植酸酶基因在酵母系统中的过量表达

摘要

本发明涉及在酵母系统中产生具有植酸酶活性的异源蛋白或多肽的方法。本发明还提供热稳定性提高的具有植酸酶活性的蛋白。还提供产生异源植酸酶的酵母菌株和用来产生所述植酸酶的载体。

说明书

发明领域

本发明涉及在酵母中产生植酸酶的方法、表达异源植酸酶的酵母菌株和酵母产生的异源植酸酶。

发明背景

植酸酶是一组特定的单酯磷酸酶，触发植酸盐(肌醇六磷酸盐)盐释放磷酸(“P”)需要植酸酶，植酸盐是谷类食品或饲料中P的主要贮藏形式(Reddy，N.R.等，“豆类和谷类植酸盐”，Advances in FoodResearch,28:1(1982))。因为单胃动物如猪和家禽以及人类在其胃肠道中几乎没有植酸酶活性，所以几乎所有摄食的植酸盐P都不能被消化。这就导致需要在这些动物的膳食中补充昂贵而不能再生的营养素无机P。更为不理想的是，通过这些动物的粪便排泄的未利用植酸盐-P导致P污染环境(Cromwell,G.L.等，“P-关键的必需营养素，也可能是主要污染源-其在动物营养中的重要作用”，Biotechnology In the Feed Industry；Proceedings Alltech 7th AnnualSymposium,第133页(1991))。而且，植酸盐与必需微量元素如锌螯合，并在主要摄食没有去除植酸盐的植物性食品的儿童中导致营养缺乏症如生长以及精神发育迟缓。

已经对两种得自黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135的植酸酶phyA和phyB进行克隆及测序(Ehrlich,K.C.等，“鉴定以及克隆黑曲霉(无花果曲霉)的第二植酸酶基因(phys)”,Biochem.Biophys.Res.Commun.,195:53-57(1993)；Piddington,C.S.等，“对编码黑曲霉泡盛曲霉变种(Aspergillus niger var.awamori)的植酸酶(phy)和最适pH2.5的酸性磷酸酶(aph)的基因的克隆和测序”，Gene,133:56-62(1993))。新近，从土曲霉和Myceliophthora thermophila(Mitchell等，“组氨酸酸性磷酸酶的植酸酶亚族：从真菌土曲霉和Myceliophthorathermophila分离两种新的植酸酶基因”，Microbiology 143:245-252(1997))、烟曲霉(Pasamontes等，“真菌烟曲霉的热稳定型植酸酶的基因克隆、纯化和特征鉴定”，Appl Environ Microbiol.,63:1696-1700(1997))、Emericella nidulans和Talaromyces thermophilus(Pasamontes等，“从Emericella nidulans和喜温真菌Talaromyces thermophilus克隆植酸酶”，Biochim.Biophys.Acta.,1353:217-223(1997))和玉米(Maugenest等，“克隆和特征鉴定编码玉米幼苗植酸酶的cDNA”，Biochem.J.,322:511-517,1997))分离获得新型植酸酶基因。

从肠杆菌4(Yoon等，“分离以及鉴定产植酸酶的细菌肠杆菌4和植酸酶的酶特性”，Enzyme and Microbial Technology 18:449-454(1996))、土生克雷伯氏菌(Greiner等，“纯化和特征鉴定土生克雷伯氏菌植酸酶”，Arch.Biochem.Biophys.341:201-206(1997))和芽孢杆菌DSll(Kim等，“芽孢杆菌DSll的热稳定型植酸酶的纯化和性质”，Emzyme and Microbial Technology 22:2-7(1998))已经分离和/或纯化各种植酸酶。已对这些酶的性质进行了研究。此外，已有关于无花果曲霉的phy A的晶体结构的报道(Kostrewa等，“无花果曲霉植酸酶在2.5A分辨率的晶体结构”，Nature Structure Biology 4:185-190(1997))。

Hartingsveldt等将PhyA基因导入黑曲霉中并获得高于野生型10倍的植酸酶活性。(“黑曲霉的植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定以及过量表达”，Gene 127:87-94(1993))。已经证实在猪和家禽的膳食中添加上述来源的微生物植酸酶可有效改善植酸盐-P和锌的利用(Simons等，“用微生物植酸酶提高小鸡和猪的磷生物利用度”，Br.J.Nutr.,64:525(1990)；Lei,X.G.等，“添加微生物植酸酶的玉米-大豆粉膳食线性提高断奶小猪的植酸盐P的利用”，J.Anim.Sci.,71:3359(1993)；Lei,X.G.等，“添加微生物植酸酶的玉米-大豆粉膳食使断奶小猪的植醇盐P的利用最大化”，J.Anim.Sci.,71:3368(1993)；Cromwell.G.L.等，“P-关键的必需营养素，也可能是主要污染源-其在动物营养中的重要作用”，Biotechnology In the Feed Industry；Proceedings Alltech 7th Annual Symposium，第133页(1991))。但是有限的市售植酸酶供给的昂贵费用以及该酶对饲料成粒加热的活性不稳定性阻止其在动物饲料工业中的实际应用(Jongbloed,A.W.等，“混合饲料的成粒对植酸酶活性以及磷和钙在猪中的表观吸收性的影响”，Animal Feed Science and Technology,28:233-242(1990))。而且，黑曲霉产生的植酸酶大概不是人类食品工业的最安全资源。

酵母可用来有效产生植酸酶，同时酵母在简便而便宜的培养基上就能够生长。具有合适信号序列的植酸酶可分泌入培养基中以便进行收集。某些酵母表达系统具有食品工业完全接受的其它优势，而且是食品的安全有效的生产菌。

巴斯德毕赤酵母(Picha pastoris)是甲基营养酵母，能够代谢为其唯一碳源的甲醇。该系统因为其能够表达高水平异源蛋白而众所周知。因为它是真核生物，所以巴斯德毕赤酵母具有许多高等真核生物表达系统的优势如蛋白加工、折叠和转录后修饰。

因此需要开发经济生产植酸酶的有效简便系统，以用于食品和饲料工业。

发明概述

本发明涉及通过以下步骤在酵母生产植酸酶的方法:将编码具有植酸酶/酸性磷酸酶活性的蛋白或多肽的异源基因导入酵母菌株中，并表达所述基因。

本发明还涉及在温度范围57-65℃、pH 2.5-3.5或pH 5.5时具有优化活性的植酸酶活性蛋白或多肽。最适pH 2.5-3.5对植酸酶特别重要，因为动物胃pH就是此pH范围。

本发明还提供带有异源基因的酵母细胞，所述基因编码植酸酶活性蛋白或多肽而且与能够在酵母表达植酸酶的启动子有效连接。

本发明的另一方面涉及含有以下组分的载体：编码植酸酶活性蛋白或多肽的非酵母生物体基因、与编码植酸酶活性肽的基因功能性相连的能够在酵母中启动转录的启动子和能够将所述载体维持在酵母中或能够整合入所述宿主基因组的复制起点。

本发明还提供生产具有植酸酶活性的蛋白或多肽的方法。在宿主细胞中表达编码植酸酶活性蛋白或多肽的分离的appA基因。

本发明还包括转化植酸盐为肌醇和无机磷酸盐的方法。appA基因在宿主细胞中表达具有植酸酶活性的蛋白或多肽。然后使所述蛋白或多肽与植酸盐接触，以催化植酸盐转换为肌醇和无机磷酸盐。

附图简述

图1显示由用IPTG诱导的植酸酶基因转化的大肠杆菌制得的可溶性蛋白的SDS-PAGE分析。将所述细胞培养4小时后进行收获。泳道1：标记；泳道2和3：pEP1的转化体(所表达的蛋白约55 kDa)；泳道4：单独用表达载体pET25b(+)的转化体。

图2显示在大肠杆菌中表达的植酸酶蛋白的蛋白质印迹分析。所述抗体针对黑曲霉的纯化的天然植酸酶产生。每个泳道含有50μg总胞内蛋白。泳道1和2：诱导后和诱导前的重组体。泳道3和4：诱导后和诱导前的对照(单独的表达载体)。

图3是大肠杆菌PhyA mRNA的RNA印迹分析的扫描图。采用1.4 kb PhyA探针。每个泳道含有20μg总RNA。泳道1和2：从诱导前和诱导后的对照细胞(单独的表达载体)分离的RNA。泳道3和4：从诱导前和诱导后的含有PhyA的重组体分离的RNA。

图4是诱导植酸酶(pEP1)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的时程。当OD₆₀₀达到0.5时对所述细胞进行诱导。用SDS-PAGE分析定量在每个时间点制备的可溶性蛋白。

图5显示所述植酸酶转化的S.Lividans生长72小时后表达的胞外植酸酶蛋白的SDS-PAGE分析。将细胞以8,000×g离心15分钟，并将所述上清液进行凝胶电泳。泳道1：标记；泳道2：只用表达载体的对照；泳道3：表达植酸酶的阳性菌落而且其分子量约为57 kDa。

图6显示用针对黑曲霉的纯化的天然植酸酶产生的植酸酶抗体，对S.Lividans表达的植酸酶的蛋白质印迹分析。各泳道上样20μg培养基(上清液)蛋白。泳道1：载体转化的对照细胞培养物的上清液；泳道2：用阳性菌落接种的培养物的上清液。

图7图示酿酒酵母表达的胞外植酸酶的SDS-PAGE分析。各泳道上样50μg培养基(上清液)蛋白。泳道1-3：分别为用在诱导后5、10和25小时收获的阳性菌落接种的培养物的上清液；泳道4-6：分别为在诱导后5、10和25小时收获的载体转化的对照细胞培养物的上清液；泳道7：标记(kDa)。所表达的植酸酶约110 kDa(用蛋白质印迹证实)。

图8是半乳糖诱导后由pYPP1构建物转化的酿酒酵母表达的胞外植酸酶活性的时程。分析所收集的培养基上清液的活性。

图9显示采用针对纯化的天然黑曲霉植酸酶产生的植酸酶抗体，对酿酒酵母表达的胞外植酸酶在去糖基化之前和之后(Endo H)的蛋白质印迹分析。泳道1：预染色的SDS-PAGE标准品(kDa)(Bio-Rad)；泳道2和3：分别为去糖基化的10和20μg植酸酶蛋白；泳道4：糖基化植酸酶(20μg蛋白)。

图10是分离自转化的酿酒酵母细胞的总RNA的RNA印迹分析扫描图。泳道1：对照(只用表达载体pYES2)；泳道2和3：pYPP1的转化体。

图11是诱导后巴斯德毕赤酵母转化体Mut^s(KM71)和Mut+(X33)产生的胞外PhyA植酸酶活性的时程。

图12图示用在KM71(MUTs)中的pPICZαA-PhyA构建物，对在毕赤酵母属中过量表达的植酸酶的SDS-PAGE分析。泳道1：蛋白梯。泳道2：40μl诱导后108小时收集的AK1(21,700 mU/ml胞外植酸酶的菌落)的上清液。泳道3：40μl以1g/L水平过量表达人血清白蛋白(HAS,6.7 kDa)的对照菌株上清液。泳道4：40μl KM71对照的上清液。

