以线粒体DNA损伤作为冠状动脉粥样硬化性心脏病的预报

摘要

本发明证明,线粒体DNA损伤的发生先于动脉粥样硬化损伤的发展,或与之同步;主动脉线粒体DNA损伤随年龄增加;而且,基因型和饮食都会影响线粒体DNA损伤程度。因此,本发明证明,线粒体DNA损伤发生于动脉粥样硬化的早期,可能是动脉粥样硬化形成的引发因素,并基于此提供了一种根据线粒体DNA损伤量来预报冠状动脉粥样硬化性心脏病的方法。

说明书

                    发明背景

政府资助说明

本发明得到了National Institute of Health第HL59652号基金资助。所以，联邦政府对本发明享有当然的权利。

发明领域

本发明主要涉及生理学和分子生物学。更具体地说，本发明涉及DNA损伤及其对于动脉粥样硬化的影响。

相关技术

据信，反应性氧物质在动脉粥样硬化损伤的发病机理中起着重要作用(1-6)，但对于其内在机制尚不清楚。例如，反应性氧物质介导的机制可能是LDL氧化(ox-LDL)的一个重要因素，是动脉粥样硬化形成的一个关键情节(3，7，8)。研究表明，超氧化物(O₂^-)和过氧亚硝酸盐(由O₂^-与一氧化氮形成)能够氧化LDL(9-11)。因此，据信，与一氧化氮和/或O₂^-相关的反应在动脉粥样硬化损伤和血管功能损伤(即内皮细胞机能失调)的发病机理中起着重要作用，但对它们的氧化产物(H₂O₂，过氧亚硝酸盐)的作用尚不完全清楚。

线粒体是细胞内反应性氧物质(O₂^-)的主要来源之一，这些反应性氧物质形成于电子转运过程中(12-16)。这些反应性氧物质会优先损伤线粒体膜和蛋白质(17-19)，影响重要的细胞功能，包括线粒体的呼吸，这一功能的改变会导致反应性氧物质产生增加(20-22)，引起脂类过氧化(23，24)和DNA损伤(25，26)。由于线粒体的氧化磷酸化能力因线粒体DNA(mtDNA)损伤而降低，突变随年龄累积(6，27-29)，所以，线粒体损伤和反应性氧物质的产生可能成为衰老相关性退行性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)的催化剂。据假设，内皮细胞和平滑肌细胞内产生的自由基引起这些细胞内的线粒体损伤，形成一个反应性氧物质进一步产生和线粒体损伤的恶性循环，导致血管细胞机能失调。

在西方，冠状动脉粥样硬化心脏病是导致死亡的主要原因。虽然对于导致冠状动脉粥样硬化心脏病原因的确切顺序存在着相当的争论，但越来越多的证据表明，动脉粥样硬化损伤是由反应性氧物质介导的因素引起的。巨噬细胞通过“清除者”受体识别并内化ox-LDL形成泡沫细胞。这些泡沫细胞的积累关系到血管生理的长期变化，包括平滑肌细胞迁移和增殖，细胞外基质蛋白的合成和进一步的内皮细胞机能失调，这些都是动脉粥样硬化损伤的主要构成因素。同样，冠状动脉粥样硬化心脏病的许多危发因素都与反应性氧物质产生的增加相关(即，吸烟和高血胆固醇)。在动脉内，反应性氧物质可由代谢过程(线粒体的氧化磷酸化)产生，细胞因子或生长因子活化，巨噬细胞或嗜中性白细胞刺激(炎性反应)，和一氧化氮与超氧化物产生过氧亚硝酸盐的反应，这些都继而产生单态氧和羟基自由基。因此，虽然有许多过程对于动脉粥样硬化很重要，但反应性氧物质介导的机制及其作用属于最重要的。

大量研究显示，线粒体很容易受反应性氧物质的作用。线粒体DNA与内膜基质侧的结合使得它易受膜干扰的影响，并使它成为膜内产生的亲电体的潜在目标。除了它与内膜和OXPHOS的密切结合之外，造成线粒体DNA易于损伤的其他因素是缺乏保护性组蛋白和非组蛋白，及其有限的DNA修复能力。此前的研究表明，线粒体易受反应性氧物质介导的损伤，表现为广泛的脂类过氧化和线粒体DNA损伤。具体地说，已有报道，以反应性氧物质处理内皮细胞优先造成线粒体DNA损伤，降低线粒体DNA转录，以及线粒体XOPHOS机能失调。

现有技术缺乏测定造成动脉粥样硬化的氧化应力的方法。本发明满足了本领域内长期以来的这一需求。

                    发明概述

本发明证明，在体外，反应性氧物质介导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)内的线粒体损伤和机能失调。本发明测定了以H₂O₂、过氧亚硝酸盐和O₂^-处理的细胞内的DNA损伤，基因表达和线粒体蛋白质合成。两种细胞内的线粒体DNA都比核DNA更容易受微量反应性氧物质的影响，并与线粒体所编码多肽的OXPHOS转录(ND2和细胞色素b)减少(40-60％)相关。氧化亚硝酸盐处理抑制线粒体蛋白质的合成，反应性氧物质处理的细胞其ATP水平和线粒体呼吸(复合物II)也显著降低，这与反应性氧物质损害线粒体功能的观点一致。本发明揭示了，在体外，氧化性线粒体DNA损伤，基因表达改变和线粒体机能失调之间的关联，由此证明，氧化性细胞损伤和线粒体损伤在血管机能失调和动脉粥样硬化中起着重要作用。

因为线粒体更容易发生反应性氧物质介导的损伤，而且，氧化应力的升高被认为在动脉粥样硬化的早期起着重要作用，本发明证明，在最终发生动脉粥样硬化的主动脉组织内的线粒体DNA损伤增加。为此，将动脉粥样硬化研究用的高血胆固醇小鼠模型(无载脂蛋白E的小鼠)主动脉组织内恒定的线粒体DNA损伤水平与健康的同龄对照小鼠相比较。DNA损伤评估发现，apoE小鼠主动脉组织的线粒体DNA损伤在形成病理学上可测的损伤之前和之后都显著增加(与健康对照相比)。此外，所有小鼠的线粒体DNA损伤都随年龄增加，但只有apoE小鼠具有与年龄相关的损伤水平的显著增加(p＜0.05)。相反，只在10周龄的c57B1小鼠内，饮食才与线粒体DNA损伤相关，表现为西式饮食与损伤增加相关。最后还发现，食物蛋白质的减少与apoE和对照小鼠主动脉内线粒体DNA损伤减少都显著相关(p＜0.05)。没有发现明显的与β球蛋白基因座(核DNA损伤的标记)相关的损伤模式。对各动物组的组织化学分析显示，只在饲以中式饮食(4％脂肪)和西式饮食(21％脂肪)的衰老apoE小鼠中存在动脉粥样硬化损伤。如同预计的，与同龄c56B1对照相比，apoE小鼠的脂类过氧化物和胆固醇水平显著升高(＜0.05)。然而，与饲以中式饮食的相比，饲以脂肪含量更高的西式饮食的apoE小鼠的脂类过氧化物水平并没有显著升高。所以，以上信息提示：1)在动脉粥样硬化小鼠活体模型中，线粒体DNA损伤先于或与动脉粥样硬化损伤形成同时发生；2)在体内，主动脉线粒体DNA损伤随年龄增加；3)与饮食相比，apoE基因型对于线粒体DNA损伤水平影响更大；以及4)饮食对于线粒体DNA损伤的影响在年幼的c57B1小鼠中似乎最显著。因此，线粒体发生于动脉粥样硬化的早期，可能是动脉粥样硬化形成的引发事件。

本发明目的之一是提供预报冠状动脉粥样硬化性心脏病以及其他氧化应力所致疾病的方法，该方法以线粒体DNA损伤程度为基础，或以相关的线粒体DNA损伤引起的线粒体机能失调有关测定(线粒体蛋白质合成改变，线粒体氧化磷酸化改变或线粒体ATP产生改变等)为基础。

本发明实施例之一中，提供了预报危发个体动脉粥样硬化的方法，其步骤包括：(a)采集个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织中的线粒体DNA损伤量(mtDNA)；和(c)将所述危发个体有意义组织内的线粒体DNA损伤量与无动脉粥样硬化对照个体的有意义组织内的线粒体DNA损伤量比较，危发个体线粒体DNA损伤量高于所述对照个体表明该个体患有动脉粥样硬化危发性。

本发明另一实施例中，提供了一种测定个体内氧化应力的方法，包括：(a)采集所述个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织内的线粒体DNA损伤(mtDNA)；(c)测定所述有意义组织内一核基因中的DNA损伤；和(d)比较线粒体DNA和核基因DNA之间单位长度上的DNA损伤量，线粒体DNA单位长度上的DNA损伤量高于核DNA表明所述个体内氧化应力升高。

本发明的再一实施例中，提供的方法测定降低个体发生冠状动脉疾病危险性的处理方法的效果，其步骤包括：(a)采集处理前所述个体的外周血白细胞；(b)采集个体经处理后的有意义组织；和(c)测定处理前和处理后所采集有意义组织内的线粒体DNA损伤(mtDNA)，处理后线粒体DNA损伤减少表明该处理可降低发生冠状动脉疾病的危险性。

通过以下描述和优选实施例，本发明的其他内容，特征和优点将展现得更为清楚。这些实施例仅用来说明。

                 附图简述

参照本发明的实施例及其附图可达到或更具体地理解以上概述的发明特征和优点，并发现其他内容。这些附图属于说明书的一部分。需要指出的是，附图仅说明本发明的优选实施方式，而不限定本发明的范围。

图1A显示HUVEC细胞内与过氧化氢处理相关的DNA损伤。细胞用0.2mM的H2O2处理60分钟，收获，进行QPCR。对照仅用无血清培养基培养。产物减少表明模板损伤增加。

