稳定的非水性单相粘性载体及采用该载体的制剂

摘要

本发明涉及稳定的非水性单相粘性载体和采用该载体的制剂。该制剂含有至少一种均匀混悬于所述载体中的有益物质。本发明制剂可持久地在较凉至体温的温度范围内贮存。该制剂可以约1－1×10－7倒易秒的出口剪切速率均匀地从植入给药系统中运送。

说明书

发明领域

本发明涉及稳定的非水性单相粘性生物相容载体，该载体可混悬有益物质并可以低流速均匀分散所述物质，具体地说，涉及有益物质处于稳定的非水性单相生物相容粘性载体中的稳定的均匀混合制剂。

参考文献

本说明书的相关部分方括号([])中的数字引用的是下列文献。1.    Wang，等.J.Parenteral Sci.Tech.，42：S4-S26页(1988年)。2.    Desai，等.J.Am.Chem.Soc.，116：9420-9422页(1994年)。3.    Chang，等.Pharm.Tech.，80-84页(1996年，6月)。4.    Manning，等.Pharm.Res.，6：903-918页(1989年)。5.    Hageman，Drug Dev.Ind.Pharm，14：2047-2070页(1988年)。6.    Bell，.Biopolymers，35：201-209页(1995年)7.    Zhang，等.Pharm.Res.，12：1447-1452页(1995年)。8.    PCT公开号98/001589.    PCT公开号981625010.   Knepp，等.Pharm.Res.，15(7)：1090-1095页(1998年)。11.   PCT公开号98/0015712.   PCT公开号98/0015213.   US554091214.   US557152515.   US551229316.   PCT公开号96/4004917.   Yu，等.J.Pharm.Sci.，85：396-401页(1996年)18.   Mitchell，US5411951(1995年)19.  Brooks，等.US5352662(1994年)20.  Geller，L.，US3869549(1975年)21.  Larsen，等.WO95/34285(1995年)22.  Knepp，等.J.Pharm.Sci.Tech，50：163-171页(1996年)23.  US561422124.  US459410825.  US530030226.  US458861427.  US431051628.  US563521329.  EP379147

发明背景

肽、多肽、蛋白质和其他蛋白质物质(如病毒、抗体)在此一并称为蛋白质，在疾病的防止、治疗和诊断方面有很大的药用价值。蛋白质在水性环境中有活性。因此，优选蛋白质制剂为水溶液。然而，蛋白质在水性溶液中不够稳定。蛋白质药品在外界条件下的存放期较短，需要冷藏。而且，许多蛋白质在水性溶液中的溶解度有限。即使能以高浓度溶解，也常发生聚集和沉淀。

由于蛋白质易于降解，因此用于此类化合物的标准给药方法是每日注射。蛋白质存在多种降解机理，包括天冬酰胺和谷酰胺的脱酰胺；蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸的氧化；肽键的水解；二硫化物交换；手性氨基酸残基的外消旋[1-7]。水是几乎所有降解途径的反应物。作为成形剂(Plasticizer)，水可促进蛋白质的伸展和不可逆聚集。由于水参与几乎所有蛋白质的降解途径，因此减少水性溶液而将蛋白质制成干粉，为提高蛋白质药品稳定性提供了另一制剂方法学。

一种稳定蛋白质的方法是用各种技术将其干燥，例如采用冷冻干燥、喷雾干燥、冻干和干燥。干燥的蛋白质在使用前以干粉形式贮存。

蛋白质干燥的一个严重缺陷是人们喜欢使用可流动形式的蛋白质。非肠道注射和缓释给药装置是受人喜欢可流动形式蛋白质的两个实施例。对于注射来说，干燥的蛋白质必需重建，这就增加了耗时步骤并且有可能产生污染，也可能将蛋白质暴露于不利稳定的环境下[7]。对于使用给药装置而言，蛋白质制剂必须在体温下持久稳定并且在装置的预定使用期内保持流动性。

用于蛋白质/肽溶液制剂的非水性极性非质子传递溶剂如二甲亚砜(DMSO)二甲基甲酰胺(DMF)，已被证实可在高温下持久稳定[8]。然而，由于一些蛋白质在此类溶剂中的溶解度低，因此含此类溶剂的制剂并不是对所有蛋白质都稳定。制剂中蛋白质的溶解度越低，用于运送特定量蛋白质的溶剂量就越大。低浓度溶液可能适于注射，但是不适于长期低速给药。