图13图示用Endo H去糖基化对在巴斯德毕赤酵母中表达的植酸酶的热稳定性的影响。将植酸酶在0.2 M柠檬酸缓冲液，pH 5.5中于37或80℃下加热15分钟后检测植酸酶活性。

图14是转化的巴斯德毕赤酵母菌株(KM71和X33)表达的PhyAmRNA的RNA印迹分析的扫描图。用1.3 kbPhyA探针进行印迹。泳道1和2：诱导之前和之后的KM71转化体；泳道3和4：诱导之后和之前的X33转化体。

图15显示巴斯德毕赤酵母(X33)表达的胞外植酸酶活性的最适pH。采用pH 1.5、2.5、3.5的0.2 M甘氨酸盐酸缓冲液；pH 4.5、5.5、6.5的0.2 M柠檬酸钠缓冲液和pH 7.5和8.5的0.2 M Tris-HCl缓冲液。

图16显示巴斯德毕赤酵母(X33)表达的胞外植酸酶的最适温度。在0.2 M柠檬酸缓冲液，pH 5.5中进行分析。

图17图示用巴斯德毕赤酵母(X33)表达的植酸酶从大豆释放游离磷。将5g大豆悬浮于25 ml含有不同量植酸酶的0.2 M柠檬酸，pH 5.5中。在37℃下温育4小时，并测定释放在上清液中的游离磷。

图18显示5个含有大肠杆菌appA基因的巴斯德毕赤酵母转化体表达胞外植酸酶活性的时程。

图19图示培养基pH和巴斯德毕赤酵母表达植酸酶活性之间的关系。

图20是在巴斯德毕赤酵母中过量表达的大肠杆菌植酸酶的SDS-PAGE分析。泳道1：蛋白梯；泳道2-4：诱导后118小时分别从阳性菌落23、22和11培养物收集的上清液。

图21图示巴斯德毕赤酵母过量表达大肠杆菌植酸酶的最适pH。

图22图示巴斯德毕赤酵母过量表达大肠杆菌植酸酶的最适温度。

图23图示用巴斯德毕赤酵母过量表达的大肠杆菌植酸酶处理4小时后从大豆粉释放的游离磷量。

发明详述

本发明提供在酵母中生产植酸酶的方法。按照该方法在酵母菌株表达编码具有植酸酶活性的蛋白或多肽的异源基因。

普遍将催化植酸盐转化为肌醇和无机磷的酶称为植酸酶。产生植酸酶的微生物包括细菌如枯草杆菌(Paver等，J.Bacteriol.151,1102(1982)，将其通过引用结合到本文中)和假单胞菌属(Cosgrove,Austral.J.Biol.Sci.23:1207(1970)，将其通过引用结合到本文中)；酵母如酿酒酵母(Nayini等，Lebensmittel Wissenschaft and Technologie 17:24(1984)，将其通过引用结合到本文中)；以及真菌，例如土曲霉(Yamada等，Agric.Biol.Chem.32:1275(1986)，将其通过引用结合到本文中)和无花果曲霉(van Gorcom等，欧洲专利申请89/202,436，将其通过引用结合到本文中)。

植酸酶也内源性存在于许多植物种中。Loewus，载于：PlantBiology第9卷：“植物肌醇代谢”(编辑D.J.Morre,W.F.Boss,F.A.Loewus)13(1990)；和Gellatly等，Plant Physiology(增刊)93:562(1990)，将其通过引用结合到本文中，他们述及得自马铃薯块茎的植酸酶cDNA克隆的分离和特征鉴定。Gibson等，J.Cell Biochem.,12C:L407(1988)和Christen等，J.Cell Biochem.,12C:L402(1988)，将其通过引用结合到本文中，述及在大豆种子萌芽期间内源性植酸酶的合成。

具有植酸酶活性的蛋白或多肽优选由所述细胞分泌入生长培养基中。这使得所述植酸酶产物表达水平更高并更容易分离。将具有植酸酶活性的蛋白或多肽偶联至能够引导所述蛋白泌出所述细胞的信号序列。最好从所述蛋白切除所述信号序列。

在一个优选实施方案中，按照读框剪接编码具有植酸酶活性的蛋白或多肽的异源基因和转录增强子元件。

从细菌细胞分离编码具有植酸酶活性的蛋白的优选异源基因。更优选的基因是黑曲霉的PhyA基因。已经克隆并测序黑曲霉NRRL3135的编码植酸酶的基因PhyA(Piddington,C.S.等，“植酸酶编码基因(phy)以及最适pH 2.5的黑曲霉泡盛曲霉变种酸性磷酸酶编码基因(aph)的克隆和测序”，Gene,133:56-62(1993)，将其通过引用结合到本文中)。Hartingsveldt等将phyA基因导入黑曲霉中并获得与野生型相比植酸酶活性增加10倍的结果。(Hartngsveldt等，“黑曲霉植酸酶编码基因(phyA)的克隆、特征鉴定以及过量表达”，Gene127:87-94(1993)，将其通过引用结合到本文中。)

另一个优选异源基因是大肠杆菌的appA基因。该基因原来称为大肠杆菌周质磷酸酐磷酸水解酶(appA)基因，它含有1,298个核苷酸(GeneBank收录号：M58708)。首次发现该基因在大肠杆菌中编码最适pH 2.5的酸性磷酸酶蛋白(EcAP)。该酸性磷酸酶是分子量为44,644道尔顿的单体。成熟EcAP含有410个氨基酸(Dassa,J.等，“大肠杆菌基因AppA的完全核苷酸序列表明pH 2.5酸性磷酸酶和葡萄糖-1-磷酸酶之间显著同源”，J.Bacteriology,172:5497-5500(1990)，将其通过引用结合到本文中)。Ostanin等采用pT7载体在大肠杆菌BL21中过量表达appA，使其酸性磷酸酶活性增加约400倍(440mU/mg蛋白)(Ostanin,K.等，“大肠杆菌酸性磷酸酶的过量表达、定点诱变和机制”，J.Biol.Chem.,267:22830-36(1992)，将其通过引用结合到本文中)。以前不知道appA基因产物具有植酸酶活性。

appA或PhyA基因能够在任何原核生物或真核生物表达系统中表达。可利用各种宿主-载体系统表达编码所述蛋白的序列。优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或寡核苷酸。主要是所述载体系统必须与所用的宿主细胞匹配。宿主-载体系统包括但是不限于以下系统：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物例如含有酵母载体的酵母；用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以及用细菌感染的植物细胞。这些载体的表达元件的强度和特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可采用许多合适转录和翻译元件中的任何一种。

用于表达appA或PhyA的优选宿主包括真菌细胞，所述真菌细胞包括各种酵母或丝状真菌，它们均可用作根据本发明的宿主细胞。优选的酵母宿主细胞包括不同菌株的酿酒酵母。也可以采用其它酵母如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。在一个优选实施方案中，用于过量表达所述蛋白的酵母菌株是酿酒酵母。优选的丝状真菌宿主细胞包括曲霉属和链孢菌属。曲霉属更优选的菌株是黑曲霉。

在本发明另一个优选的实施方案中，所述酵母菌株是甲基营养酵母菌株。甲基营养酵母是能够利用甲醇作为碳源以产生维持细胞功能必需的能源并含有表达醇氧化酶的基因的酵母属。典型的甲基营养酵母包括毕赤酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属和Karwinskia。这些酵母属能够把甲醇用作唯一碳源。在一个更优选的实施方案中，所述甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母。

本发明还提供具有植酸酶活性的蛋白或多肽。phyA在毕赤酵母属表达，所产生蛋白的胞外活性要高得多(～65 mU/ml)。所述植酸酶活性得率较在phyA转化的酿酒酵母中的活性得率高约30倍，较在野生型黑曲霉中的活性得率高21倍，较在未转化的毕赤酵母属中的活性得率高65,000倍。所表达的植酸酶的最适pH为2.5和5.5，而最适温度为60℃。同样，appA在毕赤酵母属和酿酒酵母中表达产生的蛋白的胞外活性高得多，其非常优选的最适pH为2.5-3.5。

本发明优选的实施方案是具有植酸酶活性、在57-65℃温度范围具有最佳植酸酶活性的蛋白或多肽。更优选的实施方案是具有植酸酶活性的蛋白或多肽，其最适活性温度范围为58-62℃。

再一优选实施方案是在80℃加热15分钟后保有其至少40％活性的植酸酶活性蛋白或多肽。更优选在60℃加热15分钟后保有其至少60％活性的植酸酶活性蛋白或多肽。

用几种方法可以获得纯化蛋白。优选用常规技术生产纯化形式(优选至少约80％纯度，更优选90％)的本发明蛋白或多肽。通常本发明蛋白或多肽分泌入重组宿主细胞的生长培养基中。或者产生本发明蛋白或多肽但是不分泌入生长培养基中。在此情况下为了分离所述蛋白，繁殖带有重组质粒的宿主细胞，通过超声处理、加热或化学处理使其裂解，离心匀浆以去除细胞碎片。然后使上清液进行序贯硫酸铵沉淀。然后将含有本发明多肽或蛋白的流分在适当大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中进行凝胶过滤，以分离所述蛋白。必要时，可用HPLC进一步纯化所述蛋白流分。

本发明还提供具有编码植酸酶活性蛋白或多肽的异源基因的酵母菌株。所述异源基因应功能性连接至能够在酵母表达植酸酶的启动子。

本发明再一方面是用于在酵母中表达植酸酶的载体。该载体带有得自非酵母生物的编码植酸酶活性蛋白或多肽的基因。所述植酸酶基因能够克隆入自主复制或整合入酵母基因组的任何载体中。自主复制质粒例如YEp质粒的拷贝数可以高，但是其有丝分裂稳定性不够(Bitter等，“酵母的表达及分泌载体”，Meth.Enzymol.153:516-44(1987)，将其通过引用结合到本文中)。它们可以含有负责自主复制的2 mu-质粒序列和负责在大肠杆菌中复制的大肠杆菌序列。所述载体优选含有用于选择酵母转化体的基因标记和用于在大肠杆菌中选择的抗生素抗性基因。含有ARS和CEN序列的附加型载体以每个细胞一个拷贝存在，而且它们比YEp载体更稳定。当DNA片段以一个拷贝或多个拷贝整合入酵母基因组中时使用整合型载体。在这种情况下，所述重组DNA是稳定的而且不需要选择(Struhl等，“酵母的高频率转化：杂合DNA分子的自主复制”，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 76:1035-39(1979)；Powels等，Cloning Vectors,Ⅰ-Ⅳ，以及下列等，Elsevier,(1985)；Sakai等，“用高级δ-整合系统增强酿酒酵母分泌人神经生长因子”，Biotechnology 9:1382-85(1991)，将其通过引用结合到本文中)。某些载体具有复制起点，它在选定的宿主细胞中发挥作用。合适的复制起点包括2μ、ARSl和25μM。所述载体具有用于插入融合基因和启动子序列的限制性内切核酸酶位点以及选择标记。通过去除或加入限制性位点或去除其它不需要的核苷酸可修饰所述载体。