图1B显示对以H₂O₂处理的HASMC和HUVEC细胞的时间过程分析。细胞用0.2mM的H₂O₂处理0-60分钟，抽提基因组DNA，通过与未处理对照(0级)的比较，估算每10kb的损伤量。每次实验每个样品至少进行2次PCR。星号(^*)表示，与未处理的对照相比，损伤显著增加(p＜0.05)。标记代表平均值(±SEM)。

图2A显示HUVEC和HASMC细胞内与过氧亚硝酸盐处理相关的DNA损伤。细胞用所示剂量的过氧亚硝酸盐处理60分钟，收获，进行QPCR。对照仅用无血清培养基培养。产物减少表明模板损伤增加。图2B显示用1mM SIN-1处理HUVEC和HASMC。SIN-1产生等摩尔量的一氧化氮和O₂^-。SOD/SIN-1样品先用3单位/ml SOD处理，然后用SIN-1处理。产物减少表明模板损伤增加。

图3显示过氧亚硝酸盐处理的细胞内的线粒体DNA转录水平。柱形图表示16S，rRNA，ND2和Cytb经60分钟处理(0.1mM和0.5mM，无血清培养基)后与未处理对照(无血清培养基)相比的相对转录水平。转录水平通过Northern分析法并与适当的放射性标记探针杂交来测定。星号(^*)表示转录水平与未处理的对照显著不同(p＜0.05)。

图4显示线粒体合成的蛋白质内³⁵S-甲硫氨酸的掺入。图4A显示HASMC(左图)内过氧亚硝酸盐处理后的蛋白质标记。细胞用0.1和0.5mM过氧亚硝酸盐处理60分钟，然后用³⁵S-甲硫氨酸标记约2小时，然后进行SDS-PAGE电泳。右图是用考马斯亮蓝染色的同一凝胶。图4B汇总了反应性氧物质处理的HUVEC和HASMC内与对照相比的³⁵S-甲硫氨酸掺入百分比(对照以无血清培养基模拟处理)。缩写：ND-数据无。

图5是表现线粒体呼吸(通过MTT还原分析)和总细胞ATP的柱形图。HUVEC和HASMC与相应浓度的过氧亚硝酸盐37℃接触1小时。图5A柱形图显示MTT还原水平。接触后，用PBS洗涤细胞，用含2.0μg/ml MTT的条件培养基培养1小时。然后，去除培养基，裂解细胞，在570nm测定吸光度。将与未处理对照内测得还原相比的分数记录为MTT还原率(培养基±SEM)。图5B显示过氧亚硝酸盐处理的HUVEC和HASMC内的总ATP测定值。处理后，细胞用ATP释放剂(Labsystems)处理，荧光法测定ATP水平(Molecular Probe)。表示为相比未处理细胞的百分比(100％)。

图6显示与年龄相当小鼠相比，主动脉和心脏组织内线粒体DNA损伤显著增加的apoE小鼠。图6A显示QPCR评估的apoE小鼠和对照小鼠主动脉内的线粒体DNA损伤，并测定了与10周龄对照组相比的相对扩增。扩增产物少对应于线粒体DNA损伤增加。星号(^*)表示对照与apoE主动脉之间差异显著。图6B显示apoE和对照小鼠左心室内QPCR评估的线粒体DNA损伤，并测定了与10周龄对照组相比的相对扩增。扩增产物少对应于线粒体DNA损伤增加。星号(*)表示对照与apoE主动脉之间差异显著。

图7显示食物蛋白质摄入减少与对照和apoE小鼠内线粒体DNA损伤减少的关联。从第6周起，给对照和apoE小鼠饲以含16％或24％蛋白质的食物，持续4周，用QPCR评估线粒体DNA损伤。图7A表明，与24％蛋白质饲养的对照组相比，对照和apoE主动脉线粒体DNA的相对扩增。扩增产物少说明线粒体DNA损伤增加。星号表示饲以24％和16％蛋白质的小鼠之间存在显著区别。括弧内是Studentt测验的P值。图7B显示与饲以24％蛋白质的对照组相比，对照和apoE左心室线粒体DNA的相对扩增。扩增产物少说明线粒体DNA损伤增加。星号表示饲以24％和16％蛋白质的小鼠之间存在显著区别。括弧内是Studentt测验的P值。

图8显示，与对照相比，3周龄apoE小鼠内mtDNA损伤增加。16.0kb和0.08kb的产物分别代表长和短mtDNA QPCR产物。下方的表列出了3周龄对照(0级，A₀)和apeE-/-主动脉内的相对损伤频率(损伤量/10kb)。所示的是平均值和SEM。

图9显示，与对照相比，apoE内的脂类过氧化显著增强，但饲以西式饮食(21％脂肪)的对照小鼠内的脂类过氧化也显著增强。柱形图显示apoE小鼠和饲以中式饮食(4％脂肪)或西式饮食(21％脂肪)的对照小鼠的脂类过氧化水平。数值以相比中式饮食对照小鼠的相对值表示。虽然，apoE的脂类过氧化水平显著高于任一种饮食的对照小鼠，但在饲以中式饮食或西式饮食的apoE小鼠之间，该水平却没有显著差异。相反，饲以西式饮食的对照小鼠的脂类过氧化水平显著高于(以“*”表示)饲以中式饮食的对照小鼠。

图10A，10B和10C显示apoE-/-，SOD2-/+杂交小鼠的动脉粥样硬化损伤和mtDNA损伤增加。图10A中，将apoE-/-，SOD2-/+和同窝的apoE-/-小鼠的整个主动脉用油-红-O染色。左上图显示一只17周apoE-/-，SOD2-/+雄性小鼠(4％脂肪饮食)主动脉的油-红-O染色，右上图显示与之同窝的apoE-/-雄性小鼠(4％脂肪饮食)的结果。左下和右下图分别显示34周apoE-/-，SOD2-/+小鼠和同窝的apoE-/-雄性小鼠的主动脉染色结果。黑色箭头表示在apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-中存在着大的动脉粥样硬化损伤(同窝的17周apoE-/-中还没有)，红色箭头指示一个形成于动脉支内的一个较小损伤的例子，这在apoE-/-，SOD2-/+小鼠中更常见，更具有特征性。图10B柱形图显示利用油-红-O染色观察的apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-小鼠整个主动脉内的动脉粥样硬化频率(n＝4)。图10C显示apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-同窝小鼠之间的相对主动脉mtDNA损伤(n＝12)。在上述实验中，同窝的apoE-/-作为对照，将其损伤频率定为“0级”(A₀)。损伤频率以平均值和SEM表示。

图11显示，在具有心肌梗塞危发因素的患者中，线粒体DNA损伤的发生率升高。在心脏插管时采取血样，用QPCR测定线粒体DNA损伤。该图中，线粒体损伤值高于“正常”人群的平均值视为升高。该柱形图显示各类患者中线粒体DNA损伤增加的百分比。在高血压、吸烟、糖尿病和具有多种以上心肌梗塞危发因素的患者中，线粒体DNA损伤几率升高。

图12显示20英里“训练跑”之前和之后的线粒体DNA损伤。采取血样，获得白细胞层，用QPCR测定线粒体DNA损伤。虽然刚跑烷后存在线粒体DNA损伤，但很快恢复到对照值。

图13显示，超长马拉松者在进食高脂肪饮食后的线粒体DNA损伤显著少于对照。在所有例子中，都在刚进食前，进食后，和进食后4-6小时评估线粒体DNA损伤。对照的线粒体DNA损伤反映脂肪和胆固醇形式食物摄入ROS的即时影响。马拉松者中观察到的相对“保护作用”可能与这些个体的抗氧化防御机制增强有关。

图14显示，超长马拉松者在进食高脂肪食物后的蛋白质损伤显著少于对照。

图15A和15B显示人正常的和动脉粥样硬化主动脉的QPCR。图15A显示同龄“正常”和动脉粥样硬化主动脉的QPCR结果比较。16.2kb(上行)和0.22kb(下行)分别代表长和短人QPCR扩增产物。人mtDNA的QPCR评估方法是现有技术(参见Ballinger，1996，1999；Yakes，1997)。图15B显示人的健康和动脉粥样硬化主动脉的mtDNA损伤/10kb评估。动脉粥样硬化主动脉的平均损伤频率(±SEM)以比之正常组(定为0级，0.0±0.06损伤/10kb)的相对值表示。统计学分析(Studentt测验)显示，正常的和动脉粥样硬化主动脉之间存在显著差异。

            本发明的详细描述

已知，反应性氧物质在动脉粥样硬化的病理中起着重要作用，但对其潜在机制尚不清楚。在血管环境中，超氧化物(O₂^-)与一氧化氮反应，并以有限扩散速度形成过氧亚硝酸盐，或者被超氧化物歧化酶还原成过氧化氢(H₂O₂)。结果，不论H₂O₂还是过氧亚硝酸盐都是血管系统研究中的反应性氧物质。本发明证明，过氧化氢和过氧亚硝酸盐在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)内介导线粒体损伤和机能失调，因而参与动脉粥样硬化的引发。用H₂O₂和过氧亚硝酸盐处理细胞，评估DNA损伤，基因表达和蛋白质合成。与非转录活性的核基因β球蛋白基因簇相比，线粒体DNA(mtDNA)更易损伤，这种损伤与线粒体DNA编码的OXPHOS基因转录的剂量依赖性减少(40％-60％)相关。线粒体蛋白质合成受到0.1mM过氧亚硝酸盐处理的轻微抑制，经0.5mM过氧亚硝酸盐处理后则显著降低(55-70％)。反应性氧物质处理还引起细胞ATP水平和线粒体呼吸(复合物II，琥珀酸脱氢酶)降低，这与反应性氧物质引起线粒体机能失调的观点一致。以上结果表明了线粒体DNA损伤，基因表达和线粒体机能失调之间的关联，因此为研究血管细胞机能失调和动脉粥样硬化提供了一个范例。