已有采用全氟萘烷[9，10]、甲氧氟烷[9]、水中高浓度[11]、聚乙二醇[12]、PLGA[13，14]、乙烯醋酸乙烯酯/聚乙烯吡咯烷酮混合物[15]、PEG400/聚维酮[16]将蛋白质制成给药制剂。然而，这些制剂不能使蛋白质在粘性载体中持久地保持均匀的混悬液。

许多生物活性化合物在水性环境中均降解。蛋白质不是溶解而是混悬于载体中，这样的载体可提高化学稳定性。另外，如果有益物质在所需载体中的溶解较低，那么将其混悬于载体中是有益的。然而，由于所混悬的有益物质易于凝结和聚集，混悬液的物理稳定性其实很低。在非水性载体中，这种问题随着活性化合物的浓度增加而加剧。

已有研究[17-21]将粉化蛋白质或肽分散到类脂载体载体中制备非肠道缓释制剂。所用载体可以是植物的(芝麻、大豆、花生等)或合成油类(如Miglyol)，它们用铝脂肪酸酯如硬脂酸铝(一-，二-或三聚)、或用聚甘油酯胶凝化。尽管理论上这些载体可防止溶液变性并可保护药物不发生水性化学降解，这些载体本身在较高温度下并不稳定。液态植物油在体温下贮存会形成活性种如游离脂肪酸和过氧化物(一种可被从某些植入装置流失的痕量金属离子如铜或铁加速的过程)。这些过氧化物对蛋白质稳定性并无影响[22]，但是可产生毒性，特别是直接向人或动物的中枢神经系统给药时。

缓释给药有许多益处，使用植入装置可确保病人用药顺应性，因为给药装置是防干扰的。仅仅需要将装置植入而不需每日注射，这减少位点刺激性。降低了医师的职业危险，降低了重复注射设备而提高了成本效果，减少废料处置的风险，并且与贮库式注射相比其控释效率提高。现有技术中已有许多药物或其他有益物质采用植入装置缓释给药。典型的装置可见专利US5034229、5057318、5110596和5782396的描述，其公开内容在此引入作为参考。

对于植入给药而言，剂量维持期一般可长达一年。适用于植入剂的药物主要是较低治疗给药速率的有益物质。当装置植入或贮存时，液体制剂中有可能产生有益物质的凝结。这种不均匀性对所分散的有益物质的浓度有负面影响。再就是植入的有益物质贮库的大小问题。植入贮库通常为25-250μl，但也可高达25ml。

采用用时和所用药物混合的两种单独组分[23]、加到水性组合物中的增稠剂[24]、加到水性药物溶液中的胶凝剂[25]、多孔织物片状基质[26]、含油状材料的增稠剂[27]、用于有限溶解度药物的粘性水性载体[28]、和可压的弹性凝胶[29]可制得粘性制剂。然而，这些制剂在用时混合，含有水性组分，采用片状基质，或经局部、口服或十二指肠给药。

可通过冷冻干燥、冻干或喷雾干燥活性成分来提高制剂的稳定性。干燥活性成分的优点还包括可对在水性溶液中相对不稳定的化合物进行处理并将其装入剂量容器中，在不升高温度下干燥并且以干燥状态贮存，这样稳定性问题就相对少一些。

药用制剂特别是非肠道给药产品，在尽可能短的时间内装入并密封于最终容器中后应当灭菌。(可参见Remington，PharmaceuticalSciences，第15版.(1975年))。灭菌技术的实施例包括热或干热、除菌(aseptic)和电离辐射。也可联合使用上述灭菌方法。

有必要将蛋白质组合物运送到体内，并且使其在体温下持久稳定从而可长期给予蛋白质。也有必要运送有效浓度的蛋白质。因此，需要一种新颖的非水性制剂，它在体温下可持久地低流速均匀混悬和分散蛋白质。

                      发明简述

本发明提供可形成蛋白质均匀混悬液的稳定的单相非水性生物相容粘性载体。该粘性载体的组分包括至少聚合物、表面活性剂和溶剂中的两种组分。依据组分的分子量和最终载体所需的粘度可变化组分间比率。优选组分的比率为：聚合物约5-60％、溶剂约30-50％和表面活性剂约5-20％。

