含有香菇菌丝体提取物的LAK活性筛选材料以及使用该提取物的LAK活性筛选方法

摘要

本发明的目的是提供廉价材料和方法,用于筛选显示抗肿瘤和/或抗癌活性的免疫治疗剂。本发明提供了一种方法用于体外确定适用于受试者的具有LAK活性增强作用的材料,包括步骤:(a)从受试者收集外周血液以制备淋巴细胞部分,(b)通过将本发明的筛选材料加入或不加入到所述淋巴细胞部分,制备LAK诱导样品和对照样品,(c)测量所述诱导样品与所述对照样品的LAK活性并比较结果,以确定筛选材料对所述受试者的体外LAK活性增强作用。

说明书

发明领域

本发明涉及肿瘤免疫学领域。具体地，本发明涉及筛选具有抗肿瘤和/或抗癌活性的免疫治疗剂的材料和方法。更具体地，本发明涉及为了在体外确定是否可以获得体内LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞活性增强作用的筛选材料和方法。

现有技术

在肿瘤免疫学领域众所周知，肿瘤细胞含有肿瘤抗原。肿瘤细胞表达的肿瘤抗原包括在肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的肿瘤特异性抗原(TSA)，以及在正常细胞和肿瘤细胞中都表达，但表达水平很低除非被恶性转化而上调的肿瘤相关抗原(THA)。当发生遗传改变时，作为正常细胞被恶性转化的结果或者作为由该遗传改变而导致的在表达调节上的变异的结果，这些肿瘤抗原才开始被表达。治疗癌症(其中存在有改变了抗原表达的肿瘤细胞)最常使用的疗法是免疫疗法。这类疗法可包括用肿瘤抗原免疫病人或者使用能增强病人免疫功能的药物。现在已经公认，在免疫系统中具有功能的各种细胞中，NK细胞(天然杀伤细胞)表现出特别有力的抗肿瘤细胞作用。还认识到通过使用免疫疗法能增强NK细胞的活性。NK细胞是存在于正常个体中的非T/非B细胞毒淋巴细胞，并且已知它们不仅针对肿瘤细胞，而且针对病毒感染的细胞以及其它不表达或减少表达I型MHC分子的细胞均具有MHC抗原非限制的细胞毒作用。然而，现已鉴定出对NK细胞具有抗性的肿瘤细胞。

美国国家癌症研究所(NCI)的S.Rosenberg博士发现，将外周淋巴细胞与白细胞介素2(IL-2)温育可以诱导产生杀伤细胞，其对广泛的癌症靶细胞(包括自体癌症细胞)显示细胞毒性，并且这些杀伤细胞甚至可以杀死抗NK细胞的癌症细胞(见日本专利公开文本116518/87)。这些杀伤细胞被命名为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。LAK细胞并不是由细胞学上均一的群体所组成，并已知其包括NK细胞和杀伤T细胞。最近，对过继免疫疗法进行了试验，其中来自受试者的外周淋巴细胞被细胞培养系统中的IL-2激活，接着将显示抗肿瘤活性的LAK细胞回输入受试者中(LAK疗法)。已有报道通过使用包括反复施用该LAK细胞的过继免疫疗法，使晚期癌症达到了缓解或者使肿瘤生长得到了抑制。然而LAK疗法在不同的个体中所发挥的作用是不同的，并且有时几乎没有任何作用。它还包括许多问题：诸如由于从病人中分离大量白细胞而强加于受试者的物理应激以及大量培养所分离白细胞的高花费等等，此外，包括直接给予IL-2的LAK疗法由于高浓度给予IL-2导致严重的副作用。

具体地，已知使用IL-2的LAK过继免疫疗法导致一些副作用，诸如全身疲惫、寒战、发烧、低清蛋白血症、贫血、嗜酸性粒细胞增多，并且这些副作用要比单独施用IL-2时所导致的副作用更严重。更为显著地，某些重要的副作用与LAK细胞针对正常细胞的细胞毒性相伴随。另有报道，LAK细胞针对造血于细胞的这种细胞毒性引起贫血和血小板减少，以及在体外导致对淋巴细胞、巨噬细胞以及血管内皮细胞的损伤。而且，通过口服途径施用的IL-2不能被良好地吸收，因而当前必须主要通过注射直接施用。