还对10周龄和34周龄的动脉粥样硬化(apoE)和对照小鼠的主动脉组织进行了DNA损伤评估。ApoE小鼠没有载脂蛋白E，这是脂蛋白受体的一种高亲和力配体，对于摄取血液流中的LDL十分重要。因此，这些小鼠的血清胆固醇和甘油三酯水平显著升高，在20周前就开始形成动脉粥样硬化斑。为了测定各组主动脉的核DNA和线粒体DNA损伤水平，由近心端和远心端主动脉采集基因组DNA进行定量PCR(QPCR)。各组中apoE小鼠的线粒体DNA损伤的增加都高于c57B1对照小鼠主动脉，只有10周龄西式饮食组例外。虽然所有小鼠的线粒体DNA损伤都随年龄增加，只有apoE小鼠发生与年龄相关的线粒体DNA损伤水平显著增加(p＜0.050)。只有在10周龄的c57B1小鼠中，西式饮食才与线粒体DNA损伤增加相关(与中式饮食相比)。相反，核DNA(β-球蛋白)则没有显著不同。此外，apoE小鼠的脂类过氧化物和胆固醇水平显著高于同龄c57B1对照(p＜0.050)，对主动脉的组织化学分析显示在高龄中式和西式饮食apoE小鼠组中存在着动脉粥样硬化损伤。以上信息提示：1)在动脉粥样硬化小鼠活体模型中，线粒体DNA损伤与动脉粥样硬化相关；2)在体内，主动脉线粒体DNA损伤随年龄增加；3)与饮食相比，apoE基因型对于线粒体DNA损伤水平影响更大；以及4)饮食对于线粒体DNA损伤的影响在年幼的c57B1小鼠中最显著。因此，线粒体发生损伤可能是动脉粥样硬化形成的引发事件。

本发明旨在提供根据线粒体DNA损伤水平预报冠状动脉粥样硬化性心脏病的方法。更具体地说，本发明涉及评估个体动脉粥样硬化状态的方法，其步骤包括：(a)采集个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织中的线粒体DNA损伤量；和(c)将所述危发个体有意义组织内的线粒体DNA损伤量与无动脉粥样硬化对照个体的有意义组织内的线粒体DNA损伤量比较，危发个体线粒体DNA损伤量高于所述对照个体表明该个体患有动脉粥样硬化。线粒体DNA损伤可用本领域技术人员已知的各种方法测定，其中之一是定量PCR。该方法可用来鉴定和定量各个体的线粒体DNA损伤水平。较好的是，被测个体具有至少一种与动脉粥样硬化相关的危发因素。这些因素是本领域所熟知的，例如吸烟或嚼烟，高血压，糖尿病，肥胖，高血胆固醇和高血脂。

本发明还涉及一种测定个体内氧化应力的方法，包括：(a)采集所述个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织内的线粒体DNA损伤；(c)测定所述有意义组织内一核基因中的DNA损伤；和(d)比较线粒体DNA和核基因DNA之间单位长度上的DNA损伤量，线粒体DNA单位长度上的DNA损伤量高于核DNA表明所述个体内氧化应力升高。核基因选自β-球蛋白基因座，转录活性或非转录活性基因，这取决于是否需要测定被转录基因或一组核基因中存在核DNA损伤。可用定量PCR测定线粒体DNA损伤和所述核基因的DNA损伤。通常，氧化应力升高预示动脉粥样硬化，高血压，糖尿病，高血胆固醇，吸烟，衰老性退行性疾病和癌症。

本发明还涉及一种测定药物降低个体动脉粥样硬化危发性的效力的方法，包括：(a)在给药前和给药后采集所述个体的有意义组织；(b)测定所采集有意义组织内的线粒体DNA损伤量，处理后线粒体DNA损伤量下降表明该处理可降低动脉粥样硬化危发性。

本文中，“动脉粥样硬化形成”或“动脉粥样硬化”指引起硬化斑形成，外周、冠状或脑动脉狭窄和阻塞，造成局部缺血、心肌梗塞、中风继而导致发病和死亡的生物学过程。

“有意义的组织”指各种生血细胞或组织的样品。

“氧化应力”指反应性氧物质，例如H₂O₂，超氧化物，过氧亚硝酸盐以及它们和其他反应性氧物质的衍生物对于正常细胞技能的病理生理学作用。氧化应力的目标可以是蛋白质，脂类，RNA，DNA或其他各种细胞成分。

“抗氧化剂处理”指各种能与反应性氧物质反应从而抵消它们的病理生理学作用的有机物或无机物。

“低蛋白质饮食”一般指蛋白质含量低于16％的饮食，但可根据测试饮食所含蛋白质量进行调整。

“mtDNA损伤”一般指mtDNA的各种损伤(即，碱基改换，脱嘌呤核酸位点，断链，形成加成产物等)或mtDNA长度突变(缺失，插入或复制)，这些可通过QPCR直接测定(通过抑制聚合酶，或产生大小不同于预计的QPCR产物，即mtDNA长度突变)，或结合酶活性(即，先用FAPY糖基化酶处理DNA，然后用QPCR测定8-氧-G)。

本领域一般技术人员可以看出，测定线粒体DNA损伤只是测定氧化应力的方法之一。线粒体DNA损伤的“下游”或所致效应都将反映同一疾病过程。例如，测定线粒体蛋白质合成，线粒体氧化磷酸化改变或线粒体ATP产生改变都可实现相同的目的。

以下实施例描述了本发明的多种实施方式，并非对本发明的限定。

                  实施例1体外细胞和小鼠

将人脐静脉细胞(HUVEC)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)维持在37℃，5％CO2/95％空气，Dulbecco′s改进的Eagles培养基(HASMC；细胞Gro)或M199(HUVEC；细胞Gro)中，其中添加了胎牛血清(Gibco/BRL)，HEPES缓冲液(10mM)，谷氨酰胺，青霉素和链霉素。培养瓶每隔3-4天进行一次细胞剥离，并用胰蛋白酶-EDTA(Gibco/BRL)解脱细胞以用于实验。第5-7代细胞长至70-80％铺满时，用各种反应性氧物质处理(对照用无血清培养基处理)。

已证明，载脂蛋白E(apoE)敲除(-/-)的小鼠是发生动脉粥样硬化的可靠模型。ApoE(-/-)小鼠没有载脂蛋白E，这是脂蛋白受体的一种高亲和力配体，对于摄取血流中的LDL十分重要。因此，这些小鼠的血清胆固醇和甘油三酯水平显著升高，饲以“西式”高脂肪饮食时，在20周前就开始形成动脉粥样硬化斑。作为动脉粥样硬化小鼠模型，apoE(-/-)模型与人动脉粥样硬化最近似。

从Jackson实验室，Bar Harbor购买5周龄的c57对照小鼠和apoE小鼠(c57B1背景)，让它们对于UTMB动物研究所适应1周，然后饲以中式(4％脂肪：HarlanTeklad饮食7001)或西式(21％脂肪：Harlan Teklad饮食#88137)饮食，从6周龄时开始，持续4周(低龄，10周龄组)或28周(高龄，34周龄组)，然后采集组织。在蛋白质饮食实验中，6周龄的小鼠饲以16％(16％蛋白质，4％脂肪，NIH31#101034)或24％(24蛋白质，4％脂肪，Harlan Teklad饮食#7001)蛋白质饮食，持续4周(杀死时是10周龄)。各组有4只apoE小鼠和4只c57Bl对照小鼠。在腹膜内注射ketaset/赛拉嗪(1mg/20g)后采集组织。各组取一段主动脉用于组织化学分析，其余的近心端和远心端主动脉、心脏、肝、肺和脑样品摘取后立即冷冻在液氮中，使用前保存于-80℃。采集血浆样品，用于测定总胆固醇(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和脂类过氧化水平(Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA)。

                         实施例2反应性氧物质处理

用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释浓H₂O₂储备液(30％，Fisher)，根据230nm吸光度测定浓度(30)。从亚硝酸钠和酸化的H₂O₂合成过氧亚硝酸盐，并定量(31)。分别用黄嘌呤氧化酶/2，4-二氧四氢蝶啶和精胺NONO酸酯作为低剂量O₂^-和一氧化氮供体。用SIN-1(盐酸3-morpholinosydnonimine，Molecular Probes)产生较高等摩尔水平的一氧化氮和O₂^-。60mm培养板内的单层培养物(70-80％铺满)与特定浓度的反应性氧物质接触，进行剂量反应，并在无血清，无酚红基础必需培养基(MEM)内37℃进行进行时间实验。对照单层培养物则仅用无血清和无酚红MEM作模拟处理。处理后，细胞用PBS洗涤一次，立即收获。

                        实施例3定量PCR(QPCR)试验

QPCR测定有意义基因组节段内两模板链的每链平均DNA损伤程度。QPCR测定DNA损伤的依据是：1)前提是，各种含损伤的DNA模板都会直接终止热稳定性聚合酶链反应，或在QPCR(即，先用FAPY糖基化酶处理样品，从而可用QPCR检测8-氧-G损伤)前经酶的作用而终止；2)长度突变(缺失和插入)会改变预计QPCR产物的大小，造成预计QPCR产物得率下降(即，mtDNA缺失使得QPCR产物小于预计)。所以，DAN损伤(即断链，碱基改换，DNA加成，和脱嘌呤位点)和长度突变(即mtDNA缺失)会阻滞聚合酶链反应的进行(即损伤)，或得到大小被改变的PCR产物(即mtDNA缺失)，造成靶序列(预计大小)扩增减少。所以，只有不发生DNA长度突变和/或可测的DNA损伤的DNA模板才可能产生预计的扩增产物。通过用线粒体DNA模板扩增一段16.2kb的产物来评估线粒体基因组内的损伤，通过扩增β-球蛋白基因簇的一段17.7kb产物来评估核基因组内的损伤。DNA损伤增加与扩增产物减少相互关联。因为不同次的QPCR扩增会因模板拷贝数不同或因与体内或体外介导的损伤无关的DNA质量而不同，所以进行一次小区域的定量扩增，作为处理对照(32)。DNA内的小靶区域不大会受到损伤，因此可作为相关拷贝数和基因组抽提物PCR质量的指标。

