珠中的固定化

在250ml瓶中装入磁力搅拌子和64g 50℃的水，随着快速的搅拌缓慢地加入3.38g的角叉菜聚糖。随着快速地搅拌，加热这种混合物至75-80℃直到角叉菜聚糖完全溶解，且最终的溶液在自动调温的水浴中冷却至55-56℃(胶温度大约52℃)。23.4g的敏捷食酸菌72W细胞(细胞湿重)悬浮于21.56g 0.30M碳酸氢钠缓冲液(pH7.3)的悬浮液被加热至50℃1小时，以失活腈水合酶。然后，随着搅拌，50℃的这种细胞悬液被加至55-56℃的角叉菜聚糖溶液，接着，该细胞/角叉菜聚糖混合物伴随搅拌缓慢地加至50℃ 450ml的豆油中，用高架的搅拌子搅拌。通过控制搅拌速率，制备出期望大小的细胞/角叉菜聚糖小滴后，降低油温至35℃，以凝胶小滴，并从最终的珠子中倒出油。用在50mM磷酸钾中含0.3M氯化钾的缓冲液洗珠子，然后重悬于250ml同样的缓冲液中，并加入2g 25％的戊二醛水溶液并在25℃混合0.5小时。然后向混合物中加入9.0g的11％的聚乙烯亚胺(BASF Lupasol PR971L，平均分子量大约750,000)水溶液并在25℃混合1小时。用在50mM磷酸钾中含0.3M氯化钾的缓冲液洗珠子并在5℃同样的缓冲液中储存至少18小时，以进一步增加珠子的硬度。

                          实施例8

戊二醛/聚乙烯亚胺交联的、固定化的敏捷食酸菌72W腈水解酶活性的储存稳定性

敏捷食酸菌72W细胞(5％的干细胞重)如例7描述的被固定于Pronova ISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中，且最终的催化珠子被悬于pH7.3的1.0M碳酸氢铵水溶液中。该最终固定化催化悬液被储存于5℃加盖玻璃瓶中，并随时间的过去取样并测定敏捷食酸菌72W细胞的腈水解酶活性。

表5显示了储存的固定化悬液的相对腈水解酶活性，定义0天的活性为100％。

        表5

天 腈水解酶活性(％)061106204285 100 92 95 90 88

                         实施例9

戊二醛/聚乙烯亚胺交联的、固定化的敏捷食酸菌72W腈水解酶活性的储存稳定性

敏捷食酸菌72W细胞(5％的干细胞重)如例7描述的被固定于Pronova ISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中，且最终的催化珠子被悬于pH7.3的0.3M碳酸氢铵或碳酸氢钾水溶液中。该最终催化悬液被储存于5℃加盖玻璃瓶中144天，然后测定催化珠子样品的腈水解酶活性。储存于0.3M碳酸氢铵和碳酸氢钾的催化珠子分别有93％和97％的初始活性。

                          实施例10

大肠杆菌SS1001在用戊二醛/聚乙烯亚胺交联的角叉菜聚糖珠中的固定化

在250ml瓶中装入磁力搅拌子和64g 50℃的水，随着快速的搅拌缓慢地加入3.38g的角叉菜聚糖。随着快速地搅拌，加热这种混合物至75-80℃直到角叉菜聚糖完全溶解，且最终的溶液在自动调温的水浴中冷却至55-56℃(胶温度大约52℃)。24.5g的大肠杆菌SS1001细胞(细胞湿重)悬浮于20.5g 0.30M磷酸钠缓冲液(pH7.3)的悬浮液被加热至50℃12分钟，然后，随着搅拌，被加至55-56℃的角叉菜聚糖溶液。该细胞/角叉菜聚糖混合物伴随搅拌立即缓慢地加至50℃ 450ml的豆油中，用高架的搅拌子搅拌。通过控制搅拌速率，制备出期望大小的细胞/角叉菜聚糖小滴后，降低油温至35℃，以凝胶小滴，并从最终的珠子中倒出油。用0.1M碳酸氢钾缓冲液(pH7.0)洗珠子，然后35g的珠子被重悬于83ml同样的缓冲液中，并加入0.875g的25％的戊二醛水溶液并在25℃混合0.5小时。然后向该混合物中加入3.5g的12.5％的聚乙烯亚胺(BASF Lupasol PR971L，平均分子量大约750,000)水溶液并在25℃混合1小时。然后用0.3M碳酸氢铵缓冲液(pH7.3)洗珠子并在5℃同样的缓冲液中储存。

                        实施例11

戊二醛/聚乙烯亚胺交联的、固定化的大肠杆菌SS1001腈水解酶活性的储存稳定性

大肠杆菌SS100细胞(5％的干细胞重)如例10被固定于PronovaISAGEL RG300角叉菜聚糖(3％wt％)中，且最终的催化珠子被储存于0.3M碳酸氢铵、加盖玻璃瓶中5℃70天。该储存期后测定腈水解酶活性，催化珠子样品有90％的初始腈水解酶活性。

申请人或代理人挡案号国际申请号

                    关于微生物保藏的说明

                         (细则13之二)

A.对说明书第    3    页，第32    行所述的微生物的说明B.保藏事项保藏单位名称    美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 University Blvd，Manassas，Virginia 20110-2209保藏日期    1996年3月8日                 保藏编号     ATCC 55747c.补充说明(必要时)对寻求欧洲专利的指定，保藏微生物的样品仅在欧洲专利被授权或本申请被驳回或视为撤回时才得发放，发放对象限于请求获得该样品的人指定的专家。(Rule 28(4)EPC)D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)E.补充说明(必要时)下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

申请人或代理人挡案号国际申请号

                     关于微生物保藏的说明

                         (细则13之二)

A.对说明书第    3    页，第31        行所述的微生物的说明B.保藏事项保藏单位名称    美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 University Blvd，Manassas，Virginia 20110-2209保藏日期        1996年3月8日         保藏编号    ATCC 55746C.补充说明(必要时)对寻求欧洲专利的指定，保藏微生物的样品仅在欧洲专利被授权或本申请被驳回或视为撤回时才得发放，发放对象限于请求获得该样品的人指定的专家。(Rule 28(4)EPC)D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)E.补充说明(必要时)下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

申请人或代理人挡案号国际申请号

                  关于微生物保藏的说明

                     (细则13之二)

A.对说明书第      4    页，第  1        行所述的微生物的说明B.保藏事项保藏单位名称      美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 University Blvd，Manassas，Virginia 20110-2209保藏日期     2000年3月11日        保藏编号    ATCCPTA-1177C.补充说明(必要时)对寻求欧洲专利的指定，保藏微生物的样品仅在欧洲专利被授权或本申请被驳回或视为撤回时才得发放，发放对象限于请求获得该样品的人指定的专家。(Rule 28(4)EPC)D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)E.补充说明(必要时)下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

申请人或代理人挡案号国际申请号

                 关于微生物保藏的说明

                     (细则13之二)

A.对说明书第    3    页，第  30       行所述的微生物的说明B.保藏事项保藏单位名称    美国典型培养物保藏中心保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 University Blvd，Manassas，Virginia 20110-2209保藏日期     1996年3月8日     保藏编号    ATCC 55745C.补充说明(必要时)对寻求欧洲专利的指定，保藏微生物的样品仅在欧洲专利被授权或本申请被驳回或视为撤回时才得发放，发放对象限于请求获得该样品的人指定的专家。(Rule 28(4)EPC)D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)E.补充说明(必要时)下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)