因而，希望在体外确定通过直接施用是否可以增强LAK活性以及由于疗效的不确定性避免使用易于导致副作用的LAK疗法。然而，使用IL-2的体外筛选有花费太高的缺点。

已知某些细菌、食物和其它天然存在的物质具有抗癌特性。优选细菌及食物型物质用作抗癌剂，这是由于它们通常有温和的特性和低副作用性。通过使用细菌治愈癌症已进行了许多试验，正如在有关报告中所显示：由粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)和生脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的培养物过滤液组成的Coley毒素(1964)；用BCG治疗白血病(MatheG.，癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)，14，1，1971)；豚鼠的肿瘤消退(Zbar，B.等人，国立肿瘤研究所杂志(J.Natl.CancerInst.)，48，831，1971)；和施用酵母细胞壁多糖抗移植的肿瘤细胞(诸如，例如，肉瘤180)的有效性。

特别地，对来自酵母的多糖(诸如酵母葡聚糖和酵母甘露聚糖)以及来自其它细菌、来自地衣和担子菌类的多糖之抗癌作用进行了大量的研究。在它们当中，当前可以得到的在市场中作为抗癌免疫强化剂的商业产品包括来自培养的kawaratake菌丝体的Krestin(采绒革盖菌(Coriolus versicolor)，担子菌纲(Basidiomycetes)：多孔菌科(Polyporaceae))(宿主免疫功能的增强剂，Kureha Chemical Industryand Sankyo Co.Ltd.)，来自香菇(Lentinus edodes)称作香菇多糖的一种多糖，以及来自suehirotake(裂褶菌(Schizophyllum commune))的一种多糖。

香菇(shiitake)是一种常见的可食用蘑菇，见于日本和中国，并且在日本已栽培了大约300年。最近对其药理作用及有效成分予以了阐明并报道有多种作用，诸如对大鼠及小鼠的大肠和肝脏中移植肿瘤细胞的生长抑制作用(Sugano N.等人，癌症通讯(Cancer Letter)，27：1，1985；Suzuki Y.等人，日本结肠直肠学会杂志(Journal of the Japan Society ofColoproctology)，43：178，1990)、促有丝分裂作用(Tabata T.等人，免疫药理学(Immunopharmacology)，24：57，1992；Hibino等人，免疫药理学，28：77，1994)等等。

本发明者研究了香菇的LAK活性增强作用(抗肿瘤和/或抗癌活性)，目的在于提供用于筛选具有体内LAK活性增强作用(其由直接施用香菇菌丝体提取物证实)的材料和方法。

在常规方法中，通过对宿主实际施用LAK活性增强剂或者将激活的淋巴细胞(通过分离大量的自体淋巴细胞，其后体外用LAK活性增强剂激活制备)再输入到宿主中测试LAK活性增强作用。该方法牵涉到许多问题(诸如，强加于受试者的物理应激、该疗法的高花费)。因而，建立体外筛选方法以证实LAK活性增强剂是否实际在体内有作用将使减小物理应激和高花费成为可能。

发明内容

本发明的发明者发现，菌丝体(为香菇的可食用子实体之前体)提取物所具有的免疫增强活性、抗肿瘤活性和/或抗癌活性远高于子实体。我们也发现可以将该提取物用作IL-2的替代物，体外诱导LAK活性。我们是在这种发现基础上完成本发明的，即通过直接体内施用所述提取物所显示出的体内抗肿瘤作用和/或抗癌作用，特别是LAK活性增强作用能够在体外筛选。

更具体地，本发明者发现，体内细胞毒性(其是由直接施用抗肿瘤或抗癌剂，特别是施用含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂产生)与将制备自受试者的淋巴细胞用所述LAK活性增强剂激活时所产生的细胞毒性具有正相关关系。本发明提供一种适于受试者的、用于在体外确定具有LAK活性增强作用的材料之方法，包括步骤：