也可使用其他定量QPCR产物的方法，这包括荧光法，发光法，放射性同位素法和免疫学方法(抗体)。其实例是使用以猝灭剂和/或受体染料标记的荧光探针，标记的抗体或寡核苷酸探针，结合技术(即生物素化的探针)等。这种定量PCR试验不再需要进行电泳和磷显影。最后，用上述定量方法的单链QPCR还可用作定量特定DNA链上损伤的方法。

                          实施例4DNA分离和QPCR

用Qiagen基因组20G吸头试剂盒，按照生产商的说明分离出细胞的总DNA。如此得到的DNA是适合长链QPCR的基因组制备物。用溴乙锭荧光法测定细胞总DNA的浓度，用配有360nm激发光通过滤光器和600nm发射光截留滤光器的A4-滤光器荧光计(Optical Technology Device Elmsford，NY)进行，以λ-Hind IIIDNA作为标准物。在QPCR前，先用脉冲场电泳测定DNA质量。样品质量通过线粒体DNA内一段222碱基对片段和β-球蛋白基因内一段84碱基对片段的QPCR来测定(线粒体DNA的引物：14619FOR；14841REV；β-球蛋白引物：48550FOR；48634REV)，据预计，相同的模板浓度应得到相近的QPCR产物(短链)浓度。在小鼠实验中，通过线粒体DNA内一段80碱基对片段和β-球蛋白基因内一段143碱基对片段的QPCR来测定样品质量(线粒体DNA的引物：有义：13281-13306，反义：13335-1336l；β-球蛋白引物：有义：21582-21605，反义：21704-21725)。

QPCR在GeneAmp PCR2400系统内，用GeneAmp XLPCR试剂盒(Perkin-Elmer)进行。反应混合物含15ng基因组DNA作为模板。有关16.2kb线粒体DNA产物(有义引物位置：15149-15174；反义引物位置：14841-14816)和17.7kbβ-球蛋白产物(有义引物位置：44330-44351；反义引物位置：61989-61968)的QPCR的试剂条件是已知的(25，32)。各反应包含1倍XL缓冲液II(Perkin-Elmer-Cetus)，1.1mM Mg(OAc)₂，0.1mg/ml BSA，0.6mM引物，2mCiα³²P-ATP(Dupont-NEN)和1单位rTth聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus)。每次QPCR都以75℃热起动加入rTthDNA聚合酶开始。在小鼠实验中，每一PCR系列中都采用一半(7.5ng)对照基因组模板作为定量对照，从而确保定量测定条件。QPCR完成后，取15μl各QPCR产物在1％琼脂糖凝胶(TBE)上，80-90伏下分离(垂直电泳)4小时。干燥凝胶，与磷屏接触12-14小时，用IMAGEQUANT(Molecular Dynamics PhosphoImager425)定量。虽然描述了采用特定的引物位置和置换进行QPCR，本领域技术人员可以据此设计出不同的引物序列和位置。

计算DNA损伤频率(33)。简而言之，将受损样品(A_d)的扩增用无损对照(A₀)的扩增量进行标准化，得到相对扩增比(10周龄和34周龄组的A₀是10周龄对照组；3周龄小鼠的A₀是3周龄C57小鼠；apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-小鼠的A₀是apoE-/-小鼠)。假设损伤随机分布，并对无损模板(即0级，x＝0)采用Poisson方程(f(x)＝e^λλ^x/x！，其中的λ＝平均损伤频率)，则可算得每DNA链的平均损伤频率；λ＝lnA_d/A₀。用Studentt测验进行统计学分析。因为QPCR测定没有发现各apoE或c57B1对照小鼠组的近心端和远心端主动脉节段的DNA损伤之间有显著差异，所以将各组的两个结果(近心端和远心端)合并，用于主动脉组间比较。

实施例5

转录的Northern分析

用4M异硫氰酸胍收获对照和过氧亚硝酸盐处理的培养物，通过5.7M氯化铯离心分离细胞总RNA(34)。在转录稳定性分析中，在加过氧亚硝酸盐之前先加入2.5mg/ml放线菌素D。用polytron组织助溶剂将心脏组织溶解于4M异硫氰酸胍。然后离心匀浆15分钟(3000×g)，收集上清液，通过5.7M氯化铯离心分离细胞总RNA(34)。通过琼脂糖凝胶电泳分离总RNA，转移到尼龙膜上，预杂交，并与合适的探针杂交(35)。线粒体DNA转录的探针由纯化的线粒体DNA通过PCR制备(16S rRNA：有义引物2005-2022，反义引物2982-3001；ND2：有义引物4831-4847，反义引物5464-5481；Cyt b：反义引物14730-14749，反义引物15845-15863)，凝胶纯化(Qiagen)，然后进行随机³²P-dCTP标记(Stratagene)。在以抽提自小鼠组织的RNA进行的实验中，凝胶纯化的PCR产物含16S rRNA(有义引物nps 1330-1354，反义引物nps 2072-2097)，ND2(有义引物nps 4234-4259，反义引物nps 4916-4941)和Cytb(有义引物nps 14196-14220，反义引物nps14967-14992)基因，被作为随机³²P-dCTP标记探针(Stratagene)的模板。滤膜在-80℃曝光Kodak XAR胶片。通过与市售β-肌动蛋白探针(CLONTECH)的杂交将各样品的RNA水平标准化。对放射性自显影照片进行光密度扫描(Molecular DynamicsDensitometer SI)，用IMAGEQUANT(Molecular Dynamics)定量。至于线粒体转录水平的定量，可采用各种定量mtRNA转录水平的方法。用独立的Studentt测验进行统计学分析。

                   实施例6线粒体蛋白质合成

用现有技术分析线粒体蛋白质合成(37)。简而言之，用无甲硫氨酸的培养基洗涤对照和处理过的细胞，在100mg/ml吐根碱(核蛋白质合成的抑制剂)存在下与400mCi/ml ³⁵S-甲硫氨酸一起孵育2小时，然后与0.1mM冷甲硫氨酸追加反应20-30分钟。用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤。收集细胞沉淀，重悬于溶液化缓冲液(4％SDS)中，超声处理(30％满循环6脉冲，输出量5)，测定总蛋白质。等量标的记合产物(总蛋白)进行10-20％梯度的PAGE-SDS。在Whatman滤纸上干燥凝胶，-80℃曝光Kodak XAR胶片。对所有的非处理和处理样品条带用光密度法检测翻译产物的标记(Molecular Dynamics Densitometer SI)。用各样品条带的标记总量来计算相对掺入水平。就线粒体蛋白质水平的定量而言，可采用各种用来定量线粒体蛋白质合成的方法。用独立Studentt测验进行统计学分析。

                  实施例7MTT和ATP试验

用复合物II(complex II)MTT还原来评估线粒体呼吸(38-42)。将细胞接种在96孔培养板上，密度为8,000个细胞/孔，37℃培养。48小时后，换以无血清含0.2Mm H₂O₂，0.1mM，0.5mM或1.0mM过氧亚硝酸盐的培养基，培养1小时，MTT的终浓度达到2.0mg/ml的再在条件培养基中恢复1小时，裂解细胞，然后在570nm处测定吸光度(25)。用已知数量的活细胞产生的标准曲线将吸光度值转化为MTT还原值。然后将处理后样品的MTT还原值用未处理的对照样品标准化，记录与对照相比的分数。用ATP测定试剂盒(Molecular Probes，A-6608)和MicroLumat Plus LB(EG&G Berthold)显微注射器发光计测定总ATP水平。简而言之，该试验是基于荧光素-荧光素酶在ATP存在下的生物发光(～560nm)。该试验十分敏感；大多数发光计可检测出低至0.1pmol的已有ATP或动态系统中正在形成的ATP。用独立的Studentt测验进行统计学分析。

                        实施例8组织学分析，脂类过氧化和胆固醇水平

取各组的一段主动脉用4％低聚甲醛固定，包埋在石蜡中，切成5μm的切片，脱蜡，复水，并用苏木精和伊红染色，评估动脉粥样硬化损伤。用比色法(586nm，Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA)测定血浆样品中的脂类过氧化水平，该试验对丙二酰醛(malonaldehyde)(MDA)和4-羟基-2(E)-壬烯醛(4-HNE)具有特异性，它们是聚不饱和脂肪酸及相关酯过氧化的最终产物。对这些产物的测定提供了一个脂类过氧化的指数。将样品与4-HNE和MDA标准曲线比较。用胆固醇测定试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，按照生产商的说明，用小鼠血浆样品和标准曲线测定总胆固醇。

                        实施例9体外实验结果

在血管环境中，超氧化物(O₂^-)与一氧化氮反应，并以有限扩散速度形成过氧亚硝酸盐，或者被超氧化物歧化酶还原成过氧化氢(H₂O₂)。因此，用H₂O₂，过氧亚硝酸盐和O₂^-处理的HUVEC和HASMC都证明，过氧化氢和过氧亚硝酸盐在体外介导线粒体损伤和机能失调，因而可能参与动脉粥样硬化的引发。

过氧化氢处理在两细胞系中都提高线粒体DNA损伤，内皮同时还有nDNA损伤。HUVEC和HASMC都用0.2mM过氧化氢处理1小时，然后分析线粒体DNA和核DNA(β-球蛋白)损伤，与未处理的对照比较(表1，图1)。在HUVEC中，线粒体DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)损伤明显(与未处理的对照相比，P＜0.005)，在HASMC中，只有线粒体DNA有明显损伤(P＜0.005)。相反，HASMC与未处理的对照相比没有表现出显著的nDNA损害增加(P＝0.695)。