本发明还提供稳定制剂，其中有益物质均匀地混悬于稳定的单相非水性生物相容粘性载体中。具体而言，粘性载体中有益物质的浓度至少为0.1％，这取决于有益物质的效力。这些稳定制剂可持久地(1-12月或更长)在有益物质适宜的温度下贮存，温度可从较凉至体温(约37℃)。在一个优选实施方案中，制剂中可含有0.1-50％(w/w)的有益物质，这取决于有益物质的效力、治疗时间和给药系统的释放率。

这些制剂特别适于植入给药系统在体温优选约37℃下低流速长期(如1-12月或更长)给予药物。本发明可持久地向体内运送蛋白质，这样就可以约0.3-100μl/天、优选约0.3-4μl/天的低流速长期给予蛋白质达约6个月，优选以5-8μl/天的流速给药约3个月。

本发明另一方面还提供制备含有益物质的单相粘性载体的非水性生物相容制剂的方法。优选的制剂含有0.1-50％(w/w)的有益物质，这取决于有益物质的效力、治疗时间和给药系统的释放率。

本发明另一方面还提供一种治疗疾病的方法，其中患者患有给予有益物质可减轻的疾病，该方法包括将治疗有效量的稳定的非水性制剂给予患者，所述制剂含有至少一种均匀混悬于单相粘性载体中的有益物质。

另一方面，本发明含有有益物质的非水性单相粘性载体在广泛的温度范围内可长期保持化学和物理稳定性。单相粘性载体中的有益物质在广泛的温度范围内也可持久地保持化学和物理稳定性。这样，这些制剂可在低于、等于或高于室温的环境下长期运输和贮存。它们也适用于要求其所含制剂在体温下持久稳定的植入装置。

本发明制剂采用植入给药系统运送时也可保持稳定。当从植入给药系统以低流速释放时，有益物质可持久地表现为零级释放速率。

                   附图简述

图1为37℃下用反相HPLC测定的本发明hGH制剂的稳定性。

图2为37℃下用粒度排阻色谱测定的本发明hGH制剂的稳定性。

图3为本发明含10％喷雾干燥溶菌酶的制剂的平均释放速率(μl/天)。

图4为含10％喷雾干燥hGH的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮载体的平均释放速率(μl/天)。

图5为含10％溶菌酶的月桂醇/聚乙烯吡咯烷酮载体的平均释放速率(μl/天)。

图6为含25％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮载体的平均释放速率(μl/天)。

图7为含33％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮载体的平均释放速率(μl/天)。

图8为含45％溶菌酶的甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮载体的平均释放速率(μl/天)。

                           发明详述

本发明涉及出人意料的发现：将有益物质均匀分散于非水性单相生物相容的粘性载体中，所得的稳定制剂可在体温下持久地低流速给药。已知用含或不含赋形剂的水性或非水性溶液缓冲的有益物质制剂，由于其不能在体温下持久地低流速均匀分布而出现了不可接受量的制剂聚集或降解。本发明要求保护的制剂使有益物质稳定，并且可在有益物质适宜的温度下贮存。温度可以持久地从较凉(不超过8℃)至体温(约37℃)。这些制剂特别适于植入给药系统在体温优选约37℃下低流速长期(如1-12月或更长)给药。

标准的有益物质制剂由稀释的水性或非水性溶液或混悬液组成。通过调节以下条件中的一项或几项可以稳定药物：pH、缓冲剂类型、离子强度、赋形剂(EDTA、抗坏血酸等)。由于存在需要水的降解途径(水解、脱酰胺、外消旋)，这些制剂不能完全稳定化。在本发明中，有益物质处于非水性生物相容的单相粘性载体中，该载体含有例如聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯酯、和/或聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物而表现出化学和物理稳定性。制剂的粘度取决于多个标准，包括有益物质的效力和浓度、和制剂的制备方法。对制剂粘度加以选择可使之在所需时间内运送所需量的有益物质。

本发明也可由均匀混悬有益物质的非水性单相生物相容的粘性载体和含有至少一种可在所述粘性载体中均匀混悬的有益物质的制剂组成。本发明也可由含有至少一种可在非水性单相生物相容粘性载体中均匀混悬的有益物质的制剂组成，所述制剂在体温下持久稳定，并可低速率均匀运送所述有益物质。本发明在于：稳定的非水性粘性载体在包括浓度、高温和制剂保持稳定时间等广泛的制剂条件下提高了有益物质的稳定性，这样就可能使用植入装置长期给予有益物质，而这是其它制剂不能达到的。定义