(a)从受试者分离外周血液以制备淋巴细胞部分，

(b)制备LAK诱导样品(其是通过用本发明的筛选材料处理所述淋巴细胞部分产生)，和对照样品(其是在不存在筛选材料时产生)，和

(c)测量和比较所述诱导样品与所述对照样品的LAK活性，确定筛选材料对所述受试者的体外LAK活性增强作用。本发明还提供含有香菇菌丝体提取物的筛选材料，该筛选材料能用于所述体外筛选方法以筛选体内LAK活性是否能够得到增强。因而本发明涉及含有香菇菌丝体提取物的筛选材料以及使用所述材料的筛选方法，该筛选方法能够在施用LAK活性激活剂之前，体外确定是否能够从LAK活性增强剂预期体内LAK活性增强作用。本发明的筛选材料和筛选方法可应用于人类以及家养动物。

正如本文所用，“LAK活性”的含义为细胞毒T-淋巴细胞的抗肿瘤细胞毒活性，它攻击不被具有NK活性的淋巴细胞识别的肿瘤，但是它对自体正常细胞几乎没有什么影响。“LAK活性增强”指增强该LAK活性的作用，它诱导从淋巴细胞产生LAK细胞或者进一步增强现有LAK细胞的抗肿瘤活性。

LAK活性的增强增加了LAK细胞的抗肿瘤活性，它可导致细胞介导的免疫功能的提高。因而，本发明不仅能应用于提高抗肿瘤活性的治疗而且能应用于提高免疫功能的治疗。

附图简述

图1是与表1中的数据相对应的条形图，表示用本发明的香菇菌丝体提取物筛选LAK活性增强的结果。

本发明的最佳实施方案

本发明提供含有香菇菌丝体提取物的筛选材料，以及使用所述材料的筛选方法，该筛选方法能够在施用所述提取物之前，体外确定是否可以预期由直接体内施用抗肿瘤剂或抗癌剂(特别是含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强配方)所产生的体内LAK活性增强作用。正如本文所用，“筛选材料”指用于体外测试由体内施用获得的LAK活性增强作用的材料。“香菇菌丝体提取物”在本发明中用作筛选材料，指在有水和酶存在下，通过压榨和分解菌丝体(从培养于固体培养基的香菇生长出来)或者含有所述菌丝体的固体培养基本身所制备的提取物。

正如本文所用，“香菇菌丝体提取物”优选地由(但不限于)以下方法获得。将香菇菌种接种在以蔗渣(甘蔗余渣)和去脂稻糠为基础的固体培养基上以生长菌丝体，接着将含有已生长好菌丝体的固体培养基去木质化，使大约或者少于30％(重量)的部分通过12-目筛。向该去木质化的固体培养基加入水和一种或多种含有糖酶、蛋白酶或其组合的酶，并将所述固体培养基保持在大约30-55℃温度压榨和碾磨。用于本步骤的酶包括但不限于纤维素酶、蛋白酶或葡萄糖苷酶。调整该步骤压榨和碾磨的固体培养基，以使至少70％(重量)的蔗渣纤维能够通过12-目筛，接着将固体培养基加热到95℃温度以确保酶的灭活和灭菌。最后，将所得悬浮液过滤得到香菇菌丝体提取物。

香菇菌丝体提取物可直接用于筛选材料或者本发明的免疫治疗剂，但是，可以方便地将其浓缩及冻干为粉末以便以多种形式保存和使用。冻干产物为具有吸湿特性的棕色粉末，并有特殊的味道和气味。

可以将本发明的香菇菌丝体提取物直接加到从外周血液制备的淋巴细胞部分。当将香菇菌丝体提取物直接加到淋巴细胞部分时，它们在本发明的筛选材料中所含有的浓度为优选地1ug/ml-100mg/ml，更优选地1μg/ml-100μg/ml，最优选地10μg/ml-50μg/ml。在加到培养细胞或者直接加到外周血液之前，优选地将本发明的香菇菌丝体提取物用丙酮灭菌。

使用本发明筛选材料的筛选方法可以按Takagi等人的方法(临床免疫学(Clinical Immunology)，19：245-249，1987)进行，除了使用筛选材料(诸如，香菇菌丝体提取物)取代IL-2。