对过氧化氢处理的时间分析显示，线粒体DNA损伤在两细胞系内的发生都很迅速。细胞用0.2mM过氧化氢处理0-60分钟，在各时刻评估DNA损伤(图1)。HUVEC中，10分钟内出现明显的线粒体DNA损伤(P＝0.037)，HASMC则在15分钟内出现(P＝0.047)(与为处理对照比较)。相反，β-球蛋白基因座未表现出nDNA损伤的迅速积累(图1)，在HUVEC中，需要处理60分钟后才出现明显的持续损伤(P＝0.005)。所以，在HUVEC和HSMAC细胞体外接触反应性氧物质后，迅速发生线粒体DNA损伤。

过氧亚硝酸盐处理在HUVEC和HSMAC细胞内专性损伤线粒体DNA。为了测定过氧亚硝酸盐的作用，细胞用0.1mM和0.5mM过氧亚硝酸盐处理1小时(表1，图2)。与所有未处理的对照相比，用0.1mM和0.5mM过氧亚硝酸盐处理HUVEC引起线粒体DNA损伤显著增加(P＜0.005)，0.5mM过氧亚硝酸盐处理引起HSMAC内线粒体DNA损伤显著增加(P＜0.005)(表1)。

为了评估持续低剂量过氧亚硝酸盐的体外作用，用O₂^-和一氧化氮(O₂^-与一氧化氮反应生成过氧亚硝酸盐)处理HUVEC和HSMAC。处理引起HUVEC内线粒体DNA损伤显著增加，但HSMAC对此具有耐受性(表1，图2)。例如，精胺NONO酸酯持续产生一氧化氮(0.5mM/ml/min)不能引起DNA损伤，O₂^-(2mM/ml/min)处理则在HSMAC内引起明显的DNA损伤(P＜0.05)(表1)，但过氧化氢酶和SOD预处理可防止这种损伤，这说明：O₂^-和O₂^-还原产生的过氧化氢都对介导线粒体DNA损伤负有部分责任。而且，与未处理的HUVEC相比，受持续一氧化氮和O₂^-生成(分别为0.5mM/ml和2mM/m1)作用的HUVEC其线粒体DNA损伤水平显著升高(P＜0.05)(表1)。同样，较高剂量等摩尔一氧化氮和O₂^-的产生(1mM SIN-1)对HUVEC造成显著的线粒体DNA损伤(P＜0.001)，对HASMC则无效(表1，图2)。SOD预处理可避免HASMC内与SIN-1相关的线粒体DNA损伤(表1，图2)。所以，持续低剂量和短时高剂量O₂^-和一氧化氮的产生可引起HUVEC内的线粒体DNA损伤。

用过氧亚硝酸盐处理HUVEC和HASMC显著降低线粒体编码基因的转录水平，所述基因包括NADH脱氢酶2(ND2)和细胞色素b(Cyt b)，但不包括16S rRNA。0.5mM过氧亚硝酸盐使得HASMC内ND2和Cyt b的转录水平降低55％，16SrRNA水平降低14％(图3)。同样，与未处理对照相比，0.5mM过氧亚硝酸盐处理的HUVEC内ND2和Cyt b转录水平降低45-50％，16S rRNA水平降低26％(图3)。在使用较低剂量(0.1mM)的过氧亚硝酸盐时，HUVEC内16S rRNA，ND2和Cyt b转录水平降低25-30％，HASMC内降低5-15％(图3)。

用转录抑制剂放线菌素D预处理细胞发现，过氧亚硝酸盐处理既造成转录抑制(ND2和Cyt b)，也可引起特定转录的降解(Cyt b)。相反，核内β-球蛋白基因的转录水平则不受过氧亚硝酸盐处理的影响。因此，过氧亚硝酸盐能够差异性地作用于线粒体基因的转录和转录稳定性。

反应性氧物质还造成两细胞系内线粒体蛋白质合成的降低。与未处理对照相比，用0.2mM H₂O₂处理HUVEC和HASMC使总线粒体蛋白质合成降低23-33％，0.5mM过氧亚硝酸盐处理则造成(HUVEC和HASMC)55-70％的降低(图4)。低剂量过氧亚硝酸盐(0.1mM)在HASMC内使³⁵S-甲硫氨酸掺入略降12％。因此，反应性氧物质也可能与线粒体蛋白质合成降低相关。

过氧亚硝酸盐处理引起HUVEC和HASMC内总ATP水平和线粒体呼吸(复合物II)水平的降低(图5)。总ATP水平测定发现，0.1mM过氧亚硝酸盐在两细胞系内都没有引起总ATP显著减少，0.5mM剂量则引起了显著的ATP减少(HUVECP＝0.02；HASMC，P＝0.04)。同样，0.1Mm没有引起复合物II MTT还原(线粒体呼吸)的显著降低，0.5mM剂量则引起了显著的降低(HUVEC P＝0.02；HASMC，P＝0.008)。

MTT是OXPHOS复合物II的组成之一，琥珀酸脱氢酶还原MTT是线粒体功能的一个指标，常用作细胞呼吸和氧化还原功能的一种评估手段。所以，MTT还原反映线粒体的氧化还原能力。在平行实验中，用台盼蓝染色细胞来测定与各种反应性氧物质处理相关的细胞死亡率。在进行MTT和ATP试验的时候，两细胞系都几乎没有细胞死亡(＜5％)。所以，反应性氧物质处理对HUVEC和HASMC内的总ATP水平和呼吸有作用。

                    表I与反应性氧物质处理相关的每10kb上损伤估计A)            未处理    0.2mM        0.1mM         0.5mM          降解的

          对照      H₂O₂           过氧亚硝酸盐           过氧亚硝酸盐过氧亚硝酸盐HASMCmtDNA         0        1.68(0.25)^** 0.16(0.05)    1.42(0.35)^**    0nDNA          0        -0.09(0.14)   -0.08(0.05)   -0.04(0.03)      ndHUVECmtDNA         0        2.59(0.33)^** 0.19(0.03)^** 2.81(0.37)^**    0.07(0.03)nDNA          0        1.02(0.11)^** 0.07(0.10)    1.05(0.40)       0.01(0.05)

表I显示，用过氧化氢和过氧亚硝酸盐处理后，与未处理对照相比，线粒体DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)内估计的(每10bk)损伤频率。降解的过氧亚硝酸盐指加给细胞培养物前先与培养基在室温下孵育了1小时的过氧亚硝酸盐。以上是平均值(±SEM)。

                     表II与反应性氧物质处理相关的每10kb上损伤估计A)           未处理    0.2mM          0.1mM          0.5mM            降解的

         对照      O₂^-          O₂^-＋NO      SIN-1           SOD＋SIN-1过氧亚硝酸盐HASMCmtDNA         0        0              0              0.13(0.05)      0.05(0.15)nDNA          0        0              0              nd              ndHUVECmtDNA         0        0.22(0.04)^*   0.41(0.04)^**  1.71(0.33)^**   -0.17(0.12)nDNA          0        0              0.08(0.11)     nd              nd

表II显示线粒体DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)内估计的与超氧化物(O₂^-)和一氧化氮(NO)供体相关的(每10kb)损伤频率。用黄嘌呤氧化酶加2，4-二氧四氢蝶啶产生O₂^-(2mM/ml/min)，用精胺NONO酸酯产生一氧化氮(0.5mM/ml/min)。SIN-1(1mM)用来产生等摩尔的一氧化氮和O₂^-。在SOD＋SIN-1处理中，细胞先以3单位/mlSOD预处理，然后加入SIN-1。缩写：^*表示与对照差异显著(P＜0.05)；^**表示与对照差异显著(P＜0.005)；nd＝无数据；负号(-)表示观察到的损伤比对照更少。

                          实施例10小鼠内的DNA损伤

将高血胆固醇的apoE小鼠和“健康”小鼠分成2个年龄组(杀死时为10周龄和34周龄)，从第6周开始饲以中式(4％脂肪)和西式(21％脂肪)饮食。用QPCR评估主动脉和心脏组织内的DNA损伤，用血浆测定胆固醇和脂类过氧化(4-HNE和MDA)水平。保留每组的一段主动脉，用于组织学研究。

饲以中式饮食的高血胆固醇apoE小鼠的主动脉组织内，线粒体DNA损伤水平明显高于对照(P＜0.05，图6A)。10周龄和34周龄的小鼠都存在这样的差异，这清楚地表明，与“健康”小鼠相比，apoE主动脉存在持续的、严重的线粒体DAN损伤。与0级对照相比，10周龄apoE主动脉的扩增量下降61％(扩增量下降与DNA损伤增加有关)，即0.582±0.123线粒体DNA损伤/10kb，10周龄对照小鼠则为0.0±0.198损伤/10kb(P＝0.018)。同样，34周龄apoE组的估计线粒体DNA损伤比同龄对照组增加3倍(1.325±0.257损伤/10kb，与0.453±0.162损伤/10kb，P＝0.007)。心脏组织中也存在同样情况(左心室，图6B)。例如，10周龄apoE小鼠的扩增量比0级对照下降67％(0.685±0.093损伤/10kb，0.0±0.048损伤/10kb，P＜0.001)，34周龄apoE小鼠的估计线粒体DNA损伤则比同龄对照高约4倍(0.918±0.151损伤/10kb，0.213±0.295损伤/10kb，P＝0.056)。

还对apoE小鼠和对照小鼠内西式饮食的作用进行了评估(图6B)。在对照小鼠中，西式饮食的10周龄对照组主动脉内线粒体DNA损伤水平高于中式饮食对照(西式：0.31±0.17损伤/10kb，中式：0.0±0.20损伤/10kb)。这样的差异在34周龄的对照小鼠间则不明显(中式：0.45±0.16损伤/10kb；西式：0.49±0.25损伤/10kb；P＝0.90)。同样，10周龄对照小鼠中，西式饮食小鼠心脏内的估计线粒体DNA损伤也较高(图6B；扩增量下降58％，0.54±0.23损伤/10kb，中式饮食则为0.0±0.05损伤/10kb)，而且，与主动脉的结果相似，34周龄对照小鼠之间则没有明显差异(中式：0.21±0.29损伤/10kb，西式：0.25±0.21损伤/10kb)。相反，西式饮食的apoE小鼠的主动脉和心脏组织内，线粒体DNA损伤都没有明显增加。因此，食物脂肪的增加似乎只在10周龄对照小鼠中与线粒体DNA损伤增加相关。