在此使用的术语具有以下含义：

术语“化学稳定性”指经化学降解途径如氧化、脱酰胺、水解产生了可接受百分数的降解产物。具体而言，如果制剂在37℃下2个月后的降解产物不超过35％，就可认为是化学稳定的。

术语“物理稳定性”指产生了可接受百分数的有益物质聚集(如二聚体、三聚体或更多聚体)。对于制剂(粘性载体和有益物质)来说，该术语指制剂有适宜的稳定性、流动性和均匀分散有益物质能力。具体而言，如果制剂在37℃下2个月后的聚体物不超过15％，就可认为是物理稳定的。

术语“稳定的制剂”指在37℃(或高温的相当条件)下2个月后制剂中仍含有至少65％的化学和物理稳定的有益物质。特别优选制剂在这些条件下仍含有至少80％的化学和物理稳定的有益物质。特别优选的制剂在辐射灭菌(如γ、β或电子束)后没有降解。

术语“有益物质”指肽、蛋白质、核酸、激素、病毒或抗体等，包括氨基酸或核酸残基的聚合物。这些有益物质在水中一般是可降解的，但是其干粉在高温下通常稳定。该术语也包括合成、天然衍生或重组的组分。该术语还包括脂蛋白及其转译后(Posttranslationally)的修饰形式如糖化蛋白质。同样地，该术语也包括其衍生物、激动剂、拮抗剂和可药用盐。该术语也包括蛋白质和/或具有D-氨基酸、在D-或L-构型和/或其结构的胨样单元中有修饰的、衍生的或非天然形成的氨基酸的蛋白质物质。本发明将采用术语蛋白质。该术语也指固态如粉状或结晶的有益物质。

术语“赋形剂”指作为稀释剂或载体或提供赋形或稠度而加入制剂中的惰性物质。赋形剂并非用于溶解药物的溶剂如乙醇(ETOH)。赋形剂包括：非离子表面活性剂如在制剂用于药物增溶的聚山梨酸酯；用于防止或抑制微生物生长的防腐剂如苯甲醇或甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；螯合剂；调味剂；和其它可药用的制剂辅剂。

术语“粘性载体”指粘度约为1,000-10,000,000泊的载体。包括牛顿流体和非牛顿流体。优选粘度约为10,000-250,000泊的载体。本发明制剂可将混悬于粘性载体中的有益物质均匀地从植入给药装置中排出。制剂在所述装置出口的剪切速率约为1-1×10^-7倒易秒，优选出口剪切速率约为1×10^-2×10^-5倒易秒。

术语“单相”指经差示扫描量热法(DSC)测得物理和化学均匀的固体、半固体或液体系统。DSC扫描仅出现单峰表示系统为单相。

术语“生物相容的”指粘性载体经过长期对病人体内生物环境的反应而分解或碎裂性质或特性。这可经一种或多种物理或化学降解过程来完成，例如通过酶解作用、氧化或还原、水解(蛋白水解)、置换如离子交换、或通过增溶、乳化或形成胶束而溶解，然后这些物质被身体和周围组织吸收、或消散。

术语“聚合物”包括聚酯如PLA(聚乳酸)[其比浓对数粘度为0.5-2.0i.v.]和PLGA(聚乳酸聚乙醇酸)[其比浓对数粘度为(0.5-2.0i.v.]、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮(其分子量为2,000-1,000,000)、不饱和醇的酯或醚如醋酸乙烯酯、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(37℃下具有高粘度)如Pluronic 105。通常优选的聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。

术语“溶剂”包括羧酸酯如月桂基乳酸酯、多元醇如甘油、多元醇聚合物如聚乙二醇(其分子量为200-600)、脂肪酸如油酸和辛酸、油类如蓖麻油、碳酸丙烯酯、月桂醇、或多元醇酯如甘油三乙酸酯。通常优选月桂基乳酸酯。

术语“表面活性剂”包括多元醇酯如甘油一月桂酸酯、乙氧基化蓖麻油、聚山梨酸酯、饱和醇的酯或醚如肉豆蔻基乳酸酯(Ceraphyl 50)、和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物如Pluronic。通常优选甘油一月桂酸酯和聚山梨酸酯。