因此，本发明的LAK活性增强筛选方法为用于体外确定适于受试者的、具有LAK活性增强作用材料的方法，包括步骤：

(a)从受试者分离外周血液以制备淋巴细胞部分，

(b)制备LAK诱导样品(其是通过用本发明的筛选材料处理所述

   淋巴细胞部分产生)，和对照样品(其是在不存在筛选材料时

   产生)，和

(c)测量和比较所述诱导样品与所述对照样品的LAK活性以确定

   筛选材料对所述受试者的体外LAK活性增强作用。

为诱导LAK细胞，从受试者的外周血液分离淋巴细胞。将肝素加入到来自受试者的外周血液中，在Ficoll-Conray溶液(比重＝1.077)中通过密度梯度离心分离位于界面的单核细胞。经分离的单核细胞用PBS(pH7.4，没有Ca和Mg)洗2-3次，然后以1×10⁶个细胞/毫升的密度悬浮于培养基(优选地，含有FBS(灭活的胎牛血清)的RPMI1640培养基(Gibco)和/或抗生素(如果需要的话))中。将该悬浮液转至用自体血清(血浆)在37℃预包被15分钟的培养皿中，并在37℃温育1小时。将未附着细胞作为淋巴细胞部分予以回收。

LAK诱导样品由例如以下方法制备。将由上面步骤制备的淋巴细胞部分以终浓度1×10⁵-1×10⁶个细胞/毫升悬浮于培养基中，并将100μl含有悬浮细胞的培养基以1×10⁴-1×10⁵个细胞/孔的密度加到每个孔中。本领域技术人员基于所使用效应细胞的活性以及靶细胞对效应细胞的敏感性等可以大致确定每孔的细胞数。依实验设计，所述悬浮溶液含有香菇菌丝体提取物作为筛选材料，其终浓度范围为1ng/ml-100mg/ml。

因而，在含有多种浓度(包括零)的本发明之香菇菌丝体提取物中培养受试者的淋巴细胞以制备效应细胞。正如本文所用，术语效应细胞指在培养条件下处理3天的细胞，并且既包括与LAK活性增强剂共培养的淋巴细胞(用LAK活性增强剂处理的淋巴细胞)又包括在没有LAK活性增强剂的单独培养基中培养的淋巴细胞(在无提取物条件下处理的淋巴细胞)。

对照样品与LAK诱导样品的制备方法相同，除了加入无菌的重组IL-2(rIL-2，2000U/ml)取代筛选材料。

LAK活性能够由⁵¹Cr释放试验、〔³H〕尿苷试验等确定。就方便性和客观性而言，优选⁵¹Cr释放试验用于本发明。⁵¹Cr释放试验是体外确定针对LAK细胞(诱导自用LAK活性增强剂处理的淋巴细胞)之靶细胞的细胞毒性测定方法之一。⁵¹Cr释放试验是一种确定效应细胞对靶细胞的细胞毒性的方法，其包括步骤：

(i)将⁵¹Cr-标记的铬酸钠加到靶细胞中以标记靶细胞，

(ii)靶细胞与用筛选材料刺激的效应细胞(诸如，杀伤T细胞

或LAK细胞)或用IL-2刺激，作为对照的效应细胞反应，和

(iii)测量从被效应细胞提升(bursted)的靶细胞释放到细胞培养

上清液中的⁵¹Cr量。

在⁵¹Cr释放试验中用作靶细胞的次代培养细胞优选Daudi细胞或Raji细胞。将培养于培养瓶中的靶细胞回收，用⁵¹Cr标记并且标记后接着就分入到微滴定板的每一个孔中。优选使用适于细胞生长的培养基，例如靶细胞培养基。液体培养基包括，例如，用血清、抗生素等大致补充的RPMI 1640。

每10⁶个培养的靶细胞加入100-150μ Ci⁵¹Cr-铬酸钠，接着彻底搅拌并在37℃温育1-2小时以标记靶细胞。培养细胞用PBS洗三次，并接着以1×10⁶个细胞/毫升悬浮在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中。将标记细胞用用于培养的培养基或磷酸盐缓冲液(PBS)洗，并在含有10％胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)的培养基中调整至终浓度为1×10⁶个细胞/毫升供测定。将靶细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度加入到微滴定板的每一个孔中，每孔加50μl。