可将所述植酸酶基因置于任何启动子的控制之下(Stetler等，“由酿酒酵母分泌活性全长和半长的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂”，Biotechnology.7:55-60,(1989)，将其通过引用结合到本文中)。人们可以选择组成型或调节型酵母启动子。用于酵母载体的合适启动子序列特别包括以下酶的启动子：金属硫蛋白、3-磷酸甘油激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255:2073(1980)，将其通过引用结合到本文中)或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)；和Holland等，Biochem.17:4900,(1978)，将其通过引用结合到本文中)，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。Hitzeman还在EP A-73,657中进一步描述了用于酵母表达的其它合适载体和启动子，将其通过引用，结合到本文中。另一种选择是Russell等，J.Biol.Chem、258:2674(1982)和Beier等，Nature 300:724(1982)(将它们通过引用结合到本文中)描述的葡萄糖阻抑型ADH2启动子。

人们能够选择组成型或调节型酵母启动子。例如磷酸甘油酸激酶(PGK)基因、其它编码糖酵解酶的基因和α因子基因的强启动子是组成型启动子。当使用组成型启动子时，在细胞生长期间合成所述产物。ADH2启动子的调节因子是乙醇和葡萄糖，GAL-1-10和GAL7启动子的调节因子为半乳糖和葡萄糖，PHO5启动子为磷酸，而金属硫蛋白启动子为铜。热激启动子由温度调节，HSPl50启动子属于热激启动子。也可使用杂合启动子。目的产物连续表达对宿主细胞有害时，使用调节型启动子。可采用强原核生物启动子如T7启动子代替酵母启动子，但是在这种情况下必须用编码相应的聚合酶的基因转化酵母菌株。关于转录的终止，使用HSP150终止子或任何其它功能性终止子。本文中将启动子和终止子称为控制元件。本发明不限于任何特定载体、启动子或终止子。

所述载体也可以载有选择标记。选择标记通常为抗生素抗性基因或能够互补具有充分特征鉴定的代谢缺陷的酵母菌株的基因，如色氨酸或组氨酸缺陷突变体。优选的选择标记包括URA3、LEU2、HIS3、TRP1、HIS4、ARG4或抗生素抗性基因。

所述载体也可以含有能够在细菌细胞中复制的复制起点。在细菌菌株中操作所述载体更有效。优选的细菌复制起点有ColE1、Ori或oriT。

得自所述酵母或植酸酶基因或其它来源的前导序列可用于支持表达的植酸酶分泌入培养基中。本发明不限于任何特定型前导序列或信号肽。

合适的前导序列包括酵母α因子前导序列，它可以用来引导所述植酸酶的分泌。α因子前导序列通常插入启动子序列和结构基因序列之间(Kurjan等，Cell 30:933,(1982)；Bitter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,(1984)；美国专利号4,546,082；和欧洲公开专利申请号324,274，将它们通过引用结合到本文中)。另一个合适的前导序列是酿酒酵母MFα1(α因子)前导序列，它以165个氨基酸的前原(prepro)形式合成，前原形式的α因子包含后接64个氨基酸的“前导肽”或前肽(propeptide)的19个氨基酸的信号肽或原肽(prepeptide)，拥有3个后接(LysArg(Asp/Glu,Ala)2-3 α因子)4的N-联糖基化位点(Kurjan等，Cell 30:933-43(1982)，将其通过引用结合到本文中)。已将前原MFαl的信号-前导部分广泛用于实现在酿酒酵母中合成并分泌异源蛋白。酵母同源信号/前导肽的用法由美国专利号4,546,082，欧洲专利申请号116,201、123,294、123,544、163,529和123,289以及DK专利申请号3614/83(将它们通过引用结合到本文中)可知。欧洲专利申请号123,289(将其通过引用结合到本文中)描述应用酿酒酵母α因子前体，而WO 82/01153(将其通过引用结合到本文中)指出采用酿酒酵母转化酶信号肽，德国专利申请DK 3614/83(将其通过引用结合到本文中)指出应用酿酒酵母PH05信号肽分泌外源蛋白。

酿酒酵母α因子信号-前导序列(MFα1或MFα2)也可以用于在酵母中表达的异源蛋白的分泌过程(美国专利4,546,082，欧洲专利申请号16,201、123,294、123,544和163,529，将其通过引用结合到本文中)。通过将编码酿酒酵母MFα1信号/前导序列融合在所述基因的5’端以分泌目的蛋白并加工目的蛋白，证实所述α因子信号-前导序列的作用。公开的PCT申请号WO 89/02463和WO 90/10075(通过引用结合到本文中)描述应用小鼠唾液腺淀粉酶信号肽(或其突变体)以实现分泌在酵母中表达的异源蛋白。

美国专利申请号5,726,038描述酵母天冬氨酸蛋白酶3的信号肽的应用，该信号肽能够提高酵母表达蛋白的分泌。其它促进重组多肽从酵母宿主分泌的合适前导序列是本领域技术人员已知的。在前导序列的3’末端附近可以对其进行修饰以含有一个或多个限制位点。这有助于前导序列与结构基因融合。

酵母转化方法是本领域技术人员已知的。Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929(1978)(通过引用结合到本文中)描述了一种这样的方法。Hinnen等的方法在选择培养基中选择Trp转化体，其中所述选择培养基包含0.67％酵母氮碱、0.5％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10μg/ml腺嘌呤和20μg/ml尿嘧啶。

所述基因可维持在为人工染色体的稳定表达载体上或整合入酵母宿主细胞染色体中进行维持。通过将所述植酸酶基因克隆入将重组入酵母染色体的载体中可实现整合入染色体中。合适载体可包括与酵母染色体核苷酸序列同源的核苷酸序列。或者所述植酸酶基因可位于重组位点如能够将所述基因载入染色体的转座因子之间。

本发明还提供通过以下步骤产生植酸酶的方法：提供编码植酸酶活性蛋白或多肽的分离的appA基因并在宿主细胞中表达所述基因。所述appA基因优选分离自大肠杆菌。优选的宿主细胞包括酵母或丝状真菌。优选的丝状真菌为黑曲霉，而优选的酵母为酵母属、克鲁维酵母属、有孢圆酵母属和裂殖酵母属，尤其是酵母菌株酿酒酵母。

还提供转化植酸盐成为肌醇和无机磷的方法。用本领域众所周知的技术从生物体分离appA基因。然后由宿主细胞中的所述基因表达植酸酶活性蛋白或多肽。将产生的蛋白或多肽与植酸盐混合或接触。该技术对于处理食品或动物饲料中的植酸盐特别有用。

优选的appA基因从大肠杆菌分离获得。

尽管在酵母系统中产生的植酸酶从玉米和大豆释放植酸盐-P与目前的市售植酸酶同样有效，但是其热稳定性更好。在酵母中的这种植酸酶过量表达系统可用于提供热稳定型植酸酶，以用于食品及饲料工业。

实施例实施例1-在大肠杆菌、S.Lividans和酵母属系统中过量表达PhyA

的材料和方法

植酸酶基因、宿主菌株和表达质粒植酸酶基因PhyA由USDA的E.J.Mullaney博士惠赠。该基因(GenBank收录号M94550)包含在大肠杆菌菌株HB101中的质粒pMD4.21中。2.7 kb黑曲霉DNA的SphⅠ片段含有去糖基化植酸酶的编码区及其5’和3’侧翼序列。含有出芽短梗霉(Aureobasidum pullulans)的活性木聚糖酶基因的信号肽序列Spxy(GenBank收录号U10298)的质粒由University of Georgia的X.L.Li博士惠赠。大肠杆菌菌株DH5α用作所有重组质粒的初始宿主。为了在大肠杆菌中表达PhyA，采用表达载体pET25b(+)(Novagen,Madison,WI)和表达宿主BL21(DE3)pLysS。为了在S.Lividans TK 24中表达PhyA，采用质粒pSES1(Jung,E.D.等，“褐色高温单孢菌外切葡聚糖酶基因和内切葡聚糖酶基因的DNA序列以及在Streptomyces Lividans中的表达”，Appl.Environ.Microbiol.,59:3032-43(1993)，将其通过引用结合到本文中)构建穿梭质粒(得自Cornell University的D.B.Wilson博士，而D.B.Wilson博士得自D.A.Hopwood博士(John Innes Institute,Norwich，英国))。为了在酵母中表达PhyA，使用表达载体pYES2和宿主酿酒酵母菌株INVScl(Invitrogen,San Diego,CA)。

质粒盒构建和转化所有构建的质粒和相应的宿主列于表1中。用以下两种引物由pMD4.21扩增1.4 kb的PhyA基因的PCR片段：上游的5’-CGG AAT TCG TCA CCT CCG GAC T-3’(SEQ ID No.1)和下游的5’-CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACA CTC-3’(SEQ IDNO.2)。获得的片段含有编码黑曲霉去糖基化植酸酶的序列PhyA以及分别的上游和下游EcoRⅠ和HindⅢ限制性位点。用Geneclean Ⅱ试剂盒(Bio 101,Inc.,La Jolla,CA)纯化后将所述片段插入pET25b(+)中，并于DH5α细胞中初步证实后将获得的构建物pEP1(6893 bp)转化入BL21(DE3)pLysS中。在后接编码21个氨基酸的前导序列(pel B)和PhyA的T7启动子控制之下表达。仅用pET25(+)载体转化的宿主用作对照。

表1．用于所述研究的表达载体、构建物和其宿主菌株

质粒宿主 说明¹参考文献²pET25b(+)大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)pLysS 表达载体NovagenpEP1大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET25bα(+)+PhyA基因本说明书PSES2大肠杆菌DH5α和S.Lividans TK24 表达载体Jung等²,1993PSPP1大肠杆菌DH5α和S.Lividans TK24 pSES2+Spe2+PhyA本说明书PYES2大肠杆菌DH5α和酿酒酵母INVScl 表达载体invitrogenPYEP1大肠杆菌DH5α和酿酒酵母INVScl pYES2+Spe2+PhyA本说明书PYXP1大肠杆菌DH5α和酿酒酵母INVScl pYES2+Spxy+PhyA本说明书PYPP1大肠杆菌DH5α和酿酒酵母INVScl pYES2+Sphy+PhyA本说明书