术语“抗氧剂”指可用于防止有益物质降解如氧化的可药用辅剂。抗氧基包括但不限于生育酚(维生素E)、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、叔丁对甲氧酚、二叔丁基对甲酚和丙基没食子酸酯。优选的抗氧剂在于其溶解度和其防止优选载体中有益物质降解或化学变化的效力。一般优选棕榈酸抗坏血酸酯。制备制剂

本发明涉及可在体温下持久地低流速混悬和均匀分散有益物质的稳定的非水性单相生物相容粘性载体。本发明还涉及所含有益物质均匀地混悬于单相生物相容粘性载体中的制剂，所述载体在体温下可持久稳定。

本发明制剂所采用的有益物质包括具有生物活性或可用于治疗疾病或其它病理学状态的蛋白质或肽。其中包括但不限于：促肾上腺皮质激素、血管紧张素I和II、心钠素肽、铃蟾肽、缓激肽、降钙素、小脑肽、强啡肽N、α和β内啡肽、内皮素、脑啡肽、表皮生成因子、fertirelin、卵泡促性腺素释放肽、galanin、胰高血糖素、GLP-1、促黄体生成素释放素、促性腺素、促性腺激素释放激素、促生长素释放肽、组胺瑞林、人生长激素、胰岛素、干扰素、亮丙瑞林、LHRH、胃动素、那法瑞林、神经紧张素、催产素、松弛素、生长抑素、物质P、肿瘤坏死因子、曲普瑞林、加压素、生长激素、神经生长因子、血液凝集因子、核糖酶和反义寡聚核酸。及上述物质的类似物、衍生物、拮抗剂激动剂和可药用盐。

本发明制剂和方法所采用的有益物质可以是其盐、优选可药用盐形式。适用的盐为本领域技术人员已知，包括无机酸、有机酸、无机碱或有机碱的盐。

本发明优选有益物质在非水性溶剂中不易溶。这样，本领域技术人员基于其溶解度可很容易地确定有益物质。根据化合物的效力、治疗的疾病、化合物的溶解度、预定的给药剂量和维持期，可对有益物质的用量加以调整。(例如可参见Gilman等的The PharmacologicalBasis of Therapeuticus，第7版.(1990年)和Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版.(1990年)，上述公开内容在此引入作为参考)。

令人惊奇地发现：采用稳定的非水性单相生物相容粘性载体可提高有益物质的稳定性。例如，如图1和2所示，聚乙烯吡咯烷酮/PEG；Pluronic；和甘油一月桂酸酯/月桂乳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮制剂中人生长激素(hGH)可在37℃下稳定12个月以上。图1和图2分别为用反相HPLC和粒度排阻色谱测定的稳定性结果。

通常，将干燥(低湿度)的组分置于干燥箱或干燥条件下并于高温优选约40-70℃混合，使其液化而制得稳定的非水性单相生物相容粘性载体。然后将液态载体冷却至室温。经差示扫描量热法(DSC)证实载体为单相。粘性载体的最终湿度低于2％。

通常，在干燥条件下将载体和有益物质真空高温优选约40-70℃混合，使有益物质均匀地分散在所述载体中而制得本发明的稳定制剂。然后制剂冷却至室温。

在制备制剂之前先干燥有益物质被证明有利于提高制剂的稳定性。

同时也发现，加入抗氧剂如生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、叔丁对甲氧酚、二叔丁基对甲酚和丙基没食子酸酯，可减少制剂在灭菌中产生的降解产物(如不稳定的化学中间体)。方法学

在干燥条件下，将粘性载体组分高温混合使其液化并形成单相，可制得含粘性载体的稳定的非水性有益物质制剂。单相粘性载体形成后将其冷却至室温。真空高温下混合将有益物质加入使其均匀地分散在所述粘性载体中。

对有益物质如hGH制剂进行加速老化试验来考察其稳定性。结果表明这些制剂可持久保持稳定。

将有益物质如人生长激素和溶菌酶混悬于本发明各种非水性单相粘性载体中，然后将置于高温下进行加速老化试验来考察这些制剂的稳定性。测量制剂的稳定性。研究结果证实这些制剂在37℃下可至少稳定贮存约一年。

