监控非核苷类逆转录酶抑制剂抗逆转录病毒治疗的途径与方法

摘要

本发明涉及用于检测治疗人类免疫缺陷型病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的药物有效性的抗病毒药物敏感性和抗性测试,本发明还涉及监测HIV感染的临床进程以及对抗逆转录病毒疗法,特别是使用表型敏感性测试或基因型测试的非核苷逆转录酶抑制剂疗法的响应。

说明书

本申请是1998年5月26日提交的美国专利申请第09/085,148号的部分继续申请，并要求1999年3月12日提交的美国临时申请第60/124,090号的权益，其内容引入本文作为参考。

在本申请中各类参考文献在括号中标出。这些文献所公开的全部内容引入本文作为参考，以更全面地描述本申请所属技术领域中的现有技术状况。

技术领域

本发明涉及抗逆转录病毒药物敏感性和抗性试验，试验用于鉴定治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的有效药物制剂。本发明进一步涉及用表型和基因型分析法监控临床HIV感染进程及其对抗逆转录病毒治疗的反应。本发明还涉及用于完成表型敏感性试验的新型载体、宿主细胞及组合物。本发明进一步涉及使用各种基因分析方法鉴别HIV感染患者对特定抗逆转录病毒药物制剂产生的抗性。本发明还涉及依据对病毒、选定的病毒序列和/或病毒蛋白进行抑制的能力筛选抗逆转录病毒候选药物。本发明特别涉及到使用表型敏感性试验和/或基因分析试验测定非核苷酸逆转录酶抑制剂抗性。

本发明的背景

HIV感染特点是在发病过程中高频率的病毒更新，最终导致CD4细胞的消亡和病情发展恶化。Wei X,Ghosh SK,Taylor ME,et al.(1995)Nature 343,117-122,and Ho DD,Naumann AU,Perelson AS,et al.(1995)Nature 373,123-126。抗逆转录病毒治疗的目的是对病毒复制获得实质和持续的抑制，对病毒获得持续的控制包括采用一系列的治疗方法，总体上每一种治疗方法包括3种或更多抗逆转录病毒药物的联合使用，因此选择开始和后续的治疗方法应当建立在的理性基础上，充分了解抗性和交叉抗性对于指导治疗方法的确定至关重要。联合治疗的基本理性基础是药物配合作用和加和作用可对病毒复制获得更大抑制。然而药物制剂的耐受性仍然至关重要，因为治疗方法需要保持许多年。

在没有接受治疗的患者体内每天产生大约10¹⁰个新病毒颗粒，加上HIV逆转录酶(RT)没有核酸外切酶校正功能，不能校正转录错误，这种高水平的病毒更新导致在HIV基因组的每个位置每天有10⁴到10⁵次突变，结果迅速产生了基因组的广泛突变。尽管某些模板位置或碱基对取代更倾向于发生错误(Mansky LM,Temin HM(1995)J Virol 69,5087-5094)(Schinazi RF,Lloyd RM,Ramanathan CS,et al.(1994)Antimicrob AgentsChemother 38,268-274)，数学模型仍然显示在感染个体中每个可能位点每天可能发生10,000次突变。

要产生对抗逆转录病毒药物的抗性，作为药物作用靶位的酶分子必须得到修饰并在抑制剂存在时保持其功能。导致单个氨基酸取代的点突变可能导致酶形状、大小的改变，或者活性部位、底物结合部位或周边区域的改变。在初始治疗之前已经在低水平上检测到对抗逆转录病毒药物有抗性的突变。(Mohri H,Singh MK,Ching WTW et al.(1993)Proc NatlAcad Sci USA 90,25-29)(Najera I,Richman DD,Olivares I,et al.(1994)AIDS Res Hum Retroviruses 10,1479-1488)(Najera I,Holguin A,Quinones-Mateu E,et al.(1995)J Virol 69,23-31)。然而，这些突变株仅占整个病毒总量的一小部分，而且与野生型病毒相比可能处于复制和竞争劣势。(Coffin JM(1995)Science 267,483-489)。抗逆转录病毒治疗产生的选择压力为这些抗药突变株提供了竞争优势，这样它们逐渐成为优势准种(Frost SDW,McLean AR(1994)AIDS 8,323-332)(Kellam P,Boucher CAB,Tijnagal JMGH(1994)J Gen Virol 75,341-351)，最终导致患者体内抗药和抗病毒治疗失败。