1 Spe2是褐色高温单孢菌的内切葡聚糖酶E2的信号肽(Wilson,D.B.,“放线菌纤维素酶的生物化学和遗传学“，Crit Rev.Biotechnol.,12:45-63(1992)，通过引用结合到本文中)；Spxy是出芽短梗霉的木聚糖酶的信号肽”，(Li和Ljungdahl，“真菌出芽短梗霉Y-2331-1的木聚糖酶基因的克隆、测序和调节”，Appl.Environ.Microbiol.,60:3160-66(1994)；Li和Ljungdahl，“酿酒酵母表达出芽短梗霉xynA以及分泌木聚糖酶“，Appl.Environ Microbiol.,62:209-13(1996)，通过引用结合到本文中)；Sphy是黑曲霉PhyA的信号肽(Hartingsveldt等，“黑曲霉植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和过量表达”，Gene 127:87-94(1993)，通过引用结合到本文中)。

2 Jung,E.D.等，“褐色高温单孢菌外切葡聚糖酶基因和内切葡聚糖酶基因的DNA序列以及在Streptomyces Lividans中的表达”，Appl.Environ.Microbiol.,59:3032-43(1993),通过引用结合到本文中)。

为了构建用于在S.Lividans中表达PhyA的质粒，首先用PCR合成含有pLT1启动子和Spe2信号肽的片段(Lao,G.等，“3种得自褐色高温单孢菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的DNA序列”，J.Bacteriol.,173:3397-407(1991)，通过引用结合到本文中)。上游引物5’-CAGCTA TGA CCA TGA TTA CGC C-3’(SEQ ID No.3)和下游引物5’-CCT AGA ACG GGA ATT CAT TGG CCG CC-3’(SEQ ID No.4)分别含有PstⅠ和EcoRⅠ限制位点。从pBW2扩增所述片段(Jung,E.D.等，“褐色高温单孢菌的外切葡聚糖酶基因和内切葡聚糖酶基因的DNA序列和在Streptomyces Lividans中的表达”，Appl.Environ.Microbiol.,59:3032-43(1993)，通过引用结合到本文中)，然后将其用PstⅠ和EcoRⅠ消化，同时分别用EcoRⅠ和HindⅢ以及PstⅠ和HindⅢ消化构建物pEP1和质粒pBluescript SK⁺(Strategene,La Jolla,CA)。然后用GenecleanⅡ试剂盒纯化3种所消化的片段，并将其连接入单一重组构建物中，所述重组构建物含有：所需要的PstⅠ和KpnⅠ限制位点(pBluescript SK^*)、pLT1启动子和内切葡聚糖酶E2的Spe2前导肽(551bp,Lao,G.等，“3种得自褐色高温单孢菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的DNA序列”，J.Bacteriol.,173:3397-407(1991)，通过引用结合到本文中)和PhyA基因(1365 bp)。用PstⅠ和KpnⅠ消化所述构建物后，将获得的片段插入表达载体pSES1中，而且按照Hopwood等的方法(Hopwood,D.A.等，Genetic Manipulation of Streptomyces-A LaboratoryManual,The John Innes Foundation,Norwich，英国(1985)，通过引用结合到本文中)将所形成的穿梭质粒(pSPP1,9131 bp)转化入宿主S.Lividans原生质体。同样，通过用表达载体pSES2转化S.Lividans制备对照。

构建含有3种不同信号肽序列的3种穿梭质粒以在酵母系统表达PhyA(见表2)。第一种质粒源自pSPp1的HindⅢ消化片段，包含启动子pLT1、前导序列Spe2和PhyA编码区序列。确证其正确方向后将所述片段连接入用小牛肠碱性磷酸酶处理的pYES2的HindⅢ位点中，并将该质粒命名为pYEP1(7783 bp)。第二种质粒包含出芽短梗霉木聚糖酶基因的信号肽序列Spxy(Li,X.L.等，“真菌出芽短梗霉Y-2311-1木聚糖酶基因的克隆、测序和调节”，Appl Environ.Microbiol.,60:3160-166(1994)；Li.X.L.等，“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ.MicrobioL.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)和PhyA基因。用两个连续的PCR步骤通过重叠延伸(Horton,RM.,“DAN的体外重组和诱变：SOEing Together Tailor-Made Genes”,PCR Protocols:Current Methodsand Applications,251-61(1993)，通过引用结合到本文中)剪接Spxy和PhyA。一个PCR是用具有HindⅢ限制性位点的上游引物(5’-CCCAAG CTT GAT CAC ATC CAT TCA-3’)(SEQ ID No.5)(引物1)和重叠的下游引物(5’-CGG GGA CTG CTA GCG CAC GTT CGA T-3’，引物2)(SEQ ID No.6)从pCE4(Li,X.L.等，“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ.Microbio1.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)扩增Spxy序列。另一个PCR是采用重叠的上游引物(5’-ATC GAA CGT GCG CTA GCA GCAGTC CCC G-3’，引物3)(SEQ ID No.7)和具有XbaⅠ限制位点的下游引物(5’-GCT CTA GAC TAA GCA AAA CAC TCC-3’，引物4)(SEQ IDNo.8)从pEP1扩增PhyA的编码区。通过用上述两个纯化的片段作模板以及引物1和引物4进行第二个PCR步骤以连接上述两个PCR产生的两个片段。所产生的片段含有HindⅢ和XbaⅠ限制位点，并将其克隆入pSES2中。该质粒命名为pYXP1(7219 bp)。第三种质粒含有PhyA的信号肽(Sphy)序列和PhyA的编码区，不含其间的内含子(Hartingsveldt,W.van.等，“黑曲霉植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和过量表达”，Gene 127:87-94(1993)，通过引用结合到本文中)。采用两种引物(包括含有所述信号肽和工程KpnⅠ限制位点的70 bp的上游引物和用于pYXP1构建的相同下游引物(引物4)从pEP1扩增所需要的片段。用KpnⅠ和XbaⅠ消化所述PCR产物，并将其克隆入pSES2中，获得称为pYPP1(7176 bp)的质粒。用Ito等的方法(碱阳离子处理的完整酵母细胞的转化”，J.Bacteriol.,153:163-68(1983)，通过引用结合到本文中)将上述全部三种构建物转化入酿酒酵母中。

 表2．用于在酿酒酵母中表达PhyA的信号肽

构建物大小(bp)    肽     基因生物植酸酶活性¹(mPU/ml) pYEP1 7783pYXP1 7219pYPP1 7176pSES1²7224    Spe2(93 bp)Spx(102 bp)Sphy(57 bp)    纤维素酶E2木聚糖酶APhyA植酸酶    褐色高温单孢菌出芽短梗霉黑曲霉酿酒酵母    80检测不到146检测不到

1加入半乳糖诱导后15小时检测Sabouraud棉子糖培养基细胞培养物上清液中的植酸酶活性。参见文中的植酸酶单位定义。

2用作对照的酿酒酵母表达载体。

生长培养基以及诱导基因表达在大肠杆菌系统中，将所述转化体在50 ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于30℃进行培养。在培养物的OD₆₀₀值达到0.5-0.6后，在培养基中加入IPTG(异丙基b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1 mM诱导植酸酶基因表达。诱导后3小时，以8000×g离心15分钟收集细胞，用1×PBS洗涤并用溶菌酶溶解。制备所述细胞的可溶性和不溶性部分，并将含有500μg总蛋白的样品(Lowry,O.H.等，“用Folin酚试剂检测蛋白”，J.Biol.Chem.,193:265-75(1951)，通过引用结合到本文中)悬浮在相同体积的2×SDS缓冲液中，用SDS-PAGE进行分析(Laemmli,U.K.,“在嗜菌体T4头装配期间的结构蛋白的切割”，Nature(伦敦)，227:680-85(1970)，将其通过引用结合到本文中)。

于30℃在含有5μg/ml硫链丝菌肽的TSB肉汤中培养重组S.Lividans (Jung.E.D.等，“褐色高温单孢菌的外切葡聚糖酶基因和内切葡聚糖酶基因的DNA序列以及在Streptomyces Lividans中的表达”，Appl.Environ Microbiol.,59:3032-43(1993)，将其通过引用结合到本文中)。培养72小时后，收获并制备细胞和培养基用于SDS-PAGE(Wilson,D.B.,“放线菌纤维素酶的生物化学和遗传学”，Crit.Rev.Biotechnol.,12:45-63(1992)，通过引用结合到本文中)。

最初将酿酒酵母转化体在不含尿嘧啶的Sabouraud棉子糖(4％)培养基(100 ml)中培养48小时，然后在培养基(2％)中加入无菌半乳糖以诱导植酸酶表达。在不同时间点收集培养基和细胞样品，并按Li和Ljungdahl等所述(“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ.Microbiol.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)制备细胞外以及细胞内样品。需要时，用YM10膜(截留分子量10,000)以Amicon的Stirred Cell(Beverly,MA)浓缩所表达的细胞培养物流分的上清液。照此测试其它培养基。

酶蛋白和活性测定用IS-1000数字成象系统(Alpha InnotechCorporation,San Leandro,CA)经测定SDS-PAGE的特定条带的相对光密度定量各种条件下植酸酶蛋白表达量。如上所述(Piddington,C.S.等，“编码黑曲霉泡盛曲霉变种植酸酶的基因(phy)以及最适pH 2.5的酸性磷酸酶的基因(aph)的克隆和测序”，Gene,133:56-62(1993),将其通过引用结合到本文中)测定培养基和细胞样品中的植酸酶活性，以及用Chen,P.S.等的方法(“磷的微量测定”，Anal.Chem.,28:1756-58(1956)，将其通过引用结合到本文中)分析所释放的无机磷酸。1个植酸酶单位(PU)定义为在37℃下每分钟由植酸钠释放1μmol无机磷酸的酶量。

蛋白质印迹(免疫印迹)分析收集植酸酶转化的大肠杆菌细胞团块的可溶性部分以及S.Lividans和酿酒酵母转化体培养基上清液用于SDS-PAGE。电泳后用Mini Trans-Blot小室(Bio-Rad Laboralories)将蛋白质转移到在20 mM Tris-HCl(pH 8.3)、20％甲醇和0.1％SDS中的Protran硝酸纤维素膜(Schleicher Schuell,Keene,NH,USA)上。以恒定的50 V转移过夜，而且初始缓冲液温度为4℃。然后使膜进行蛋白质印迹分析。抗纯化的天然黑曲霉植酸酶的兔多克隆IgG(由USDA的A.H.J.Ullah博士惠赠，稀释度5,000倍)用作第一抗体。用含有缀合辣根过氧化物酶的第二抗体的免疫印迹分析试剂盒(Bio-RadLaboratories)最后印迹。