同时还考察了这些有益物质制剂经2.5兆拉德γ-辐射后的稳定性。结果表明经上述辐射后仍能保持化学和物理稳定性。方法

以下方法可用于实施下述实施例。

1.制备蛋白质粉末

人生长激素(可购自BresaGen公司，Adelaide，澳大利亚)

于去离子水中重建活性剂。含活性剂的溶液用Amicon Diaoflo^超滤膜(截留(cut-off)分子量为1000)进行缓冲交换。

超滤的活性剂溶液用YAMATO小型喷雾干燥器喷雾干燥。用收集器的离心式捕获器收集粉末。对喷雾干燥粉末的处置均在经氮气排空的干燥箱中进行。用粒度排阻和反相色谱分析所得粉末的粒径和分布、湿度、蛋白质含量和稳定性。

已知加入糖类(如蔗糖或甘露醇)或多元醇(如乙二醇、甘油、葡萄糖和右旋糖酐)可稳定某些蛋白质的构象。

2.制备粘性载体

高温下将组分混合使其液化并形成单相可制得稳定的单相生物相容粘性载体。经DSC扫描仅出现单峰表示为单相。于真空下混合完全以除去粉末中的气泡。混合器为转速40转/分种的双螺旋叶片混合器(D.I.T)。可采用更高转速但并不需要。

如果要制备含三组分的粘性载体，则先将溶剂加入混合器的加热筒中，再加入表面活性剂，最后加入聚合物，混合组分直至获得溶液(即单相)。混合时使用真空以除去气泡。高温下分散溶液，然后冷却至室温。冷却后载体的粘度增加。含二或单组分的凝胶可按同样方法制备。

3.制备有益物质制剂

为了制备制剂，将单相粘性载体加热后与一定量的有益物质真空下混合。用双螺旋叶片混合器(或其它类似混合器)按制备载体的方法混合有益物质的粘性载体。40-120转/分钟混合约15分钟或直至获得均匀的分散体。从混合器中取出所得混合物，密封于干燥容器中并冷却至室温。

4.制备贮库

将适宜的hGH制剂装入植入给药系统的贮库(如专利申请US08/595761中所披露的，在此引入作为参考)中。用聚合物塞将钛贮库的两端堵住。将含药贮库密封于polyfoil袋中并置于稳定性试验烘箱中。

这些装置贮库中的制剂完全与外界隔离。

5.反相高效液相(RP-HPLC)

用反相色谱(RP-HPLC)分析hGH稳定性试样的蛋白质含量和化学稳定性。分析时采用配有冷却自动进样器(4℃)的Hewlett PackardHP-1090系统。色谱条件如下表所示。

               表1

         反相HPLC色谱条件种类            参数柱子            J.T.Baker-C18，4.6×250mm流速            1.0mL/min检测            214nm流动相          A：含0.1％三氟乙酸的水

            B：含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度            时间  ％A   ％B

             0    65    35

             5    50    50

             45   35    65

             50   30    70

             55   65    35

制备hGH的参比标准溶液，测定其280nm吸收值计算其中的蛋白质含量。在每一进样的开始和结尾时，分别重复进样该溶液的三个稀释液，即代表试样中hGH预定浓度的80％、100％和120％，用来计算试样中蛋白质总含量。

6.粒度排阻色谱(SEC)

用粒度排阻色谱分析hGH稳定性试样的蛋白质含量和高分子量的降解产物。分析是采用配有冷却自动进样器(4℃)的Hewlett PackardHP-1090系统。色谱条件如下表所示。

                 表2

          粒度排阻色谱色谱条件种类                 参数柱                   TSK-2000SWXL流速                 0.5ml/min检测                 214nm流动相               25mM磷酸钠，100mM

                 氯化钠，pH7.0

制备hGH的参比标准溶液，测定其280nm吸收值计算其中的蛋白质含量。在每一进样的开始和结尾时，分别重复进样该溶液的三个稀释液，即代表试样中hGH预定浓度的80％、100％和120％，并计算试样中蛋白质总含量。用面积归一法计算高分子量降解产物的含量。

