AP1Gs参与雄配子体发育和雌配子体介导的花粉管接纳的机理研究

摘要

被子植物的双受精是一个复杂的过程，包括雌雄配子体发育、花粉管生长、花粉管导向和花粉管接纳。花粉管感受雌配子体发出的信号导向雌配子体生长，之后进入雌配子体，随后助细胞发生程序性细胞死亡(programmed cell death PCD)，最终花粉管爆裂释放精细胞。之前有研究发现，细胞表面受体例如:FERONIA(FER)调控花粉管接纳过程，但是花粉管接纳过程的调控机理仍然不是很清晰。我们发现AP1Gs在花粉发育和花粉管接纳过程中发挥重要功能。AP1Gs编码适配蛋白复合体1(adaptorproteincomplex1，AP1)的γ(G)亚基。AP1是由μ(M)，σ，γ(G)和β四个亚基组成的异源四聚体，定位于反式高尔基体网络结构和早期内吞小体(trans-Golgi network/earlyendosome TGN/EE)，通过介导蛋白质分选，在细胞分泌和内吞过程中发挥重要功能。拟南芥AP1Gs由两个高度同源的基因编码，分别为AP1G1和AP1G2。我们发现AP1Gs功能缺失影响了花粉发育过程中液泡的动态变化和酸度，从而导致雄配子体完全败育;雌配子体为部分败育，具体表现在花粉管接纳方面的缺陷，即花粉管进入胚囊后在胚囊内持续生长，无法爆裂，精细胞无法释放。本研究的主要结果如下:
　　(1)AP1Gs介导的液泡动态变化和酸度在花粉发育过程中发挥重要作用。
　　AP1Gs的双突变体无法获得，通过互交实验证实纯合突变的花粉完全败育。通过成熟花粉中性红染色和BCECF-AM染色发现，纯合突变的花粉液泡酸度异常。在花粉发育过程中，伴随着液泡的动态变化。我们通过透射电子显微镜观察发现，AP1Gs功能缺失影响了花粉发育过程中液泡的动态变化。
　　(2)AP1Gs调控雌配子体介导的花粉管接纳。
　　互交实验结果表明AP1Gs功能缺失导致部分雌配子体败育。通过实验证实，花粉管进入胚囊后无法正常爆裂，即花粉管接纳过程异常。花粉管接纳过程中助细胞和花粉管之间的交流至关重要。这说明AP1 Gs功能缺失导致助细胞功能异常。
　　(3)AP1Gs定位于反式高尔基体网络结构和早期内吞小体(TGN/EE)。
　　我们获得了泛素启动子10(promoter ofubiquitin10，ProUBQ10)驱动的AP1Gs融合GFP的稳定转基因株系。外源的AP1Gs可以完全互补突变体在花粉方面的表型，说明突变体的表型是由AP1Gs缺失导致的。通过荧光双标记的方法证明AP1Gs定位于TGN/EE。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 雄配子体的发育和结构

1．1．1 雄配子体的发育

1．1．2 雄配子体的结构

1．2 花粉发育过程中液泡动态变化

1．3 雌配子体的发育和结构

1．3．1 雌配子体的发育

1．3．2 雌配子体的结构

1．4 花粉管的接纳

1．5 适配蛋白的类型、结构和功能

1．5．1 适配蛋白的类型

1．5．2 异源四聚体构成的适配蛋白复合体的结构和各亚基的功能

1．5．3 适配蛋白复合体的功能

1．6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料及生长条件

2．1．2 酶与各种生化试剂

2．2 方法

2．2．1 构建表达载体

2．2．2 拟南芥遗传转化及植物材料的鉴定

2．2．3 GUS染色

2．2．4 原位杂交分析

2．2．5 花粉萌发及花粉染色实验

2．2．6 扫描电子显微镜观察

2．2．7 树脂切片观察

2．2．8 透射电子显微镜观察

2．2．9 拟南芥胚珠光学切片观察

2．2．10 激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理

2．2．11 药剂处理及荧光染料染色

3 结果与分析

3．1 AP1Gs功能缺失突变体的表型分析

3．1．1 AP1Gs功能缺失突变体的鉴定

3．1．2 AP1Gs突变体的表型分析

3．2 AP1Gs的表达模式分析

3．2．1 启动子启动GUS报告基因分析AP1Gs表达模式

3．2．2 原位杂交检测AP1Gs的表达模式

3．3 AP1Gs的亚细胞定位及功能互补

3．3．1 AP1Gs的亚细胞定位研究

3．3．2 ap1g的功能互补

3．4 AP1Gs突变体影响了花粉液泡的酸性和花粉发育过程中液泡动态变化

3．4．1 AP1Gs突变体花粉发育过程中液泡动态组织机制异常

3．4．2 AP1Gs突变体花粉液泡酸性异常

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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