总RNA的分离和分析诱导后3和15小时用TRIzol^TM试剂(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)分别从大肠杆菌和酿酒酵母的转化体分离总RNA。然后通过甲酰胺琼脂糖(1.5％，重量/体积)凝胶电泳分离RNA样品(10μg/泳道)并将其转移至Hyblot膜(National Labnet,Woodbridge,NJ)(Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，第二版，Appleton and Lange,Norwalle,Ct.(1994)，将其通过引用结合到本文中)上。制备在质粒pEPl中的1.4 kb EcoRⅠ-HindⅢ片段，采用DNA标记试剂盒以32p对其随机触发标记，然后通过G-50柱(Pharmacia Biotech.,Piscataway,NJ)纯化，再后在杂交烘箱(Hybaid,Middlesex,UK)中与印迹RNA的膜杂交。使所述杂交膜显象在FujiImaging Plate的屏上，并用生物图象分析仪(Kohshin Graphic Systems,Fuji，日本)分析。实施例2-在大肠杆菌中表达PhyA

诱导后4小时，与仅用表达载体转化的对照相比，所述可溶性细胞部分的SDS-PAGE(12.5％)显示一个特定的条带(～55 kDa)(参见图1和2)。该条带占该部分总的可溶性蛋白的3.8％。相应地，RNA印迹分析显示PhyAmRNA在这些植酸酶基因转化体中的过量表达，而在所述对照细胞中未观察到相应的结果(参见图3)。

为了优化植酸酶蛋白的表达，研究所述时程以及一系列因素对表达的影响。这些因素包括培养温度(30和37℃)、培养基pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)、厌氧生活(在培养细胞上部加入无菌的矿物油)、培养基中的无机磷酸水平(Dassa,E.等，“最适pH 2.5的大肠杆菌酸性磷酸酶”，J.Bio.Chem.,257:6669-76(1982)，将其通过引用结合到本文中)，以及植酸钠(0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mM)。结果表明在诱导后最初6小时植酸酶蛋白的表达随时间呈线性累积(参见图4)。此后虽然细菌细胞持续生长但是所述表达保持相对恒定。只有培养基pH和植酸钠浓度明显影响植酸酶蛋白的表达。在pH 6.0和0.3 mM植酸钠时获得最大蛋白量，其中植酸酶蛋白从总的可溶性蛋白的3.8％增加到9.6％。

细胞外以及细胞内没有检测到植酸酶活性。这不是完全意外的，因为黑曲霉天然植酸酶是70-80 kDa大小的糖蛋白(Hartingsveldt等，“黑曲霉的植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和过量表达”，Gene 127:87-94(1993)，将其通过引用结合到本文中)。在本研究的大肠杆菌系统中表达的蛋白大小约为55 kDa。据推测，缺乏蛋白的糖基化以及在分泌期间的其它必要的翻译后修饰妨碍植酸酶活性。实施例3-在S.Lividans中表达PhyA

已在S.Lividans中表达异源基因，而且分泌入培养基中的产物具有酶活性(Ghangas,G.S.等，“在Streptomyces Lividans中的褐色高温单孢菌内切葡聚糖酶E2基因的克隆：亲和纯化和克隆的基因产物的功能域”，Appl Environ.Microbiol.,54:2521-26(1988)；Wilson,D.B.,“放线菌纤维素酶的生物化学和遗传学”，Crit.Rev.Biotechnol.,12:45-63(1992)；Jung,E.D.等，“褐色高温单孢菌外切葡聚糖酶基因和内切葡聚糖酶基因的DNA序列以及在Streptomyces Lividans中的表达”，Environ.Microbiol.,59:3032-43(1993)，将其通过引用结合到本文中)。同样，在S.Lividans中表达PhyA基因并将所述蛋白分泌入培养基中，如SDS-PAGE分析培养基样品的特定条带所示(参见图5和6)。这说明褐色高温单孢菌内切葡聚糖酶E2基因的信号肽能够引导植酸酶蛋白分泌出细胞。此蛋白为57 kDa，占培养基总蛋白的16.2％。将培养基pH变为6.0并在培养基中加入0.3 mM植酸钠使蛋白产率提高至总蛋白的20.3％。因为植酸酶蛋白以如此高的水平分泌入培养基中，所以容易纯化以及有效用于各种目的如生产植酸酶抗体。再次没有发现培养基或裂解细胞中的植酸酶活性增高。尽管与在大肠杆菌中表达的蛋白相比，据推测因为在此表达系统中植酸酶蛋白的糖基化，蛋白质的大小略有增加(2-3％)，但是仍然不具有植酸酶活性。实施例4-在酿酒酵母中表达PhyA

应用3种不同信号肽比较引导表达蛋白泌出细胞的效率(参见表2)。培养pYEP1和pYPP1而不是pYXP1转化体的Sabouraud棉子糖培养基中的植酸酶活性显著升高。诱导后20小时用SDS-PAGE可见植酸酶蛋白(图7)。

测定pYEP1和pYPP1转化体在以下3种不同培养基中的表达：Sabouraud棉子糖(Li,X.L.等，“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ.Microbiol.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)、Sabouraud甘油和改良型通用YEPD培养基。至于pYEP1转化体，在Sabouraud棉子糖和Sabouraud培养基中表达相似的植酸酶活性，而在YEPD培养基中没有检测到活性。相反，培养pYPP1转化体的培养基植酸酶活性随3种不同类型培养基而显著不同。应用Sabouraud甘油培养基时活性增加至375 mU/ml。当培养基变换为YEPD时活性进一步增加至1675 mU/ml(参见表3)。尽管YEPD培养基比Sabouraud棉子糖培养基便宜得多，但是植酸酶产率增加10倍以上。因此，真菌植酸酶基因的推定信号肽实现了最有效的胞外植酸酶活性表达。几乎产生的所有蛋白均分泌入YEPD培养基中，因为在酵母细胞中几乎检测不到活性。在该系统中植酸酶表达的时程见图8。

 表3．pYPP1转化体在不同培养基中表达的植酸酶活性

      诱导后小时(mPU/ml)¹

培养基    0    10    15Sabouraud棉子糖Sabouraud甘油YEPD    22618    1361741238    1463751675¹加入半乳糖诱导后0、10和15小时检测3种培养基细胞培养物上清液中的植酸酶活性。参见文中关于植酸酶单位的定义。

包括细菌、酵母和丝状真菌的各种微生物具有植酸酶活性，但是黑曲霉NRRL3135菌株产生的植酸酶活性最高(340 mU/ml,Shieh,T.R.等，“测量微生物产生的胞外植酸酶”，Appl.Environ.Microbiol.,16:1348-51(1968)，将其通过引用结合到本文中)。在21个酵母菌株中卡斯许旺酵母(Schwanniomyces castellii)CBS 2863具有最高的植酸酶活性(140 mU/ml,Lambrechts,C.等，“某些酵母对植酸盐的利用”，Biotechnology Letter,14:61-6(1992)，将其通过引用结合到本文中)。显然，在本研究中用pYPPl转化的重组酵母菌株产生的植酸酶活性(1675 mU/ml)较黑曲霉(4倍)和卡斯许旺酵母CBS 2863(11倍)高得多。通过优化培养条件和改良质粒盒在所述系统中能够获得最大的植酸酶产量(Demolder,J.W.等，“酿酒酵母有效合成分泌型小鼠白介素2:3’-非翻译区和密码子选择的影响”，Gene,111:207-13(1992)，将其通过引用结合到本文中)。

在酿酒酵母中高水平表达植酸酶活性最可能的原因是酵母产生足够的植酸酶蛋白的糖基化以及其它翻译后修饰。浓缩培养基上清液并使其进行SDS-PAGE分析后，存在约110 kDa的电泳带(参见图7和9)，比黑曲霉的天然蛋白大(Hartingsveldt,W.van.等，“黑曲霉植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和过量表达”，Gene 127:87-94(1993)，将其通过引用结合到本文中)。RNA分析证实phyAmRNA的特有过量表达(参见图10)。这些结果表明所述酵母系统有效地过量表达胞外活性植酸酶。与细菌或其它系统如黑曲霉相比，酵母系统具有数个优势(Hartingsveldt,W.van.等，“黑曲霉植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和过量表达”，Gene 127:87-94(1993)，将其通过引用结合到本文中)。它在翻译蛋白期间通过内质网和细胞膜进行翻译后修饰，包括适当的折叠、糖基化、形成二硫键和蛋白质水解。在蛋白前体的N末端区的疏水性短信号肽有利于分泌蛋白(Li,X.L.等，“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ Microbiol.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)。酵母细胞分泌的蛋白受到保护，不会发生蛋白聚集和被蛋白酶降解。最重要的是，酿酒酵母产生的酶蛋白容易纯化，因为它只分泌几种蛋白质。鉴于酵母制品对人类和动物的安全性是众所周知的，所以该系统对于人类食品和动物饲料工业具有极大的潜力。实施例5-在酿酒酵母中过量表达的PhyA植酸酶的特性

浓缩由pYPP1质粒转化体过量表达的植酸酶用于研究其特性(参见表4)。该酶显示两个最适pH范围：2-2.5和5.0-5.5。但是，在pH 2-2.5的酶活性仅为pH 5-5.5的活性的60％。在pH 1或8时均没有检测到活性。其最适pH实际上与黑曲霉植酸酶相同(Simons等，“用微生物植酸酶改善小鸡和猪的磷生物利用度”，Br.J.Nutr.,64:525(1990)，将其通过引用结合到本文中)，所以肯定可以预测其在胃肠道水解植酸盐-P的活性功能。其最适温度为60℃，而目前Gist-Brocades生产的市售植酸酶最适温度为55℃(BASF,1996)。在50-55℃时其活性仍然保持在80％以上，但是在75或80℃几乎检测不到活性。在37和80℃下加热该酶15分钟，本发明所表达的酵母植酸酶活性分别保持100％和63％，而BASF Gist-Brocades植酸酶的活性分别为100％和52％。所述两种酶来源在任何特定温度下的差异均是显著的(参见表5)。因此，看来所述酵母植酸酶的热稳定性比目前市售植酸酶产品高。

           表4．在酵母中过量表达的植酸酶的特征1最适pH²pH         1.0     2.0    2.5    3.0    4.0     5.0     5.5      6.0     8.0相对活     .5^e   59.7^c 64.8^c 48.1^d 81.0^b 100.0^a 95.0^a   66.3^c .8^e性(％)     ±.2   ±3    ±6     ±4    ±5     ±1     ±6      ±1     ±.4最适温度3℃         25      37     45     50     55      60       75      80相对活     24.2^e 44.6^d 63.9^c 83.6^b 89.8^b 100.0^a .6^f    .9^f生(％)     ±.8   ±3    ±8     ±2    ±4     ±4      ±.1    ±.2