下列实施例用于说明本发明，但不以任何方式对本发明的范畴加以限定。

                   实施例1

            制备非水性单相粘性载体

下面将制备非水性单相粘性载体并示于下表中。A.于65℃下，将甘油一月硅酸酯(Danisco Ingredients，NewCentury，堪萨斯州)(25g)溶于月桂基乳酸酯(ISP Van Dyk公司.，Belleville，新泽西州)(35g)中。加入聚乙烯吡咯烷酮C30(BASF，Mount Olive，新泽西州)(40g)，混合物用转速40转/分种的双螺旋叶片混合器(D.I.T)混合直至获得单相。在混合室中使用真空以除去气泡。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。B.于65℃下，将甘油一月硅酸酯(Danisco Ingredients，NewCentury，堪萨斯州)(25g)溶于月桂基乳酸酯(ISP Van Dyk公司.，Belleville，新泽西州)(35g)中。加入聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(40g)，混合物用转速40转/分种的双螺旋叶片混合器(D.I.T)混合直至获得单相。在混合室中使用真空以除去气泡。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。C.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C30(BASF，Mount Olive，新泽西州)(50g)溶于聚乙二醇400(Union Carbide)(50g)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。D.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(50g)溶于聚乙二醇400(Union Carbide)(50g)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。E.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(50g)溶于蓖麻油(Spectrum，Gardena，CA)(50g)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。F.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(50g)溶于辛酸(Spectrum，Gardena，CA)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。G.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(50g)溶于油酸(Spectrum，Gardena，CA)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。H.于约65℃下，将聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(35％)溶于甘油(Bker，新泽西州)(65％)中，直至获得单相溶液。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。I.于约65℃下，将Cremophor EL(乙氧基化蓖麻油)(BASF，MountOlive，新泽西州)(5％)溶于蓖麻油(Spectrum，Gardena，CA)(70％)中，加入聚乙烯吡咯烷酮C17(BASF，Mount Olive，新泽西州)(25％)并溶解，混合物用约40转/分钟转速混合直至获得单相载体。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。J.Pluronic 105(BASF，Mount Olive，新泽西州)随着混合加热至约65℃直至融化。从混合器中取出单相载体，并冷却至室温。

           表3

         组分比率

      组分                             低剪切率时的聚合物    表面活性剂    溶剂     比率         粘度(泊)PVP       GML            LL      53∶5∶42     25,000PVP       GML            LL      55∶10∶35    50,000PVP       GML            LL      50∶15∶35    7,000PVP       -----          LA      60∶40PVP       Ceraphyl50     LA      60∶10∶30PVP       -----          油酸    50∶50        30,000PVP       -----          辛酸    55∶45        7,000PVP       吐温80         -----   50∶50PVP       -----          PEG400  50∶50PVP       蓖麻油         -----   50∶50-----     Pluronic105    -----   100           1,000,000PVP       -----          甘油    50∶50        5,000其中：

GML＝甘油-月桂酸酯

LL＝月桂基乳酸酯

PVP＝聚乙烯吡咯烷酮C30

LA＝月桂醇

PEG＝聚乙二醇400

                    实施例2

                    制备hGH

A.喷雾干燥法制备

冻干的hGH(BressaGen公司，Adelaide，澳大利亚)用150ml去离子水重建。该储备液含1050mg hGH。用Amicon Diaoflo^超滤膜(截留分子量为1000)进行缓冲交换。超滤池(cell)与含有5mM磷酸盐缓冲液(pH7)的辅助贮库连接。超滤池的流体体积及hGH的浓度随着磷酸盐缓冲液置换赋形剂而保持恒定。

超滤的蛋白质溶液(其中蛋白质的浓度约2％)用YAMATO小型喷雾干燥器喷雾干燥。喷雾干燥器的设置如下：抽吸(aspiration)压力通常定为1.3kgf/cm²，进口温度为120℃，喷液速率为2.5(约3ml/分钟)。用收集器的离心式捕获器收集粉末。对喷雾干燥粉末的处置均在氮气排空的干燥箱(相对湿度：1-4％)中进行。混悬载体的水分含量如下表所示。

                   表4

             混悬载体的水含量

          0时载体中    37℃，12周时

          水含量       载体中水含量载体          ％w/w        ％w/wPluronic105   0.25         0.4GML/LL/PVP    1.5          1.3PVP/PEG       2.0          2.0其中：  GML＝甘油-月桂酸酯  LL＝月桂基乳酸酯  PVP＝聚乙烯吡咯烷酮C30  PEG＝聚乙二醇400  实施例3制备hGH制剂

称取部分单相粘性载体(9g)并加热到60℃。将hGH(BressaGen公司，Adelaide，澳大利亚)(1g)加入载体中并混合15分钟。于真空下混合完全以除去粉末中的气泡。