非核苷类逆转录酶抑制剂

非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是一类有多种化学基团的化合物，它们在体外对HIV逆转录酶有强烈抑制作用。这些化合物包括吡啶类衍生物，双芳香杂环哌嗪(BHAPs)例如地拉呋啶(delavirdine)和艾特呋啶(atevirdine)，联吡啶二氮杂草耐呋络平(nevirapine)，腺苷衍生物族TSAO和HEPT，一种α-苯胺苯乙酰胺(α-APA)化合物络呋瑞得(loviride)，和奎诺啉族抑制剂如(HBY-097),1-和硫酮苯并嗪(TIBO)化合物和吡啶衍生物(L-697,661)，综述见(DeClercq E.(1996)Rev Med Virol6,97-117)(Emini EA(1996)Antiviral Drug Resistance抗病毒药物抗性，ed.DD Richman,John Wiley & Sons,Led.)。病毒通常在进行单一治疗的前几周内似乎就迅速对每种化合物产生高抗性，这常常包括单一位点突变，而且在许多情况下导致对其它非核苷类逆转录酶抑制剂可观的交叉抗性。大多数报道的突变发生在密码子110-108和181-190之间，它们编码与逆转录酶催化部位相邻的两个β-折叠(Kohlstaedt LA,Wang J,Friedman JM,et al.(1992)Science 256,1783-90)，非核苷类逆转录酶抑制剂的结合口袋正如文献已经描述的那样，是逆转录酶非底物结合疏水区。在这里，这些制剂直接与逆转录酶相互作用。它们通过干扰指形亚结构域的活动或者阻断对催化活性必需的天冬氨酸侧链方向抑制酶的活性(D′Aquilla RT.(1994)Clin Lab Med 14,393-432)(Arnold E.,Ding J.,Hughes SH,et al.(1995)Curr Opin Stmct Biol 5,27-38)。

已有报道说，引起耐呋络平(nevirapine)敏感性减弱的突变位于密码子98、100、103、106、108、181、188和190(Richman DD,Havlir D,CorbeilJ.(1994)J Virol 68,1660-1666)。在耐呋络平(nevirapine)单一治疗过程中最频繁的选择突变是酪氨酸¹⁸¹-半胱氨酸(Y181C)突变，它会导致HIV对该制剂敏感性减弱100倍，对吡啶衍生物L-696,229和L-697,661的敏感性也会减弱(Arnold，同上)。181突变也会限制TSAO的活性，但对于100和103位密码子突变仍保持活性，并且在体外选择独特型突变谷氨酸¹³⁸-半胱氨酸，在该位点TSAO与逆转录酶紧密相互作用(Richman,DD，同上)(Richman DD,Shih C-K,Lowy I,et al.(1991)Proc Natl Acad SciUSA 88,11241-11245)。

大多数患者在使用单-治疗24周后会产生络呋瑞得(loviride)抗性，已经绘制了密码子100-110；181-190的图谱，最普遍的是103密码子突变(Staszewski S，Miller V,Kober A,et al.(1996)Antiviral Ther 1,42-50)。使用络呋瑞得(loviride)与瑞得乌啶(zidovudine)或瑞得乌啶(zidovudine)与来咪乌啶(lamivudine)联合治疗，在24周内在密码子98和103位发生的变异是最高频的缺失突变(Staszewski S,Miller V,RehmetS,et al.(1996)AIDS 10,F1-7)。

尽管101、103和181位的突变也能导致对双芳香杂环哌嗪(BHAPs)的交叉抗性，(Balzarini J,Karlsson A,Perez-Perez M-J,et al.(1992)Virology 192,246-253)在体外由于这些药物选择作用236位P取代L，使逆转录酶对其它非核苷类逆转录酶抑制剂敏感，例如耐呋络平(nevirapine)抗性/半数抑制浓度IC50减少7至10倍，但不影响对核苷类似物的敏感性(Staszewski S.,同上)。尽管在单一治疗中已有报道说密码子103位和181位发生抗性获得性突变，并在与瑞得乌啶(zidovudine)联合治疗中发生密码子101、188、233和238位突变，但是在艾特呋啶(atevirdine)的临床治疗中还未发现密码子236位发生突变的个体。