1数值=相对活性均数±标准差(n=4)。注有不同上标字母的行的均数不同(P＜0.05)。统计学分析系统的一般线性模式(1988)用于分析随机完全设计的主要处理效应，而Bonferronit检验用于多项处理均数的比较。显著水平设定为P＜0.05。

2分析37℃的活性(参见文中关于植酸酶单位的定义)。采用以下不同的缓冲液：0.2 mM甘氨酸盐酸缓冲液，pH 1.0-3.5；0.2 mM柠檬酸钠缓冲液，pH4.0-6.5；以及0.2 mM Tris-HCl缓冲液，pH＞7。

3测定pH 5.5时的最适温度(0.2 mM柠檬酸钠缓冲液)。表5．比较在酵母中过量表达的植酸酶和Gist-Brocades的黑曲霉产生

                  的植酸酶的热稳定性^1,2

相对活性，％    37℃    80℃酵母植酸酶黑曲霉植酸酶P³＜    100^a±1100^x±3    63^b±152^y±20.03

1数值=相对活性均数±标准差(n=3)。注有不同上标字母的行的均数不同(P＜0.05)。统计学分析系统的一般线性模式(1988)用于分析随机完全设计的主要处理效应，而Bonferroni t检验用于多项处理均数的比较。显著水平设定为P＜0.05。

2在37℃和pH 5.5下反应之前在不同温度下将酶加热15分钟。

3两种植酸酶在每一设定温度下的活性的t检验显著性(P值)。

尽管仍然不清楚上述热稳定性的提高与不同翻译后修饰(折叠、切割、糖基化等)的关系(Li,X.L.等，“酿酒酵母表达出芽短梗霉XynA以及分泌木聚糖酶”，Appl.Environ.Microbiol.,62:209-13(1996)，将其通过引用结合到本文中)，但是肯定的优势是获得了热稳定性更高的植酸酶，希望它能够抵抗饲料制粒期间的加热，而这是目前的Gist-Brocades植酸酶存在的问题。实施例6-用酵母表达的植酸酶体外水解玉米、大豆和粗小麦粉的植

酸盐-P

根据每单位活性，酵母表达的植酸酶从玉米和大豆粉释放植酸盐-P的效率与Gist-Brocades植酸酶相同(参见表6)。正如所预料，植酸盐-P的水解作用是时间与活性剂量的函数。酵母表达的植酸酶也有效地从粗小麦粉释放植酸盐-P，说明它具有面包发酵的巨大潜力。因为用于本研究的粗小麦粉含有的固有植酸酶活性比常用的小麦粉高得多，所以当酵母表达的植酸酶用于焙烤时，预期它对提高小麦粉植酸盐-P水解以及微量元素的释放的作用将高得多(Hall,M.N.等，“酵母遗传学的早期时代”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1993)，将其通过引用结合到本文中)。表6．用酵母过量表达的植酸酶和真菌黑曲霉植酸酶从玉米、大豆粉

(SBM)和粗小麦粉体外释放的游离磷

酵母植酸酶(PU/kg)0 100 250                   500 1000 250(真菌植酸酶)玉米：1小时4小时SBM:1小时4小时粗小麦粉：1小时4小时.23^d±.03.36^c±.02.68^d±.01.73^d3.56±.395.63±.5 .64^c±.081.26^b±.041.18c^d±.021.67^c    游离磷(mg/g) 1.54^a±.041.72^a±.043.13^a±.193.71^a 1.16^b±.051.68^a±.041.68^c±.22.78^b 1.14^b±.181.60^a±.031.62^c±.182.69^b4 11±.646.02±48 1.46^a±.041.66^a±.062.48^b±.323.41^a4.67²±.056.38²±.07

¹将5g各样品在20ml 0.2mM柠檬酸钠缓冲液中于37℃搅拌1或4小时。以8000g离心15分钟获得上清液。使其通过Whatman 541滤纸后，用Chen,P.S.等的方法(“磷的微量测定”，Anal Chem.,28:1756-58(1956)，将其通过引用结合到本文中)对所述样品进行游离磷分析。表中数值=相对活性均数±标准差(n=4)。统计学分析系统的一般线性模式(1988)用于分析随机完全设计的主要处理效应，而Bonferroni t检验用于多项处理均数的比较。显著水平设定为P＜0.05。t检验分析显示在每个酶剂量下各饲料的1小时和4小时之间存在显著性差异。注有不同上标字母的行的均数不同(P＜0.05)。

²n=2

对黑曲霉植酸酶(PhyA)在大肠杆菌、Streptomyces Lividans.和酿酒酵母中的过量表达进行比较以开发生产植酸酶的经济、有效、简便系统。采用pET25b(+)系统在大肠杆菌中表达的55 kDa可溶性胞内蛋白占总的可溶性蛋白的9.6％。采用含有pLT1启动子和内切葡聚糖酶E2的SpeⅡ前导肽的穿梭质粒在S.Lividans中表达的57 kDa胞外蛋白占培养基总蛋白的20.3％。但是上述两种表达系统中任何一种系统的植酸酶活性均没有增加，推测其原因是缺乏糖基化和其它必要的翻译后修饰。相反，PhyA基因转化的酿酒酵母产生高胞外植酸酶活性。比较3种不同信号肽和3种不同类型的培养基以鉴定最佳的表达载体和条件。使用PhyA基因的信号肽Sphy和YEPD培养基产生最高的胞外植酸酶活性。在酵母中过量表达的植酸酶约110kDa，具有两个最适pH范围：2.0-2.5和5.5-6.0，而最适温度为60℃。实施例7-在毕赤酵母属中表达PhyA的方法和材料

宿主和载体EasySelect^TM毕赤酵母属表达试剂盒购自Invitrogen(San Diego,CA)。该试剂盒提供宿主和载体以在菌株Mut⁺或Mut^s(甲醇利用正常或低)中胞内性或胞外性表达所述基因。X33用作Mut⁺菌株而KM71用作Mut^s菌株。使用两种载体pPICZ B(3.3 kb)和pPICZαA(3.6kb)，两者均用AOX1作启动子。

构建表达载体为了比较不同信号肽对PhyA在毕赤酵母属系统中表达的影响，制备两种构建物。首先将含有编码成熟植酸酶蛋白的PhyA序列的1.4kb EcoRⅠ-KpnⅠ片段连接入pPICZαA中。在该质粒(pPICZα-PhyA)中，α因子引导PhyA，它是非常普遍使用的酿酒酵母信号肽。其次，将pYPP1的1.4kb KpnⅠ-XbaⅠ片段连接入所述载体(PhyA编码区由其自身信号肽引导，这对于分泌在酿酒酵母中表达的植酸酶非常有效)中。

转化和表达用PmeⅠ线性化确证了的构建物，并通过所述试剂盒提供的EasyComp^TM将其转化入GS115和KM71中。Neocin^TM用来选择阳性菌落。将单个菌落接种入10ml MGY培养基中并在30℃下培养至OD₆₀₀为2-6后，离心收集细胞并将其重悬浮于10ml MMY培养基(含有0.5％甲醇)中。诱导后每隔12或24小时收集样品。分离细胞与上清液，用玻璃珠在破碎缓冲液中裂解细胞。如上所述分析上清液和细胞中的植酸酶活性。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析以确定表达蛋白的大小和相对量。实施例8-在毕赤酵母属中PhyA植酸酶活性

将用α因子作PhyA的信号肽的表达构建物转化入两个毕赤酵母属菌株中。KM71是甲醇利用低的菌株，而X33是有效利用甲醇的毕赤酵母属野生型菌株。于29-30℃下在10ml摇瓶中进行筛选和培养。关于KM71转化体，从20个菌落中挑出19个在诱导24小时后培养物上清液中胞外植酸酶活性高于6单位/ml的菌落。培养108小时后13号菌落显示最高活性为26单位/ml。关于X33转化体，诱导24小时后所有菌落(20/20)显示植酸酶活性均高于10单位/ml。其中一个菌落(101号)产生的上清液植酸酶活性为65单位/ml。在KM71和X33中植酸酶表达的时程研究总结于图11中。尽管这两种菌株在利用甲醇上存在差异，因此表达植酸酶的能力不同，但是发现酵母细胞正确加工α因子。除此之外，几乎所有表达蛋白分泌入培养基中，因为胞内获得活性小于所表达的总活性的5％。

用X33的PhyA重组体(101号)在培养基(BMGY和BMMY)中研究无机磷和培养基pH对植酸酶表达的影响。含有50mM磷酸盐的培养基在诱导后168小时时产生最高植酸酶活性66单位/ml。在包含50mM磷酸盐的培养基中还研究了该缓冲液不同pH(3、4、5、6、7和8)对表达的影响。当pH为6时，该X33转化体产生75单位植酸酶/ml上清液。根据蛋白浓度和SDS-PAGE分析，估测表达植酸酶蛋白的产率为3-4mg/ml。实施例9-在毕赤酵母属中表达的PhyA植酸酶的特性

表达的植酸酶的分子大小和去糖基化在对用PhyA转化体接种的培养基上清液进行SDS-PAGE后，显现约95kDa的强带(图12)。这几乎是在该上清液中唯一可见的蛋白。表达的植酸酶与针对纯化的天然黑曲霉植酸酶产生的兔多克隆抗体有效反应。这说明表达的植酸酶的免疫反应性基本上与黑曲霉天然植酸酶相同。其大小因为用Endo H去糖基化减小为50kDa。PhyA抗体也与去糖基化植酸酶反应。此外，在天然条件下进行去糖基化使植酸酶活性降低约15％，说明去糖基化对植酸酶活性是重要的。而且，去糖基化影响酶的热稳定性(图13)。

RNA印迹分析如图14所示，1.3kb PhyA DNA探针与KM71(13号)和X33(101号)二者的诱导转化体的mRNA杂交。诱导前也可见所述转化体的反应。PhyA在该系统中的表达在转录水平可能不受严格控制。

最适pH和温度以及植酸盐的磷水解类似于黑曲霉植酸酶，表达的植酸酶具有两个最适pH，即2.5和5.5(图15)。表达植酸酶的最适温度为60℃(图16)。当表达的植酸酶与大豆样品以100、200、400、800mU/g样品在37℃下培养时，释放的磷与植酸酶剂量呈线性方式(图17)。实施例10-大肠杆菌appA基因在酿酒酵母中过量表达的方法和材料

基因和蛋白该基因原来称为大肠杆菌周质磷酸酐磷酸水解酶(appA)基因，它含有1,298个核苷酸(GeneBank收录号：M58708)。首次发现该基因在大肠杆菌中编码最适pH2.5的酸性磷酸酶蛋白(EcAP)。该酸性磷酸酶是分子量为44,644道尔顿的单体。成熟EcAP含有410个氨基酸(Dassa，J.等，“大肠杆菌基因appA的完全核苷酸序列表明pH 2.5酸性磷酸酶和葡萄糖-1-磷酸酶之间显著同源”，J.Bacteriology,172:5497-5500(1990)，将其通过引用结合到本文中)。Ostanin,K.等采用pT7载体在大肠杆菌BL21中过量表达appA，使其酸性磷酸酶活性增加约400倍(440 mU/mg蛋白)(Ostanin,K.等，“大肠杆菌酸性磷酸酶的过量表达、定点诱变和机制”，J.Biol.Chem.,267:22830-36(1992)，将其通过引用结合到本文中)。