称取约10mg喷雾干燥的hGH粉末(基于测定的水和盐含量重新计算粉末中hGH的含量)，与100μl载体(每种载体取3个试样)55-65℃下混合。仔细将粉末混合于混悬载体中，以获得在载体中有最大化的颗粒均分散体。所有步骤均在干燥箱中进行。

用10ml release rate缓冲液溶解所得混悬液，并用粒度排阻和反相色谱分析。以喷雾干燥的hGH粉末为对照品。

                      表5

             粒度排阻色谱法测得的hGH

              混悬液在37℃的稳定性时间  喷雾干燥    PVP/PEG400    GML/LL/PVP     Pluronic105 周   粉末-80℃    混悬液         混悬液          混悬液

   ％LS        ％LS           ％LS            ％LS 0    96±1        88±6          92±2           87±7 1    99±8        81±2          94±3           93±3 2    99±3        83±1          97±1           94±1 3    97±1        84±2          95±2           95±3 4    95±2        82±8          94±4           93±5 7    95±4        76±3          93±4           88±212    97±4        79±3          97±1           95±6

每一数据点均为取自3个独立小瓶的3个独立试样的平均值±相对标准偏差。

                       表6

             反相HPLC测得的hGH混悬液在

                   37℃时的稳定性时间    喷雾干燥     PVP/PEG 400    GML/LL/PVP   Pluronic105 周     粉末-80℃       混悬液         混悬液       混悬液

      ％LS           ％LS           ％LS         ％LS 0       104±1          99±3          99±2        89±7 1       104±8          78±2          98±3        96±6 2       104±4          73±3          95±1        96±1 3       104±2          78±4          97±3        97±4 4       100±2          74±10         93±4        96±4 7       108±5          72±4          96±2        94±2 9       102±3          66±3          92±3        93±212       101±2          66±1          89±2        92±5每个数据点均为取自3个独立小瓶的3个独立试样的平均值±相对标准偏差。

                    实施例4

                    制备贮库

                   释放速率图

植入给药装置的钛贮库系统(如专利申请US08/595761中所披露的，在此引入作为参考)均配备有渗透装置(engine)、活塞和控释膜。将适宜量的粘性载体制剂装入贮库中，并用流动塞堵住。将该系统置于37℃水浴中，使其持久释放制剂。释放的物质每周取样两次。用反相高效液相分析释放物质。将每种系统的有益物质浓度折算成每日释放量。如图3-8所示，有益物质从植入给药装置中的释放为零级释放。

                    实施例5

        非水性粘性载体制剂中hGH的稳定性

如上所述制备载体中含10％w/w hGH的制剂，并密封于小瓶中。将制剂置于控温烘箱中进行高温加速老化试验，试验条件见下表。

                          表7

                 粒度排阻色谱  反相HPLC  载体          时间(小时)    温度      测得的％LS     测得的％LS  Pluronic105      0          50℃         98±3         101±3  Pluronic105      1          50℃         98±3         101±4  Pluronic105      2          50℃         100±1        102±3  Pluronic105      4          50℃         101±3        105±3  GML/LL/PVP       0          65℃         99±3         101±3  GML/LL/PVP       1          65℃         93±6         97±6  GML/LL/PVP       2          65℃         91±5         95±5  GML/LL/PVP       4          65℃         95±3         98±3

每一数据点均为取自3个独立小瓶的3个独立试样的平均值±相对标准偏差。

如下表所示，结果证明这些制剂在各种条件下均可保持hGH的稳定性。在每种条件下，hGH的含量至少保持为70％。

                    表8

        hGH从非水性混悬液中的回收率

载体    反相HPLC测得的％LS  粒度排阻HPLC测得的％LSPVP/PEG 400      99±3％               88±6％GML/LL/PVP       99±2％               92±2％Pluronic105      89±7％               87±7％

每一数据点均为取自3个独立小瓶的3个独立试样的平均值±相对标准偏差。

％LS％或称％标示浓度＝(测得的蛋白质浓度+理论的蛋白质浓度)×100％

本领域技术人员在本发明的教导下，很容易对上述许多实施方案的实施方式加以修改。上述实施例仅用于说明本发明，并不对下面权利要求所定义的本发明的范畴构成任何限制。