年龄还与apoE和对照小鼠主动脉内线粒体DNA损伤增加相关(表2)。34周龄apoE小鼠主动脉内的损伤是10周龄小鼠的2.3-5.8倍(中式饮食：P＝0.013；西式饮食：P＝0.011)，对照小鼠的损伤水平则没有显著提高，但有相当的增加(表2)。看来，年龄升高对中式饮食对照鼠有影响(10周龄：0.0±0.20损伤/10kb，34周龄：0.45±0.16损伤/10kb，P＝0.09)，而西式饮食小鼠年龄造成的差异则较小(10周龄：0.31±0.17损伤/10kb，34周龄：0.49±0.25损伤/10kb，P＝0.556)。相反，心脏内没有发现明显关联性。因此，年龄似乎与apoE小鼠主动脉内线粒体DNA损伤的增加显著相关，并在中式饮食的对照鼠中存在着一种明显的趋势。

因为同基因型同龄中式饮食和西式饮食小鼠之间，线粒体DNA损伤没有显著差异，所以对蛋白质在10周龄小鼠中的效应进行了研究。从第6周开始，给apoE小鼠和c57B1小鼠都饲以4周16％或24％蛋白质的饮食。两种饮食使得apoE小鼠的线粒体DNA损伤水平仍高于对照(主动脉P＝0.01 5，心脏P＝0.005)，但低蛋白饮食显著降低两种对照鼠(P＝0.007)和apoE鼠(P＜0.001)主动脉内的线粒体DNA损伤水平。ApoE心脏内也存在同样的趋势(P＝0.002)。因此，低蛋白饮食与两种小鼠内的线粒体DNA损伤降低相关。

                        表III年龄对动脉粥样硬化(apoE)和对照(C57)小鼠内mtDNA损伤(损伤/10bk)的影响

饮食小鼠 10周龄 34周龄P值4％脂肪对照(C57) 0.00(0.20) 0.45(0.16)0.009 ApoE 0.58(0.12) 1.32(0.26)0.013 21％脂肪对照(C57)0.31(0.17) 0.49(0.25)0.56 ApoE0.15(0.11) 0.88(0.25)0.01

表III列出了与4％脂肪对照组(C57)相比的估计[平均(SE)]mtDNA损伤/10kb。各种饮食都从第6周开始，持续至第10周或34周。用Studentt测验进行统计学分析。

所示是与10周龄c57B1中式饮食对照鼠(0级损伤)相比的估计损伤频率/10kb。所示的数据是平均值(±SEM)。Student t测验的P值是各基因型(apoE或c57)和各种饮食10周龄与34周龄之间的比较。星号(^*)表示与10周龄的同类有显著差异。

                          实施例113周龄apoE-/-和对照小鼠的主动脉mtDNA损伤

另对3周龄apoE-/-和对照小鼠的主动脉mtDNA损伤进行了评估。3周龄apoE-/-小鼠的mtDNA损伤显著高于同龄对照鼠(图8；P＝0.001)，证明mtDNA损伤在势将形成动脉粥样硬化损伤的主动脉内较早发生。

                          实施例12小鼠内的胆固醇水平

如预计，与对照小鼠相比，所有apoE组的胆固醇水平都显著升高(高约4至5倍；P＜0.001)。虽然西式饮食在所有小鼠中都与最高胆固醇水平相关，但这种升高(相对于中式饮食)只在apoE小鼠中具有显著性(高约2.2倍；中式：225.8±33.4mg/dl；西式：490.2±56.7mg/dl；P＝0.0019)。相反，c57B1对照小鼠若饲以西式饮食，则胆固醇水平略高(高约1.6倍；中式：53.4±15.1mg/dl；西式：85.2±10.8mg/dl)，但不具备显著性(P＝0.17)。因此，apoE小鼠的胆固醇水平显著高于同龄c57B1对照鼠，最高胆固醇水平与西式饮食相关。

                         实施例13小鼠内的脂类过氧化

通过测定MDA和4-HNE水平来测定脂类过氧化。高血胆固醇的apoE小鼠的脂类过氧化水平显著高于对照鼠(P＜0.05)。然而，与总胆固醇水平结果相反，apoE小鼠中，西式饮食与中式饮食相比并未显著提高脂类过氧化水平(图9)。相比之下，饲以西式饮食的对照鼠的脂类过氧化则持续高于中式饮食(P＜0.05)。因此，尽管apoE小鼠与对照鼠相比通常具有最高的脂类过氧化物水平，但在apoE小鼠中，饲以西式饮食与中式饮食相比并不提高脂类过氧化水平。

                           实施例14小鼠内的组织学

取各组的一段主动脉包在石蜡中，切成5微米的切片，用苏木精和伊红染色。虽然在10周龄的各组(对照和apoE)中都没有动脉粥样硬化损伤，但不论何种饮食，34周龄apoE组中都有动脉粥样硬化损伤，而34周龄对照鼠中则都没有。定性地说，饲以西式饮食的apoE小鼠其损伤频率和大小都高于饲以中式饮食的apoE小鼠。

                            实施例15apoE-/-，SOD2-/+小鼠动脉粥样硬化和mtDNA损伤的分析

为了确定线粒体机能和抗氧化活性(MnSOD，SOD2)失代偿对动脉粥样硬化是否有影响，培育了一种apoE-/-，SOD2-/+小鼠。此前的研究已证明，杂种SOD2小鼠的线粒体机能和SOD2活性低于野生型。杂种apoE-/-，SOD2-/+小鼠的SOD2活性是apoE-/-小鼠的40％。这些小鼠中的动脉粥样硬化损伤形成与同龄同窝的apoE-/-显著不同(图10A)，apoE-/-，SOD2-/+小鼠的动脉粥样硬化损伤数量比其提高了2.5倍(P＝0.02)(图10B)。所以，apoE-/-，SOD2-/+小鼠的主动脉mtDNA损伤高于同龄同窝的apoE-/-(图10C，P＝0.006)。

                            实施例16体外实验的讨论

本发明研究是为了证明，过氧化氢和过氧亚硝酸盐在体外介导HUVEC和HASMC的线粒体损伤和机能失调。在经过氧化氢处理的两种细胞中，线粒体DNA损伤都很明显，而且，HUVEC具有明显的nDNA损伤。同样，在接触短时高剂量过氧亚硝酸盐时HUVEC(0.1mM和0.5mM)和HASMC(0.5mM)内，线粒体DNA也明显受损。而且，用低剂量持续水平的过氧亚硝酸盐处理时，HUVEC内可观察到与对照相比明显的线粒体DNA损伤，但对nDNA没有作用。同样，SIN-1处理显著提高HUVEC的线粒体DNA损伤。相反，对HASMC的SIN-1处理没有引起明显的损伤，这似乎有违于过氧亚硝酸盐处理的结果(表1)。以上差异可能是因为HASMC还原O₂^-和过氧化氢的能力与HUVEC不同。这与以XO/LZ处理HASMC的结果一致，该处理不造成明显的损伤，但可对HUVEC造成明显的线粒体DNA损伤(表1)。以上结果加上HUVEC一般对反应性氧物质处理更敏感的事实，与以上观点一致。

过氧亚硝酸盐处理后，两种细胞内的ND2和Cyt b转录都减少。虽然ND2和Cyt b转录水平都有相当程度的降低，但仅Cyt b转录水平降低具有显著行(HASMC，P＝0.033；HUVEC，P＝0.011)。ND2和Cyt b转录减少似乎是暂时的，因为在去除反应性氧物质处理的培养基并在条件培养基中恢复2小时后，大多数细胞培养物都恢复到未处理对照的水平。所以，转录减少与反应性氧物质的短时接触直接相关。因为Cyt b转录距离多顺反子mtRNA转录(43-46)转录起始位点最远，距离转录起始位点越远的基因越易(在转录水平上)受随机的线粒体DNA损伤的影响。反应性氧物质存在下转录的稳定性也可能对RNA水平有一定作用。放线菌素D实验提示，在检测Cyt b时，过氧亚硝酸盐处理既引起转录抑制又造成转录不稳定，而ND2则较少受过氧亚硝酸盐造成不稳定的影响。最后，线粒体rRNA的优先表达(47，48)，潜在地使得它们不易受本研究中过氧亚硝酸盐处理的影响。

与转录水平降低相一致，在经短时高剂量反应性氧物质处理的HUVEC和HASMC中都可观察到与之相伴的线粒体蛋白质合成减少。0.2mM H₂O₂处理使得蛋白质合成下降23-33％，0.5mM过氧亚硝酸盐处理则引起蛋白质标记更大的下降(HASMC：对照的30％；HUVEC：对照的45％)。与以上发现一致的还有经反应性氧物质处理后细胞ATP生成和呼吸降低。因此，这些体外结果提示，反应性氧物质可介导一系列与HUVEC和HASMC内线粒体机能相关的事件，最终导致细胞机能失调。

线粒体是细胞ATP的主要生成者，它们同时还是反应性氧的慢性发生器(12-16)，会在电子传递过程(代谢过程)中产生O₂^-。O₂^-随即被线粒体的锰超氧化物歧化酶(MnSOD，SOD2)去除，但该反应产生过氧化氢，后者会在线粒体内累积。或者，O2-会以接近扩散的速度(6.7×10⁹M^-1sec^-1)与一氧化氮反应形成过氧亚硝酸盐(49)。

