配子体花粉自交不亲和性基因及其应用

摘要

本发明提供了一种金鱼草S基因,该基因具有说明书所述的核苷酸序列。本发明还提供了使用该基因鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的方法、用于鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的PCR引物对、以及一种改变金鱼草自交不亲和性的方法。

说明书

本发明是关于显花植物金鱼草配子体自交不亲和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)位点(S位点)中一个基因的克隆，即花粉自交不亲和性基因(花粉S基因)，AhSLF-S2(Antirrhinum hispanicum S LocusF-box-S2)。本发明涉及AhSLF-S2的cDNA序列。金鱼草S位点编码的AhSLF-S2与自交不亲和性在花粉中的表达密切相关。本发明进一步涉及可用于金鱼草S2等位基因型鉴定的部分AhSLF-S2序列及其相关的寡聚核苷酸引物。本发明的主要用途是对自交不亲和金鱼草及其相关植物进行花粉S基因型的快速鉴定和分离配子体花粉S基因的方法。

高等植物花粉落到柱头上后开始萌发，然后花粉管沿着雌蕊细胞间隙或表面生长，最终到达子房完成双受精过程。由于植物很难自主控制落到其柱头上的花粉，它们在长期进化过程中形成许多在受精前区分有利花粉的策略，有些种类花粉将被阻止萌发或生长。这类被抑制的花粉有来自不同种植物的，还有来自同种植物但与该个体基因型过于一致的(比如来自同一植株的花粉)，前者称为种间不亲和性(inter-specificincompatibility)，后者称为种内不亲和性(intra-specific incompatibility)。事实上，种间不亲和性益于保持物种的稳定性，种内不亲和性则可促进种内的遗传变异。这两种不亲和性的发生涉及许多复杂的受遗传控制的相互作用，包括细胞间的相互识别，细胞内和细胞间的信号传导，以及许多其它相关的影响因子，其中任一过程受阻都可能导致不亲和性。

在种内不亲和性中，最典型的代表是自交不亲和性(self-incompatibility，简称为SI)，表现为正常可育的雌雄同花植物自花授粉不能产生种子(de Nettancourt，1977)。在高等植物中，据估计有超过一半的物种表现出自交不亲和性，并被认为在被子植物早期进化中起到了不可低估的作用(de Nettancourt，1977)。

绝大多数SI植物在遗传上受具有复等位基因的单一位点或基因座(称为S locus)控制(de Nettancourt，1977)。单位点SI又可根据花粉不亲和表型的遗传控制方式的不同分为两类，一类是花粉的自交不亲和表型由其携带的单倍体S等位基因型决定，即配子体自交不亲和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)；另一类为孢子体自交不亲和性(sporophytic self-incompatibility，SSI)，即花粉表型由产生花粉的植株即二倍体孢子体S等位基因型决定。早期人们认为这两种机制间的不同可能是由于S基因表达时间的差异造成的。SSI的S基因产物在减数分裂前合成，并均匀分布在两种不同S基因型的单倍体花粉胞被上，而GSI的S基因产物则在减数分裂后合成，只存在于各自的花粉中(Newbigin et al，1993)。但是，现有的证据表明SSI植物的花粉自交不亲和性(花粉S)基因产物为配子体表达模式，只是由于花粉S基因产物为分泌到花粉细胞外的胞被蛋白，因此一个花粉可以携带来自两个不同花粉S基因产物，造成了与孢子体S基因型一致的结果(Stephenson et al，1997；Doughty et al，1998；Schopfer et al.，1999；Cui et al.，2000；Takayama et al.，2000)。

大多数SI植物表现为GSI，目前较为细致地研究了其中的茄科，蔷薇科，玄参科和罂粟科植物(Anderson et al.，1986；Franklin et al.，1995；Xue et al.，1996；Sassa et al.，1996；Kao and McCubbin，1997)。在前三科的自交不亲和植物中，不亲和花粉可在柱头表面萌发，花粉管生长的抑制发生在传递组织中，在此导致不亲和花粉的花粉管生长的抑制，然而罂粟的不亲和花粉在柱头表面萌发后即受到抑制。