所述基因和宿主大肠杆菌菌株CU 1869(第47092号)购自ATCC。所述基因为1.3kb的插入片段，用表达载体pAPPAl将其转化入大肠杆菌菌株BL21(第87441号)(Ostanin,K.等，“大肠杆菌酸性磷酸酶的过量表达、定点诱变和机制”，J.Biol.Chem,267:22830-36(1992)，将其通过引用结合到本文中)。

宿主和载体用于在酿酒酵母中过量表达appA基因的载体是pYES2，而宿主为INVScⅠ(Invitrogen,San Diego,CA)。

表达载体的构建最初从pAPPA1分离1.3kb XbaⅠ片段。该片段含有appA基因和其自身信号肽。连接入pYES2的XbaⅠ位点后，将所述构建物(PYES2-appA)转化入酿酒酵母中。但是与对照相比，胞外或胞内部分中的植酸酶活性均未增加。将pAPPA1和pYPP1(在pYES2中的PhyA和其信号肽)共转化入所述酵母菌株中。再一次在培养基或酵母细胞中没有检测到pAPPA1引起的植酸酶活性增加。

合成两种引物以构建具有appA基因编码区的PhyA基因信号肽。一种引物为80 bp长并在5’末端含有PhyA信号肽和KpnⅠ位点：GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGTATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGGAG(SEQ ID No.9)。另一种引物为24 bp长并在其3’末端含有EcoRⅠ位点：GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC(SEQ ID No.10)。进行25个PCR循环，95℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延长链1分钟。扩增、消化1.3kb片段，并将其连接入pYES2中。通过限制性作图证实插入后，将所述构建物(pYES2-SPhyA-appA)通过醋酸锂法转化入INVScⅠ中。

表达将选定的转化体接种入YEPD培养基中。如上所述，OD₆₀₀达到2以后，在培养基中加入半乳糖诱导表达。诱导后15或20小时收集细胞。

活性分析用磷酸对硝基苯酯作底物(贮藏液250mM)在25mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.5)中于37℃分析酸性磷酸酶活性。将1.7ml反应缓冲液加入0.1ml样品中。将其在37℃水浴中温育5分钟后，加入0.2ml预温的底物并混合。将反应溶液转移入预温比色皿中，将其在37℃分光光度室中温育2分钟。在405nm读出连续5分钟所释放的对硝基苯酚，以计算酶活性。

体外研究将大豆粉(5.0g)悬浮于20ml 20mM柠檬酸缓冲液，pH5.5中，并与200mU植酸酶混合，在持续振摇下于37℃温育4小时。在冰上冷却10分钟后，将淤浆转移到离心管中，并以15,000×g离心15分钟。上清液用来测定游离磷。实施例11-定量大肠杆菌appA基因在酿酒酵母中过量表达的植酸酶

活性

在appA过量表达的大肠杆菌中的胞内酸性磷酸酶活性(pAPPA1)为440mU/mg蛋白。意外的是，转化体菌株的胞内植酸酶活性高于4900mU/mg蛋白。但是对照(BL21)仅存在最小植酸酶活性。所以，该酸性磷酸酶基因还编码植酸酶。将appA基因序列与PhyA的序列进行对比，发现这两种基因的同一性为23％。

用构建物pYES2-Sphy-appA(由PhyA的信号肽引导)转化的INVScⅠ产生的上清液胞外植酸酶活性是野生型或含有appA基因和其自身信号肽的转化体的2,000倍以上(参见表7)。

表7．具有不同信号肽的appA基因转化体的胞外植酸酶活性

构建物信号活性(mU/ml)活性(mU/mg蛋白)PYES-appApYES2-SPhyA-appA appAPhyA检测不到1,158检测不到445

培养基(YEPD)无机磷、植酸盐、pH和温度对pYES2-SPhyA-appA表达植酸酶活性的影响见表8。在最适条件下的最高植酸酶活性为2,286mU/ml(633mU/mg蛋白)。表8．不同YEPD培养基条件对pYES2-SPhyA-appA在酵母中

表达植酸酶活性的影响

培养基条件    活性(mU/ml)磷，mg/100ml01510植酸钠，g/100ml00.11.0pH5.07.08.0温度，℃25303714027147224568701019174889299622863121036996

酵母转化体产生的过量表达的胞外植酸酶活性的热稳定性高于pAPPA1转化的大肠杆菌产生的胞内植酸酶活性的热稳定性(参见表9)。在80℃下将胞外植酸酶加热15分钟使其植酸酶活性丧失30％，而在相同条件下几乎丧失全部大肠杆菌植酸酶活性。

表9．在80℃下加热不同来源的植酸酶15分钟对其活性的影响

植酸酶    加热后的相对活性，％在大肠杆菌中的appA在酿酒酵母中的appA在酿酒酵母中的PhyABASF植酸酶    0.1696650

大肠杆菌植酸酶(200mU)、在酵母中过量表达的AppA和BASF对从大豆粉释放磷的作用的比较见表10。结果表明全部三种来源的植酸酶均从大豆粉有效释放植酸盐-磷。

表10．不同来源的植酸酶从大豆粉中释放的游离磷

植酸酶    磷(mg/g)在大肠杆菌中的appA在酿酒酵母中的appABASF    1.110.690.87

大肠杆菌appA(酸性磷酸酶)基因当在酿酒酵母中表达时产生的培养基胞外植酸酶活性高于对照2,000倍。过量表达的植酸酶有效地从大豆粉中释放植酸盐-磷，而且似乎比目前市售植酸酶或相同基因(appA)在大肠杆菌中产生的胞内植酸酶的热稳定性更好。实施例12-在巴斯德毕赤酵母中过量表达编码酸性磷酸酶/植酸酶的

大肠杆菌appA基因的方法和材料

基因和蛋白appA基因和宿主大肠杆菌菌株CU1867(第47092号)得自ATCC。appA基因为1.3kb的插入片段，用表达载体pAPPA1将其转化入大肠杆菌菌株BL21(第87441号)(Ostanin,K.等，“大肠杆菌酸性磷酸酶的过量表达、定点诱变和机制”，J.Biol.Chem.,267:22830-36(1992)，将其通过引用结合到本文中)。

宿主和载体EasySelect^TM毕赤酵母属表达试剂盒得自Invitrogen(San Diego,CA)。该试剂盒提供宿主和载体以在野生型菌株(X-33)中胞内或胞外表达所述基因。使用两种载体pPICZ B(3.3kb)和pPICZαA(3.6kb)，它们均用AOX1作启动子。

表达载体的构建使用两种引物从pAPPA1扩增appA基因，并且分别在5’和3’末端产生两个限制性位点EcoRⅠ和KpnⅠ。

上游引物：GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA(SEQ ID No.11)

下游引物：GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G(SEQ ID No.12)

模板：分离自ATCC 87441的pAPPA1 DNA

进行30个循环的PCR，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长链1分钟。扩增一个有1,245个碱基对的片段，用EcoRⅠ和KpnⅠ消化，连接(16℃过夜)入pPICZ B(3.3kp)和pPICZαA(3.6kb)中。在将所述构建物转化入DH5α中后通过限制性作图证实连接。

构建物转化入毕赤酵母属(X33)为了进行各转化，制备100μg质粒DNA并用PmeⅠ经消化线性化。线性化后纯化所述DNA，并重悬浮入10μL无菌去离子水中。实际上将1/2量所述DNA用于各转化。电穿孔和EasyComp化学试剂盒(Invitrogen)均用来将所述DNA转化入X33中。电穿孔时，应用Electro Cell Manipulator(ECM 600,Gentromics,BTX Instrument Division,San Diego,CA 92121)和2mm杯。电阻是186欧姆，加载电压1.5千伏，实际通电时间约7毫秒。电穿孔的细胞在含有100mg Zeocin/mL的YPD琼脂平板上于30℃培养2-4天以生长菌落。化学转化时，将细胞在含有100mg Zeocin/mL的YPDS琼脂平板上生长。与电穿孔比较，化学法的转化效率低。

表达取单个菌落接种入10ml MGY培养基(30ml管)中，在振摇培养箱(200rpm)中于28-30℃培养(16-18小时)至OD₆₀₀ 5-6。离心(2,000rpm)收集细胞，并重悬浮在10ml BMMY培养基(含有0.5％甲醇)中以诱导表达。诱导后每隔12或24小时收集样品(200μL)。每隔24小时加入100μL甲醇(100％)维持培养基甲醇浓度为0.5-1％。

分析分离细胞与培养基(上清液)并用玻璃珠在破碎缓冲液中裂解细胞。如上所述(用10mM植酸钠在37℃下的0.2M柠檬酸缓冲液，pH5.5中)分析上清液中的胞外植酸酶活性和裂解细胞内的胞内植酸酶活性。用磷酸对硝基苯酯作底物(贮藏液250mM)在25mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.5)于37℃检测酸性磷酸酶活性。将1.7ml反应缓冲液加入0.1ml样品中。于405nm读出连续5分钟释放的对硝基苯酚以计算酶活性。进行SDS-PAGE(12％)以测定表达蛋白的大小和相对量。如在所述结果中所述测定表达植酸酶的最适pH和温度。

体外研究将大豆粉(5.0g)悬浮于20ml 20mM柠檬酸缓冲液，pH5.5中，并与不同水平植酸酶混合，在持续振摇下于37℃温育4小时。在冰上冷却10分钟后，将淤浆转移到离心管中，并以15,000×g离心15分钟。上清液用来测定游离磷。实施例13-筛选过量表达大肠杆菌appA基因的巴斯德毕赤酵母的菌

落植酸酶活性

野生型毕赤酵母属菌株X33产生最小量胞内(＜0.03 U/mg蛋白)或胞外(＜0.05 U/mL)植酸酶活性。用插入pPICZB的appA基因(不含α因子，因此推定产生胞内植酸酶)转化的X33细胞并没有显示植酸酶活性的任何增加(胞外植酸酶活性为0.2U/mL，而胞内植酸酶活性为0.05U/mg蛋白)。

用构建物pPIZαA-appA(由α因子信号肽引导)转化的X33细胞产生培养基胞外植酸酶活性。开始时，筛选72个菌落。诱导后40小时只有2个菌落的活性＜1 U/mL。诱导后40小时大部分菌落的活性范围为10-20 U/mL。诱导后118小时全部70个菌落的植酸酶活性＞80 U/mL。诱导后192小时，检测到迄今为止最高的植酸酶活性215U/mL(参见表11)。