虽然已知一氧化氮主要具有抗动脉粥样硬化形成的作用，但在已形成动脉粥样硬化的血管内，这些作用会因与O₂^-反应形成过氧亚硝酸盐而丧失。过氧亚硝酸盐易于氧化LDL和清除数种抗氧化剂(10，11)。因此，动脉壁内产生的过氧亚硝酸盐可能直接促进ox-LDL的形成，后者继而可引起线粒体机能失调(53)。例如，用ox-LDL处理成纤维细胞会造成线粒体机能失调(53)。同样，临床相关水平ox-LDL使得内皮细胞内的过氧化氢生产提高了4-12倍(54)。活体研究证实，人冠状动脉内存在着由一氧化氮衍生的氧化剂(例如过氧亚硝酸盐)，其聚集在动脉粥样沉积内的泡沫细胞中，以及早期血管内膜下脂肪痕纹内(55，56)。此外，过氧亚硝酸盐介导酪氨酸残基上MnSOD(SOD的线粒体形式)的硝化，使之失活(57，58)。对重组人MnSOD的过氧亚硝酸盐处理造成对酶活性的完全抑制，并形成硝基酪氨酸和二酪氨酸(57，58)。因此，由于发生动脉粥样硬化的血管存在内皮一氧化氮生产缺陷(59)，而一氧化氮与O₂^-之比对于一氧化氮究竟起抗氧化还是促氧化作用至关重要(5，60)，这些细胞内的一氧化氮生物活性可能更多地起着促氧化而不是抗氧化的作用，导致循环连续的内皮细胞损伤。其他研究比较了有限数量同龄动脉粥样硬化动脉和正常主动脉的线粒体DNA损伤和nDNA损伤，研究显示病患主动脉的线粒体DNA损伤水平显著升高(P＝0.0023)，与以上报道一致。所以，过氧亚硝酸盐似乎介导着多种对细胞的有害作用，包括线粒体DNA损伤，转录和蛋白质水平改变，以及线粒体抗氧化能力降低。

还检测了一氧化氮清除人胎盘滋养层细胞(HPTC)线粒体产生的氧化剂的作用(61)。用L-NAME(一氧化氮合成抑制剂)降低人胎盘滋养层细胞内一氧化氮时，如同预计，细胞氧化剂形成增加。用CuZnSOD和过氧化氢酶处理人胎盘滋养层细胞不减弱NOS抑制引起的氧化剂应答。用黄嘌呤氧化酶，环加氧酶和线粒体OXPHOS等抑制剂的结果表明，只有线粒体OXPHOS抑制剂增强一氧化氮合成酶抑制所引起的氧化剂应答，而XO和环加氧酶的抑制剂则无此效果。这表明，线粒体产生的反应性氧物质是细胞内的主要损伤性物质，一氧化氮酶合成的调节对线粒体产生反应性氧物质具有重要作用。

在动脉的氧化性环境中，血管内皮细胞和平滑肌细胞长期受到反应性氧物质应力。结果，不再对氧化应力做出正确应答的细胞就更容易受反应性氧物质所介导损伤的伤害。本发明证明，HAMSC和HUVEC(尤其是HUVEC)在体外对于此类损伤十分敏感，因此，体内反应性氧物质的慢性产生很可能通过引发线粒体衰变引起血管细胞机能失调，导致许多重要细胞功能的丧失。

                      实施例17小鼠实验讨论

本发明研究的主要目的是检测同龄高血胆固醇apoE小鼠和对照鼠的主动脉和心脏组织内的DAN损伤程度。ApoE小鼠发生动脉粥样硬化的方式与人相似。与饲以中式饮食的相比，饲以西式饮食的apoE小鼠的动脉粥样硬化普遍加快。例如，早在第6周(西式饮食)或第8周(中式饮食)就出现单核细胞对内皮细胞的粘附，然后，早在第8周(西式饮食)或第10周(中式饮食)就产生泡沫细胞，早在第15周(西式饮食)或第20周(中式饮食)就开始形成晚期损伤。有效量实验中所用apoE小鼠内的动脉粥样硬化程度和进程与先前的观察结果一致。

饲以中式饮食的10周龄和34周龄高血胆固醇apoE小鼠动脉中的线粒体DNA损伤显著高于其同龄的c57B1对照。不良饮食，apoE小鼠中，年龄还与线粒体DNA损伤估计频率的直接升高相关(P＜0.05)。其他比较实验显示，apoE主动脉近心端和远心端之间的线粒体DNA损伤水平没有显著差异，所以，在apoE主动脉内观察到的线粒体DNA损伤不可能人为的近心端主动脉特有的动脉粥样硬化形成因素。相反，整个apoE主动脉内都有线粒体DNA损伤增加，因此，这不是动脉粥样硬化损伤发展的结果，而可能是造成动脉粥样硬化的因素之一。

西式饮食的apoE小鼠与其中式饮食的同类相比，线粒体DNA损伤没有显著增加。就此，测定了各组小鼠的总胆固醇水平和脂类过氧化水平。在apoE小鼠中，西式饮食与显著(P＜0.05)高于中式饮食的胆固醇水平相关，但与中式饮食相比未造成脂类过氧化水平显著升高。所以，以上信息提示：中式饮食apoE小鼠内的脂类过氧化水平已经达到最大(可能是因为它们的基因型倾向于高血胆固醇)。因此，脂肪含量较高的西式饮食未能提高apoE小鼠内的脂类过氧化水平超过中式饮食，这与线粒体损伤的结果一致，后者在中式饮食和西式饮食的apoE小鼠间没有差异。所以，在apoE小鼠内，虽然西式饮食可使总胆固醇水平高于中式饮食，但不会显著提高脂类过氧化总水平，可能反映为什么在apoE小鼠中，线粒体DNA损伤与基因型和年龄的关系更密切，而与饮食无关。正如预料的，高血胆固醇apoE小鼠的胆固醇和脂类过氧化水平显著高于“健康”的同龄对照，分别高出4.2-5.7倍(P＜0.001)，1.9-2.7倍(P＜0.05)。虽然已证明，与同龄对照相比，apoE小鼠中存在着与年龄相关的脂类过氧化升高，但没有中式和西式饮食之间脂类过氧化水平比较的报道。所以，本发明的结论表明，虽然西式饮食在apoE小鼠中提高胆固醇水平显著高于中式饮食，但并不改变脂类过氧化产物的总体水平。

虽然，在c57B1小鼠中，年龄和高脂肪饮食与线粒体DNA损伤显著增加没有关联，但是我们发现，中式饮食对照鼠的线粒体DNA损伤随年龄有相当程度的增加，而在10周龄小鼠中则发现损伤因西式饮食而增加的趋势。年龄的增高似乎对中式饮食对照鼠有作用，但对西式饮食小鼠作用则较小。10周龄西式饮食对照鼠也与中式饮食小鼠相比估计也有较高的线粒体DNA损伤频率，但在34周龄对照小鼠中则没有发现饮食与线粒体DNA损伤之间的关联，这提示：饮食对于线粒体DNA损伤的作用在低龄对照小鼠中最显著。与apoE小鼠中的结果相反，与中式饮食的对照鼠相比，西式饮食与脂类过氧化显著升高(P＜0.05)相关，说明脂类过氧化在中式饮食“健康”小鼠中并未达到最大，对照鼠中脂类过氧化产物随底物(西式饮食)水平的提高而提高，这与西式饮食对照鼠的线粒体DNA损伤增加是一致的。

热量限制和低蛋白质饮食曾被认为对许多生物体有利，可延长寿命。因此，两品系的小鼠在进食低蛋白质饮食后的线粒体DNA损伤都持续地显著低于高蛋白质饮食小鼠，这一事实应符合以上观点。为了更充分地阐述这一发现，需要对限制热量饮食的apoE小鼠进行纵向的研究。因为低热量饮食与低反应性氧物质水平相关，以上发现与这样的观点一致，即，反应性氧物质所介导损伤的减少可抑制动脉粥样硬化的形成。

近10年来，已积累了线粒体(损伤和机能失调)在多种慢性、衰老性相关疾病中作用的证据。一个基本的例子是，线粒体损伤随时间在组织内积累，引起细胞OXPHOS电势(势能)下降，同时，OXPHOS介导的反应性氧物质产生增加，表现为细胞机能失调。虽然，已知体外内皮细胞的线粒体易受反应性氧物质介导的损伤，但也有有关动脉粥样硬化患者心血管组织内线粒体DNA病理性突变增加的报道，以及病理性线粒体DNA突变与心脏病危发因素(年龄，吸烟，糖尿病等)相关的报道。有意义的是，吸烟、高血压、高血胆固醇等危发因素提高反应性氧物质的产生，此前的报道称：线粒体是易受损伤的目标。虽然，动脉粥样硬化形成是一个涉及多种步骤的复杂过程，但本发明提出：动脉粥样硬化损伤发生的基本机制之一是从血管组织线粒体损伤积累开始的，最后则造成OXPHOS机能失调，和势能失代偿。这些过程共同造成了反应性氧物质产生增加(在动脉粥样硬化组织中已提及过的特征)和血管细胞机能失调，在动脉内形成一个动脉粥样硬化形成性环境。

本发明首次报道了将动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉组织与同龄对照鼠相比所进行的对线粒体DNA损伤水平的研究。结果显示，线粒体DNA损伤的增加明显地与动脉粥样硬化形成和年龄相关。由于10周龄apoE小鼠内存在明显的线粒体DNA损伤，所以，在该动脉粥样硬化活体模型中，该损伤似乎先于或与动脉粥样硬化损伤的发展同步。此外，主动脉线粒体DNA在体内随年龄增加。而且，apoE基因型似乎对于线粒体DNA损伤水平的影响更强于饮食，虽然饮食可能在低龄“健康”c57B1小鼠中影响着线粒体DNA损伤。所以，apoE小鼠体内的线粒体DNA损伤最后会导致OXPHOS过程失代偿，因此导致内皮细胞机能失调，后者是动脉粥样硬化形成的关键。