通常，根据SI的遗传、生理特性，要分离S等位基因产物就需要寻找与特异S基因共分离的雌蕊或花粉蛋白。比如，要分离植株在雌蕊中S₁基因型的特异产物，就要寻找一类在所有具S₁基因的植株中都有，而在所有无S₁基因的植株中都没有的雌蕊特异蛋白。

1952年，Lewis在配子体自交不亲和植物月见草(Oenothera organesis)中首次发现了与特定S等位基因相关的蛋白质。此后，研究人员从茄科等植物中发现含量丰富并与S位点遗传连锁的花柱糖蛋白(S locusglycoproteins，SLG)。通过设计与这些糖蛋白N-端序列同源的寡核苷酸探针和分子杂交的方法，1986年，Anderson等从花烟草(Nicotiana alata)中第一次分离到与GSI相关的编码S位点花柱糖蛋白的cDNA。DNA序列分析发现其蛋白产物与真菌的一类RNase Rh和T₂(Kawata et al.，1988)具有同源性，且其含同样的活性部位，因此具有RNase活性，故而称为S—核酸酶(S-RNases)(McClure et al.，1989)。目前已有的证据证明S-RNase控制自交不亲和性在花柱中的表达(花柱S基因)(Anderson et al.，1986 and1989；Cornish et al.，1987；McClure，et al.，1989 and 1990；Ai et al.，1990；Huang et al.，1994；Lee et al.，1994；Xue et al.，1996；Sassa et al.，1997；Zureket al.，1997；Matton et al.，1997 and 1999；Dodds et al.，1999)。

但是，目前在GSI植物中还没有分离到花粉S基因产物。因此，本发明的目的是分离GSI植物的花粉S基因，并研究所分离的基因和发展快速鉴定金鱼草花粉自交不亲和表型及其分离花粉S基因的方法。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的方法。

本发明提供了一种鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的方法，该方法包括：

(1)选取两个金鱼草植株，提取基因组DNA；

(2)按照本发明公开的金鱼草S基因设计两个PCR引物；

(3)使用所设计的PCR引物对提取的金鱼草基因组DNA进行PCR反应，并对该PCR产物进行测序；

(4)如果该两株金鱼草之间的PCR产物的DNA序列相同，则该两株金鱼草植株之间是自交不亲和的，如果该两株金鱼草之间的PCR产物的DNA序列不相同，则该两株金鱼草植株之间是自交亲和的。

在本发明的上述方法中，按照本发明的金鱼草基因设计PCR引物以及使用所设计的引物进行PCR扩增可按照现有技术中已知的方法进行。

本发明的再一个目的是提供一种用于鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的PCR引物对。

本发明的用于鉴定金鱼草植株之间自交亲和性的PCR引物对可以是本发明所公开的金鱼草S基因的任何一个片段，只要上游引物和下游引物之间的距离在10到1970个碱基之间；优选在50到1000个碱基之间；最好在100到500个碱基之间。该引物对中的每一个引物的长度可以是6个到50个碱基，优选15到30个碱基；最好为20个碱基。

本发明的又一个目的是提供一种改变金鱼草自交不亲和性的方法。

本发明的改变金鱼草自交不亲和性的方法包括：

(1)将本发明的正义AhSLF-S2基因克隆到植物转化载体中；

(2)将所构建的植物转化载体转化可再生的金鱼草组织并使本发明的基因在转化的组织中表达；

(3)将被转化的组织培养成植株。

通过该方法得到的金鱼草植株具有S核酸酶系统的GSI植物中获得该基因的特异性，使它们产生相应的花粉自交不亲和性。

本发明的另一种改变金鱼草自交不亲和性的方法包括：

(1)将反义AhSLF-S2基因克隆到植物转化载体中；

(2)将所构建的植物转化载体转化可再生的金鱼草组织并使本发明的基因在转化的组织中表达；

(3)将被转化的组织培养成植株。

将反义AhSLF-S2转入植物中可以使其或有高度同源性基因的功能丧失，变成自交亲和的植物。这些构建为人产生自交不亲和和自交亲和特性提供了基础，是一种利用它们在多种GSI植物乃至作物中产生杂种优势的方法。