在确定细胞毒性的测定中，对每个含有所述靶细胞的孔进一步提供100μl 1N HCl用于最大离解，单独的100μl培养基用于自然离解，或者提供效应细胞(在100μl培养基中，密度为1×10⁵-1×10⁶个细胞/毫升，用本发明的香菇菌丝体提取物(在多种浓度下)刺激或者用2000U/ml的IL-2刺激，作为对照)用于实验离解。接着，将微滴定板在板式离心机上以800转/分钟离心5分钟，收集孔底部的细胞，接着在含5％CO₂的温育箱中37℃温育3.5小时。

在⁵¹Cr释放试验中，由下面等式计算对靶细胞的毒性。LAK活性％＝[实验离解(cpm)－自然离解(cpm)]/[最大离解(cpm)－自然离解(cpm)]×100

筛选材料的体外LAK活性诱导能力，可以通过比较由上面等式计算出的诱导样品与对照样品的LAK活性来确定。

在确定最大离解、自然离解和实验离解的步骤中，将靶细胞在5％CO₂、37℃温育。本领域技术人员依据实验目的、所使用的细胞数量或者其他条件可以大致确定培养周期；例如，在本发明中为3.5小时。

释放到培养上清液中的⁵¹Cr的放射性可以用闪烁计数仪等测量。

在本发明优选的实施方案中，各步骤按如下进行，尽管作适当的修改将能被本领域技术人员理解。

从温育的板收集每孔中的培养上清液以在闪烁计数仪中测定放射性。

将在上面的筛选方法中显示体外LAK诱导活性的香菇菌丝体提取物施用7天，3600毫克/天，以诱导体内LAK活性。将由上面的淋巴细胞回收方法收集的淋巴细胞部分用于测定LAK活性百分比，测定条件与所述LAK诱导样品的测定条件相同，结果显示体内LAK活性增强作用与体外结果具有正相关关系。

以下实施例进一步阐明本发明，而不应认为限制本发明的范围。本发明的技术人员应当理解可以对本发明进行多种修改而不背离本发明的精神。

实施例实施例1香菇菌丝体提取物的制备

将由90份(重量)蔗渣和10份(重量)稻糠组成的固体培养基用适量纯水浸泡，接着用香菇菌丝接种，并在控制温度和湿度的温育箱中静置以生长菌丝体。在菌丝体覆盖固体培养基后，将蔗渣基质去木质化以使24％(重量)或更少通过12-目筛。将3.5升纯水和2.0克纯化的纤维素酶加入到1.0千克该去木质化的培养基中，同时保持固体培养基在40℃温度以制备含培养基的混合物。

接着，通过可变速齿轮泵循环含培养基混合物，在此期间固体培养基在齿轮处被压榨和碾磨大约200分钟以使大约80％(重量)的蔗渣纤维能够通过12-目筛。在压榨和碾磨含培养基混合物时所述混合物的温度逐渐上升。接着，将含培养基混合物进一步加热至90℃以确保酶的失活和灭菌，并在90℃静置30分钟。将所得含培养基混合物通过60-筛眼滤布过滤，得到香菇菌丝体提取物溶液，将该提取物溶液浓缩并接着转化为冻干粉末。

上述制备的香菇菌丝体提取物含有：25.3％(重量/重量)碳水化合物(由苯酚-硫酸方法测定)，19.7％(重量/重量)蛋白质(由Lowry法测定)，2.6％(重量/重量)多酚(由Folin-Denis法测定，使用没食子酸作为标准物)。香菇菌丝体提取物进一步含有：8％粗脂肪，22％粗灰分和大约20％可溶性的无氮非碳水化合物。

香菇菌丝体提取物的糖组成(％)如下：木糖(Xyl)15.2，阿拉伯糖(Ara)8.2，甘露糖(Man)8.4，古洛糖(Gul)39.4，半乳糖(Gal)5.4，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcN)12.0，葡糖醛酸(GluUA)酸(GluUA)11.3。实施例2 LAK活性的确定

最初，在施用香菇菌丝体提取物之前和口服香菇菌丝体提取物(每个受试者每次1200毫克、每天三次、持续一周)之后从受试者A、B和C收集外周血液。由下面方法，从这些外周血液分离的淋巴细胞部分能够用于筛选本发明的提取物之体内淋巴细胞激活能力与提取物之体外淋巴细胞激活能力间的相互关系。