表11．诱导后40和118小时pPIZαA-appA转化的X33菌落的

                胞外植酸酶活性范围

菌落号    诱导后40小时诱导后118小时 26362870    ＜1 U/mL1-10 U/mL11-20 U/mL＞20 U/mL＞80 U/mL

比较表达215 U植酸酶活性/mL的转化体与野生型X33的植酸酶和酸性磷酸酶活性(诱导后192小时)(参见表12)。几乎所有的表达的植酸酶蛋白分泌出细胞，说明α因子是植酸酶分泌非常有效的信号肽。

表12．诱导后192小时pPIZαA-appA转化体和野生型X33的

             植酸酶和酸性磷酸酶活性

    野生型X33 pPIZαA-appA转化体植酸酶酸性磷酸酶 胞外活性U/mL0.050.01胞内活性U/mg蛋自0.030.002胞外活性U/mL2155.88    胞内活性U/mg蛋白0.50.9

具有相同酸性磷酸酶appA基因的大肠杆菌转化体的胞内植酸酶活性为5U/mg蛋白(Ostanin等，“大肠杆菌酸性磷酸酶的过量表达、定点诱变和机制”，J.Biol.Chem.,267:22830-36(1992)，将其通过引用结合到本文中)。在黑曲霉中的转化的PhyA基因产生的胞外活性为7.6 U/ml(Hartingsveldt等，“黑曲霉植酸酶编码基因(PhyA)的克隆、特征鉴定和胞外活性”，Gene127:87-94(1993)，将其通过引用结合到本文中)。比较这些结果，毕赤酵母属植酸酶表达系统是非常有效的表达系统。实施例14-植酸酶表达的时程

诱导后最高至192小时几乎所有选定的菌落的培养基胞外植酸酶活性线性增加。图18总结了诱导后24-163小时5个选定菌落的活性变化。实施例15-培养基pH对植酸酶表达的影响(23号菌落，186小时的

活性为136U/mL)

用0.1M磷酸缓冲培养基，研究不同pH对所述转化体产生胞外植酸酶的影响，与无缓冲剂(pH 7.0)的对照培养基比较。缓冲至pH6的培养基产生最高的植酸酶活性(参见图19)。实施例16-表达的胞外植酸酶的大小

用SDS-PAGE(12％凝胶)分析，可见用3个不同菌落接种的培养物的培养基上清液的清晰条带(参见图20)。其大小约55kDa，可能该蛋白部分糖基化。因为表达的蛋白几乎是上清液的唯一可见条带，所以收集酶产物应非常简便而不需要冗长的纯化。实施例 17-表达的胞外植酸酶(23号菌落)的最适pH和温度

表达的植酸酶的最适pH为2.5-3.5(见图21)。明显不同于黑曲霉PhyA植酸酶(BASF)或我们的其它表达系统的phyA植酸酶的最适pH。胃pH对植酸酶功能是理想的。

表达的酶的最适温度为60℃(见图22)。实施例18-表达的植酸酶水解大豆粉植酸盐-磷的作用

该过量表达的大肠杆菌植酸酶(23号菌落)有效水解大豆粉的植酸盐-磷(见图23)。混合物中释放的游离磷呈0-800 mU植酸酶/g饲料线性。实施例19-巴斯德毕赤酵母表达的大肠杆菌AppA植酸酶对断奶小猪

的植酸盐磷生物利用度的影响

为了确定毕赤酵母属表达的大肠杆菌植酸酶在猪膳食中的营养价值，比较该新型植酸酶和无机磷或市售微生物植酸酶(Natuphos^TM,BASF Coup.,Mt.Olive,NJ)的有效性。从Cornell猪研究农场的多胎母猪选择48只断奶小猪。使21天龄小猪断奶，饲养以市售幼畜(creep)饲料直到第28天。然后将它们分为每栏2只小猪，每一处理随机指定6栏小猪进行。给予小猪2周玉米-大豆粉基础膳食以进行调节(表13)。

表13．猪的试验膳食配方

成分    +C％膳食    -C％膳食    YP％膳食    MP％膳食玉米乳清蛋白浓缩物SBM44％玉米油酸橙(lime)磷酸二钙维生素和矿物质预混物ECAP预混物MP预混物盐CSP 250总计CPCaP_总计    60.533030.81 20.5000.50.510020.60.730.6    61.5733030.9300.5000.50.510020.60.470.39    61.0733030.9300.50.500.50.510020.60.470.39    61.0733030.9300.500.50.50.510020.60.470.39注释：所有预混物用玉米作载体维生素和矿物质预混物以每Kg膳食提供：2,540IU维生素A、660IU维生素D、15IU维生素E、2.2mg维生素K、3.3mg核黄素、13.2mg泛酸、17.6mg烟酸、110.1mg胆碱、1.98μg维生素B-12、37.4mg Mn、0.6mg I、10mg Cu、0.3mg Se、100mgZn和100mgFe。

然后每栏小猪接受所述四种处理膳食之一。阳性对照组(+C)接受添加磷酸二钙的基础膳食。阴性对照组(-C)仅接受基础膳食。酵母植酸酶组(YP)接受以1,200 U/kg饲料添加表达的大肠杆菌植酸酶的基础膳食。微生物植酸酶组(MP)接受以1,200 U/kg饲料添加BASF植酸酶的基础膳食。猪自由吃食和饮水。每周记录各猪的体重增量。每天记录各猪的日饲料摄入量。每周对各猪取血样分析血浆无机磷浓度。体重(BW)、每日平均增量(ADG)、平均饲料摄入量(ADFI)和饲料/增量比(F∶G)以及血浆无机磷(PP)结果见表14。

表14．膳食植酸酶对猪PP、BW、ADG、ADFI和F∶G

的影响的总结¹

    +C    -C    YP    MP    初始PPBW第1周PPBWADGADFIF∶G第2周PPBWADGADFIF∶G第3周PPBWADGADFIF∶G第4周PPBWADGADFIF∶G12.9911.5410.83^A14351.7002.049.76^A18.04.5788331.46^B11^A22.58.649^A1.1661.810.94^A27.54.708^AB1.395^A1.9813.0211.636.48^c13.83.316.6842.205.64^D17.42.512.8551.67^A6.26^c21.17.536^B1.021.926.31^C25.29.589^B1.049^B1.8713.07128.59^B14.29.327.6972.188.72^B17.83.506.7841.56^AB8.64^B22.595^AB1.0011.719.65^B27.79.827^A1.309^A1.5913.5411.58.35^B13.92.345.6972.137.84^c17.71.542.8371.55^AB8.13^B22.21.643^AB1.0031.369.2^B27.38.738^AB1.273^AB1.73¹在同一行中没有相同字母的数字显著不同。用α=0.05和df=20的Bonferroni(Dunn)T检验进行差异性分析。

此外，在四周试验结束时阴性对照组存在严重磷缺乏。但是其它三组没有磷缺乏体征。显然，毕赤酵母属表达的大肠杆菌植酸酶改善断奶小猪对玉米-大豆粉膳食的植酸盐-磷生物利用度的有效性至少(如果不是更好)与市售微生物植酸酶相同。它可用来替代对断奶小猪的无机磷补充。实施例20-巴斯德毕赤酵母表达的大肠杆菌AppA植酸酶对断奶小猪

的铁(Fe)和植酸盐磷生物利用度的影响

为了确定毕赤酵母属过量表达的大肠杆菌植酸酶对断奶小猪的膳食植酸盐结合的Fe的生物利用度的影响，选择20只贫血猪(21天龄和7.3g血红蛋白(Hb)/dL血)。所述猪用缺乏Fe的幼畜饲料饲养7天，在28天龄时将其圈养在代谢笼中。然后在35天龄开始用试验膳食饲养猪5周。处理膳食如下：缺乏Fe的基础膳食(-C，外加无机磷)、补充Fe的膳食(+C)、缺乏Fe-和磷但是加有每kg饲料1,200U表达的大肠杆菌植酸酶的膳食(YP)或加有每kg饲料1,200U市售微生物植酸酶(BASF,MP)的膳食。每周测定体重(BW)、收集细胞体积(PCV)、Hb和血浆无机磷(PP)。结果见表15。

表15．膳食植酸酶对猪PCV、Hb、BW和PP

的影响的总结¹

    +C    -C    YP    MP    初始PCVHbBWPP第1周PCVHbBWPP第2周PCVHbBWPP第3周PCVHbBWPP第4周PCVHbBWPP第5周PCVHbBWPP257.738.147.92257.629.448.41298.612.3210.28^a36^a11.55^a16.77^a12.14^a3912.99^a21.36^a10.19^a4013.52^a26.539.27^a257.228.277.76268.38.848.45267.3410.139.05^ab29^b8.2^b13^b11.37^ab3410.11^b17.37^b9.34^ab3812.24^b22.598.95^ab267.858.177.21298.779.638.48308.9311.918.89^ab34^a10.84^a15.62^ab10.25^bc3812.27^a19.44^ab9.49^ab4013.64^a24.278.79^ab247.087.457.36277.888.578.22288.2710.848.22^a33^a9.96^ab14.62^ab9.71^c3611.36^ab18.56^ab8.8^b3913.13^ab23.438.02ⁿ¹数字为均数(n=5)。在同一行中没有相同上标字母的均数显著不同(P＜0.10)。

总之，毕赤酵母属过量表达大肠杆菌植酸酶改善断奶小猪对玉米-大豆膳食植酸盐-磷和Fe的利用的有效性至少与BASF植酸酶相同。

尽管本文详细图释和描述了优选实施方案，但是在不偏离本发明宗下可进行各种改进、添加、替代等，这对相关领域技术人员而言是显而易见的，所以如以下权利要求书的定义，它们属于本发明范畴。

序列表<110>Counell Research Foundation,Inc.<120>植酸酶基因在酵母系统中的过量表达<130>19603/1341<140><141><150>09/104,769<151>1998-06-25<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>1cggaattcgt cacctccgga ct                                   22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>2cccaagcttc taagcaaaac actc                                 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>3cagctatgac catgattacg cc                                        22<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>4cctagaacgg gaattcattg gccgcc                                    26<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>5cccaagcttg atcacatcca ttca                                      24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>6cggggactgc tagcgcacgt tcgat                                     25<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>7atcgaacgtg cgctagcagc agtccccg                                  28<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>8gctctagact aagcaaaaca ctcc                                      24<210>9<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>9ggggtaccat gggcgtctct gctgttctac ttcctttgta tctcctgtct ggagtcacct 60ccggacagag tgagccggag                                             80<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>10gggaattcat tacaaactgc aggc                                     24<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>11ggaattccag agtgagccgg a                                        21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR扩增和克隆的引物<400>12ggggtacctt acaaactgca cg                                       22