附图简要说明

图1金鱼草S2等位基因位点的物理结构及编码和推测的基因。基因转录的方向由盒式箭头表示。方盒表示外显子或编码区。预测的GENE9和GENE11分别编码S2核酸酶和AhSLF-S2。Kb，kilo base pairs。

图2AhSLF-S2的cDNA序列(序列一)。核苷酸的位置由数字标出。

图3AhSLF-S2的氨基酸序列。氨基酸的位置由数字标出。黑线标出F-box结构域。

图4SLF基因家族的氨基酸序列比较。来自拟南芥和水稻的SLF成员分别有它们的数据库登录号表示。拟南芥：Q64598，Q9SSK2，CAB79194，Q9SU30，AAF26066，Q9S9V1，Q9SI34，022742，AAF30317，Q9SFC7和Q9SDB2。水稻：BAA95875。S2GENE11代表AhSLF-S2。不同序列中相同氨基酸由黑框标出，灰框标出保守的氨基酸。位于N端的保守F-box结构域用黑线标出。

图5AhSLF-S2的组织特异表达的Northern分析。利用AhSLF-S2特异探针对来自不同S基因型的不同组织的RNA进行杂交。左侧的数字表示检测到的转录本的大小。Kb，kilo bases。

图6AhSLF-S2的组织特异和时空表达的RACE分析。A，来自S2S4基因型植株不同发育时期组织RNA的RACE产物的杂交结果。泳道1，2和3分别代表来自2mm长花药期的花药、花瓣和花托。泳道4，5和6分别代表来自花药成熟期的花药、花瓣和花托。B，来自S₂S₄基因型植株花药成熟期的花药(泳道1和2)和花柱(泳道3和4)RNA的RACE产物的杂交结果。C，来自S₂S₄(泳道1-4)和S₁S₅基因型植株(泳道5-8)不同发育时期花药和花粉RNA的RACE杂交结果。泳道1和5：<4mm花药；泳道2和6：1-2cm花药；泳道3和7，成熟花粉；泳道4和8：叶片。D，RACE所用基因特异和Adaptor引物位置示意图。G11a：AATGGGCCCATGCAACGGGC。CDSIII：ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N(N＝A，G，C，or T；N_-1＝A，G，or C)。箭头表示基因转录的方向。杂交探针为全长cDNA。

图7金鱼草S2基因型植株花粉基因型的DNA杂交分析。A，AhSLF-S2的DNA杂交结果。来自不同基因型的5μg基因组DNA分别经限制性内切酶HindIII或EcoRI酶解、凝胶电泳分离和转膜后，以AhSLF-S2的cDNA为探针进行杂交。实心箭头表示AhSLF-S2的杂交片段，空心箭头表示与AhSLF-S2同源的非S位点DNA片段。数字表示杂交片段的大小。泳道1-5代表的基因型分别为：S₁S₄、S₄S₅、S₁S₅、S_cS_c和S₁S₂。Kb，kilo basepairs。图下标出了探针的位置。B，S₂-核酸酶基因的DNA杂交结果。图示与A相同。