首先将肝素加入到外周血液，在Ficoll-Conray溶液(比重＝1.077)中通过密度梯度离心分离位于界面的单核细胞，接着将分离的单核细胞用PBS(pH7.4，没有Ca和Mg)洗两次，然后以1×10⁶个细胞/毫升的密度悬浮于含有10％FBS(灭活的胎牛血清)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。将由上面方法分离的细胞转至用自体血清(血浆)在37℃预外包15分钟的培养皿中，随后在37℃温育1小时，接着回收未附着细胞，作为淋巴细胞部分。

将传代培养于含有10％FBS的RPMI 1640培养基的靶细胞(Daudi细胞)通过离心回收，并与100-150μCi⁵¹Cr-铬酸钠(New EnglandNuclear)/10⁶个细胞在5％CO₂温育箱中37℃温育1小时。将⁵¹Cr标记的培养细胞用PBS洗三次，并接着以1×10⁶个细胞/毫升悬浮于含有10％FBS的RPMI 1640培养基。

将按上述标记的50μl等分试样靶细胞(5×10⁴个细胞/孔)加到微滴定板的每个孔中，将100μl 1N HCl进一步加到最大离解组(阳性对照)的每个孔中，将100μl含有10％FBS的RPMI 1640培养基进一步加到自然离解组(阴性对照)的每个孔中，将用10μg/ml本发明的香菇菌丝体提取物刺激(或者用rIL-2刺激，2000U/ml，作为对照)的效应细胞进一步加到实验离解组的每个孔中(每孔100μl，1×10⁴个细胞/孔)。将板在板式离心机中以800转/分钟离心5分钟，收集孔底部的细胞，并接着在5％CO₂温育箱中37℃温育3.5小时。

通过SOKEN-PETΣ-96从温育板收集每孔中的培养上清液，并在γ-闪烁计数仪中测量放射性。

由下面等式计算LAK活性。

LAK活性％＝[实验离解(cpm)－自然离解(cpm)]/[最大离解(cpm)－自然离解(cpm)]×100

结果见表1和图1表1

                            LAK活性

                             受试者试验号                     A        B       C 1     施用前             13％    27％    14％ 2     使用提取物筛选     21％    34％    15％

   (终浓度：10μg/ml) 3     施用提取物后       40％    43％    15％工业应用性

将香菇菌丝体提取物口服施用于受试者A和B显示体内LAK活性的增强(见表1，试验号3)。用本发明提取物刺激分离自受试者A和B的外周血液的淋巴细胞，用本发明提取物进行体外筛选表现出LAK活性增强作用，并且所述作用与通过受试者A和B直接口服施用本发明提取物所获得的LAK活性增强作用具有正相关关系(见表1，试验号2)。因而，发现通过口服施用获得的本发明之香菇菌丝体提取物的LAK活性增强作用能够由体外筛选预测。

将香菇菌丝体提取物实际口服给予受试者C没有显示体内LAK活性的增强(见表1，试验号3)。甚至用本发明提取物刺激从受试者C的外周血液收集的淋巴细胞时，用本发明提取物体外筛选没有显示LAK活性增强作用(见表1，试验号2)。该实施例还证明了通过口服施用本发明之香菇菌丝体提取物获得的LAK活性增强作用能够由体外筛选预测。

因而，发现通过口服施用获得的本发明的LAK活性增强剂的LAK活性增强作用能够准确地从体外筛选结果预测。所以，直接施用含有本发明之香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂之体内LAK活性增强作用，能够在将所述LAK活性增强剂实际直接施用前方便地在体外确定。作为结论，能够将LAK活性增强剂快速有效地给予有可能成功地获得LAK活性增强作用的受试者，此外，能够避免将所述LAK活性增强剂无效地给予没有可能成功地获得LAK活性增强作用的受试者。

而且，在本发明的方法中，由于LAK活性增强剂的体内治疗作用能够在体外筛选，不必从受试者的血液收集大量的淋巴细胞，从而极大地减轻了受试者的物理应激。