                         实施例18线粒体DNA损伤的活体检测

征集正在接受心脏导管治疗的患者进行线粒体DNA损伤活体研究。所有签名人都同意在进行心脏导管治疗时多取一份血样。总共75名患者。用标准技术分离出白细胞(“白细胞层”)，分离出DNA(核DNA和线粒体DNA)。通过定量PCR，用“短线粒体DNA片段”测定线粒体DNA损伤，以β-球蛋白基因内的损伤为对照。图11显示，在具有心肌梗塞危发因素的患者中，线粒体DNA损伤的几率升高。

根据最初的结果，制定一定水平的线粒体DNA损伤为正常。超出此水平认定为高损伤。然后测定了与心脏病危发因素相关的具有线粒体DNA损伤的患者百分比。例如，在吸烟者中，约50％线粒体DNA损伤增加，而非吸烟者中，仅20％线粒体DNA损伤增加。有些情况下具有累加效应，既吸烟又有糖尿病的患者中100％的线粒体DNA损伤增加。该分析中，有某种危发因素显著不同于没有该因素者(例如，吸烟(p＜0.05)；吸烟加糖尿病(p＜0.01)；吸烟加高血压(p＜0.05))。本发明还根据线粒体DNA损伤程度检测了发生冠状动脉粥样硬化的趋势。然而，要确定这种趋势的显著性需要更大规模的患者研究组。

为了进一步测定多种体内环境中线粒体DNA损伤的程度，对5名“超长马拉松选手”和一组6名同龄且健康而活跃但不是马拉松选手的人进行了检测。首先，在马拉松选手进行20英里“训练跑”之前和之后测定线粒体DNA损伤。采集血样，获得白细胞层，评估线粒体DNA损伤。图12显示刚跑完时，线粒体DNA损伤略有增加，但经4小时后恢复正常。另一天，给予马拉松选手和对照高脂肪食物。该高脂肪食物是当地一家墨西哥餐厅的“EI Grande Platter”，含约3000卡热量，其中约60-70％来自脂肪。餐后立即，餐后2小时和6小时采集血样。制备白细胞层，分离DNA。用白细胞线粒体蛋白质为来源，定量测定线粒体蛋白质损伤。图13和14显示对照体内，线粒体DNA损伤逐步略有升高，2小时时，线粒体蛋白质损伤增加，4小时时下降。在马拉松选手中，在2小时时，线粒体DNA损伤和蛋白质损伤实际上已降至基线以下，至6小时开始返回基线。假设，马拉松选手因奔跑时受到增高的氧化应力，所以他们的抗氧化保护系统更有效。于是，在接触DNA损伤的刺激时，他们的损伤比普通人更少。因此，他们的抗氧化系统被激活，使他们产生的氧化剂水平降至静息水平以下。

                        实施例19动脉粥样硬化主动脉和健康主动脉内的mtDNA损伤分析

为了检测人动脉粥样硬化组织内的mtDNA损伤是否增加，对同龄人的动脉粥样硬化主动脉和健康主动脉进行DNA损伤分析。将各组的主动脉固定在4％低聚甲醛中，包在石蜡中，切成5微米的切片，脱蜡，复水，以苏木精和伊红染色，评估动脉粥样硬化损伤的发生情况。

QPCR分析显示动脉粥样硬化组织内的mtDNA损伤的增加显著高于健康对照组的主动脉(图15A和15B)。相反，作为核DNA损伤的标志，动脉粥样硬化主动脉内的β-球蛋白基因簇与对照相比，没有明显的持续损伤(P＝0.15)。因此，在人动脉粥样硬化主动脉内，mtDNA遭受持续显著而且专性的损伤。

                         实施例20mtDNA损伤对动脉粥样硬化的影响

动脉粥样硬化主动脉组织的mtDNA损伤水平与同龄对照相比显示，mtDNA损伤增加显然与动脉粥样硬化形成相关。由于3周龄和10周龄apoE-/-小鼠内有显著的mtDNA损伤，所以，在体内，损伤似乎先于或与动脉粥样硬化损伤同时发生。而且，在apoE-/-，SOD2-/+杂交鼠内，动脉粥样硬化损伤频率和主动脉mtDNA损伤都高于同窝的apoE-/-鼠，显然，线粒体的功能对于动脉粥样硬化形成十分重要。所以，以上信息提示：1)在人和小时的动脉粥样硬化主动脉内，mtDNA损伤都显著增加；2)主动脉mtDNA损伤在活体内随年龄而增加；3)在体内，mtDNA损伤先于或与动脉粥样硬化损伤产生同时发生；4)线粒体损伤是动脉粥样硬化的一个主要因素。

以下是本发明的参考文献：

1.Carpenter等(1995)，动脉粥样硬化118，169-172。

2.Halliwell，B.等(1989)，英国实验病理学杂志70，737-757。

3.Berliner等(1996)，自由基生物医学20，707-727。

4.Massaeli等(1995)，心血管研究29，597-603。

5.Freeman等(1995)，高级药理学34，45-69。

6.Corral-Debrinski等(1992)，Mut.Res.275，169-180。

7.Parthasarathy等(1992)，脂类研究进展31，127-143。

8.Berliner等(1995)，循环91，2499-2496。

9.Kimura等(1995)，动脉粥样硬化118，1-8。

10.Darley-Usmar等(1992)，自由基研究通讯17，9-20。

11.Graham等(1993)FEBS Lett 330，181-185。

12.Forman，H.J.(1982)自由基生物学，第V卷，Prior，W.A.编辑(AcademicPress，Orlando)，pp.65-90。

13.Turrens，J.(1980)，生物化学杂志191，421-427。

14.Bobreris，A.，Turrens，J.F.(1980)，超氧化物和超氧化物歧化酶的化学和生物化学，第I卷，Bannister，J.V.编辑(Elsevier，Amsterdam)pp.84-91。

15.Chance等(1979)，生理学回顾，59，527-604。

16.Breen等(1995)，自由基生物医学18，1033-1077。

17.Chen等(1994)，美国科学院院报91，4130-4134。

18.Zhang等(1990)，生物化学杂志，265，16330-16336。

19.Bandy等(1990)，自由基生物医学，8，523-539。

20.Ferrari等(1985)，分子细胞心脏病学杂志，17，937-45。

21.McCord，J.M.(1988)，自由基生物医学，4，9-14。

22.Giulivi等(1995)，生物化学和生物物理学学报，316，909-916。

23.Bindoli，A.(1988)，自由基生物医学，5，247-261。

24.Hruszkewyca，A.M.(1992)，突变研究，275，243-248。

25.Yakes，等(1997)，美国科学院院报，94，514-519。

26.Adachi等(1993)，生物化学生物物理学研究通讯，195，945-951。

27.Trounce等(1989)，柳叶刀，1，637-639。

28.Cortopassi等(1990)，核酸研究，18，6927-6933。

29.Sastre等(1996)，肝脏学，24，1199-1205。

30.Iyer等(1961)，自然，192，535-541。

31.Beckman等(1990)，美国科学院院报，87，1620-1624。

32.Balligner等(1996)，癌症研究，56，5692-5697。

33.Yakes等(1996)，检测DNA损伤和突变的技术，Pfeifer，G.P.编(Plenum，NY)，169-182。

34.Chirgwin等(1979)，生物化学，18，5294-5299。

35.Torroni等(1990)，生物化学杂志，265，20589-20593。

36.Bogenhagen等(1978)，分子生物学杂志，119，69-81。

37.Ballinger等(1992)，自然遗传，1，11-15。

38.Slater等(1963)，生物化学和生物物理学学报，77，383-393。

39.Berg等(1990)，APMIS，98，152-162。

40.Lippold HJ.(1982)，组织化学，76，381-405。

41.Schanenstein等(1972)，Monatshefte fur Chemie，103，1271-1275。

42.Huet等(1992)，细胞计数，13，532-539。

43.Ojala等(1980)，细胞，22，393-403。

44.Ojala等(1981)，自然，290，470-474。

45.Attardi等(1985)，线粒体研究的成果与前景，Qkuagliarello等编(Elsevier Science，NY)，145-163。

46.Doerson等(1985)，生物化学杂志，260，5942-5949。

47.Christianson等(1986)，美国科学院院报，83，6277-6281。

48.Christianson等(1988)，分子细胞生物学，8，4502-4509。

49.Huie等(1993)，自由基研究通讯，18，195-199。

50.Plamer等(1988)，自然333，664-666。

51.Yao等(1992)，循环，86，1302-1309。

52.Garg，U.C.，Hassid，A.(1989)，临床研究杂志，83，1774-1777。

53.Fossel等(1994)，癌症研究，54，1240-1248。

54.Holland等(1996)，细胞物理学杂志，166，144-151。

55.Leeuwenburgh等(1997)，生物化学杂志，272，1433-1436。

56.Beckmann等(1994)，生物化学，375，81-88。

57.MacMillan-Crow等(1996)，美国科学院院报，93，11853-11858。

58.MacMillan-Crow等(1998)，生物化学，37，1613-1622。

59.Lloyd-Jones等(1996)，医学评论年刊，47，365-375。

60.Darley-Usmar等(1995)，FEBS Letters 369，131-135。

61.Goda等(1996)，美国物理学杂志，271，H1893-1899。

所有本文中提到的专利和出版论文都反映了本领域技术人员的水平。而且，本发明对这些专利和出版论文进行了同样程度的引用，犹如本发明对各出版论文的具体单独引用。

本领域技术人员不难看出，本发明能够达到所述的目的和优点，以及隐含于其中的固有目的和优点。以上实施例，方法，过程，处理方法，分子以及具体的化合物代表着优选实施方式，是举例，而不是对本发明范围的限定。本领域技术人员不难看出其他改变和用途都为本发明精神和范围所涵盖。