图8利用PCR快速鉴定金鱼草S₂基因型植株的花粉基因型。A，利用基因特异引物鉴定花粉S₂基因型的PCR分析结果。利用AhSLF-S2和S₂-核酸酶基因特异的引物，以不同基因型的基因组DNA(50ng)为模板分别进行PCR反应(94℃ 1min，35X(60℃ 1min，72℃ 1min)，72℃ 10min)。AhSLF-S2特异引物：G11e(ACAATCGACATGGCTAC)，G11f(GTTGTTGCATTCCCGTGAGGG)和G11j(ATTATTTGACATTTGGGTTATG)。S₂-核酸酶基因特异引物：G2338(ACAATCGACATGGCTAC)和G1280(GCTTGCCCCTTTCTCAAG)(Xue et al.，1996)。PCR产物经1％凝胶电泳分离后，EB染色显示DNA片段。泳道1-8代表的基因型分别为S₁S₄、S₄S₅、S₂S₅、S₁S₅、S₂S₅、S₄S₅、S₁S₅和S₂S₄。箭头标出S₂基因型特异的PCR扩增产物。B，AhSLF-S2基因特异引物位置示意图。

实施例植物材料

金鱼草自交不亲和的种间杂种的产生和不同S等位基因分离群体的获得参见Xue et al.(1996)。用于本发明的材料为含有S₂S₄和S₁S₅的品系(Xueet al.，1996)。它们分别按常规的栽培条件种植于温室。由于这些植物为自交不亲和，因此不能通过种子繁殖。它们的保持通过扦插完成。实施例1：金鱼草BAC文库的构建和筛选

首先从来自S₂S₄植株的叶片分离植物细胞核(Liu and Whittier，1994)。然后利用HindIII将DNA部分酶解后，克隆到同样酶切的BAC载体pBeloBAC11(Shizuya et al.，1992)。连接产物通过电转化的方法转化大肠杆菌DH10B。通过插入失活Laz基因的方法筛选含有外源DNA的插入子。对近100个插入子大小的分析发现平均插入子的大小为70kbp。将35000个克隆保存于96孔平板后，利用BIOMEK2000(Beckman)的机器人将这些克隆以高密度点阵方式点到29张HYBOND膜上(每张膜上点1182个克隆)。每个克隆重复点3次。膜经处理后(Sambrook etal.，1989)，保存于4℃。

为了获得含有S位点的BAC克隆，利用S₂核酸酶基因(Xue et al.，1996)为探针对金鱼草BAC文库进行了筛选(Sambrook et al.，1989)。其中一个阳性克隆经进一步的实验证实含有全长的S₂核酸酶，即S2BAC(图一)。脉冲场电泳分析发现该克隆的插入子大小约为63kbp。

为了确认S2BAC含有的序列为S位点序列，通过反向PCR(IPCR)和BAC末段测序的方法获得了两端约500bp的序列。通过设计片段对应的引物，在S等位基因的分离群体(Xue et al.，1996)中没有发现两端与S核酸酶基因有重组，表明S2BAC含有的序列全部来自S位点。实施例2：S2BAC的DNA序列分析

为了测定S2BAC中插入片段的全部序列，首先利用超声波处理的方法将纯化的S2BAC质粒DNA部分打断后，分离1-2kb的组分，然后亚克隆到pBluescript载体(Strategene，USA)。第二，挑选2000个有插入片段的转化子并制备质粒DNA(Sambrook et al.，1989)。第三，利用MEGABASE1000全自动DNA测序仪(Molecular Dynamics，USA)测定每个质粒两端的序列(每个测序反应平均获得的序列为400bp)。第四，将获得的序列通过计算机程序(STADEN PACKAGE，http//www.sanger.ac.uk/)进行组装后获得S2BAC插入子的全长序列(每个核苷酸平均被测的次数为10次)。序列分析表明S₂核酸酶基因位于该克隆约50kb的位置(参见图一)。利用GENSCAN等(http//www.sanger.ac.uk/)分析发现该克隆编码了11个预测的基因，其中包括S₂核酸酶基因，说明有可能这些基因为表达基因(参见图一)。但是，除S₂核酸酶基因外，数据库分析表明有其中三个基因(GENE4，6和8)可能编码反转座子，而其余的基因都没有在DNA数据库中发现与已知基因同源。实施例3：金鱼草花药cDNA文库的构建

收集并合并金鱼草不同时期的花药组织，提取RNA(Xue et al.，1996)。然后利用CLONTECH的SMART^TM试剂盒合成双链cDNA，并将其克隆在λTripEx2载体(CLONTECH，USA)中。插入子检测发现该cDNA文库的插入子大小平均为1kb。进一步的实验发现该文库的滴度1×10⁶。实施例4：一个代表花粉自交不亲和性基因AhSLF-S2 cDNA克隆的分离和鉴定

DNA序列分析表明S2BAC除了含有S₂核酸酶基因外还含有其它的基因，这些基因可能为自交不亲和基因。但是，如果为控制自交不亲和性的基因，如花粉S基因，它必须表现出应有的序列多态性和配子体基因表达的模式。为了分离S位点中具有花粉S基因特征的基因，对S2BAC中可能编码多态性的区域进行了“扫描”。每2kb设计一对引物，对不同S等位基因型的植株进行PCR分析。结果发现了GENE2，5，10和11位于多态性区域，这些区域内的基因可能编码花粉S基因。

为了分离花粉中表达的基因，利用多态性区域来的探针对上述构建的花药cDNA文库进行了筛选。获得了一个位于S₂核酸酶基因下游的GENE11的cDNA。该cDNA为1986个核苷酸(图二)，Northern杂交分析(Sambrook et al.，1989)表明它代表了一个全长的基因(见实施例5，图五)。金鱼草RNA的分离方法按照Xue et al.(1996)进行。计算机分析表明它编码一个376个氨基酸的蛋白质(图三)。与DNA序列的比较发现该基因不含内含子。数据库分析没有发现它与已知的基因同源。但是，在已测序的拟南芥和水稻基因组中发现了多个与其同源的推测基因(图四)。Pfam分析发现这类基因都含有一个保守的F-box结构域(图四)。因此，它们代表一类新的F-box基因。由于该家族发现的第一个表达基因来自S位点，所以将它们命名为SLF(S Locus F-box)。将从金鱼草S₂位点分离的SLF称为AhSLF-S2(Antirrhinum hispanicum SLF-S2)。结合AhSLF-S2的物理位置、表达模式和序列多态性方面(案例3和6)的证据，AhSLF-S2编码了一个金鱼草的花粉自交不亲和性基因，即花粉S基因。实施例5：AhSLF-S2的表达分析

RNA印迹杂交发现AhSLF-S2只在来自含有S₂等位基因植株的花药组织中表达，而在其它组织中不表达，其转录本的大小约为2kb(图五)。利用等位基因特异的引物，通过RACE分析发现AhSLF-S2只在减数分裂后的来自含有S₂等位基因植株的花药以及成熟花药中表达(图六)。这些结果说明AhSLF-S2为一个S₂等位基因特异的配子体基因，进一步表明它编码一个花粉S基因。实施例6：金鱼草S₂基因型的鉴定

利用AhSLF-S2引物和PCR的方法可以鉴定含S₂花粉基因型的金鱼草植株(图七)。同时，也可以利用AhSLF-S2来的DNA探针完成类似的工作(图八)。金鱼草DNA的提取、酶切和印记分析按照Xue et al.(1996)完成。实施例7：GSI植物花粉S基因的克隆

玄参科植物金鱼草和茄科以及蔷薇科植物的S位点都编码S核酸酶。根据这一相似性，它们的花粉S基因产物也应属于同一类。因此，通过分离S位点编码的SLF基因，可以获得这些SI植物的花粉S基因。首先构建目标植物的基因组DNA文库，并获得覆盖S位点的克隆，通过常规的分子生物学技术寻找具有SLF特征的基因即可获得目标植物的花粉S基因。

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