HBY-097在体外最先选择出密码子190位突变，并进一步不断选出逆转录酶密码子74和75位突变，这样一些突变病毒对地达喏森(didanosine)和斯塔乌啶(stavudine)敏感性降低，但对瑞得乌啶(zidovudine)的敏感性并不降低(Kleim J-P,Rosner M,Winkler I,et al.(1995)J Acquir Immune Defic Syndr 10 Suppl 3,2)

已有报道说41和251位密码子的典型突变可以抵消181位密码子突变对瑞得乌啶(zidovudine)的抗性，(Zhang D,Caliendo AM,Eron JJ,et al.(1994)Antimicrob Agents Chemother 38,282-287)，这说明应用一些非核苷类逆转录酶抑制剂和瑞得乌啶(zidovudine)进行联合治疗可能可行。尽管有报道说HIV突变株在体外对瑞得乌啶(zidovudine)、地达喏森(didanosine)、耐呋络平(nevirapine)有三重抗性，(Larder BA,Kellam P,Kemp SD(1993)Nature 365,451-453)，但联合使用这三种药物治疗CD4细胞数小于350/mm³的患者48周后，免疫及抗病毒疗效的确优于单独用瑞得乌啶(zidovudine)和地达喏森(didanosine)。

用瑞得乌啶(zidovudine)和吡啶衍生物L-697,661联合治疗能阻碍在使用这一非核苷类逆转录酶抑药物单一治疗过程中引发典型的181突变，延缓对该化合物高抗性的出现，本研究没有检测到瑞得乌啶(zidovudine)敏感性改变。(Staszewski S,Massari FE,Kober A,et al.(1995)JInfect Dis 171,1159-1165)。在使用耐呋络平(nevirapine)治疗时同时或交替用瑞得乌啶(zidovudine)治疗不会延缓抗性出现；(Richman DD，同上)(Nunberg JH,Schleif WA,Boots EJ,et al.(1990)J Virol 65,4887-4892)(DeJong MD,Loewenthl M,Boucher CAB,et al.(1994)J Infect Dis 169,1346-1350)(Cheeseman SH,Harlir D,McLaughlin MM＜et al.(1995)JAcquir Immune Defic Syndr 8,141-151)，然而在联合治疗过程中并没有观察到181突变，最常见突变发生在190位密码子(Richman DD，同上)。这说明由于181密码子突变在体外能抵消瑞得乌啶(zidovudine)抗性，所以不适于将其用于体内筛选允许对这个NNRTI药物的敏感性降低却同时伴随有瑞得乌啶(zidovudine)抗性的突变。

由于对非核苷类逆转录酶抑制剂敏感性迅速降低，这些药物的使用受到了限制，单一治疗尤其如此。这就引发对这些分子进行人工修饰，以期延缓抗药病毒的出现。一种“第二代”非核苷类逆转录酶抑制剂，即吡啶衍生物L-702,019，对野生型和181突变株HIV-1的半数抑制浓度IC₅₀仅有3倍改变，而且获得性的多突变导致高抗性(Goldman ME,O′Brien JA,Ruffing TL,et al.(1993)Antimicrob Agents Chemother 37,947-949)。

本发明的目的之一是提供一种药物敏感性和抗性检测方法，它能显示患者体内的病毒种群对给定的药物配方是否有抗性。本发明的另一个目的是在患者接受治疗后对特定的一种或多种药物产生抗性时，为医生提供一个用于替换治疗配方中一种或数种药物的试验。本发明的又一个目的是提供一个能够筛选治疗HIV感染和/或AIDS有效药物配方的试验。本发明的再一个目的是为那些产生抗性，尤其是已查明对非核苷类逆转录酶抑制剂产生抗性的患者提供合适药物选择的方法。本发明的又一个目的是提供一种评价作用于特定病毒、病毒基因和/或病毒蛋白的候选药物生物有效性的试验和方法，特别是与非核苷类逆转录酶抑制剂相关的病毒抗药试验和方法。本发明的再一个目的是提供评价HIV抗逆转录病毒药物抗性和敏感性的方法以及组合物。显然本发明该目的和其它目的技术要求是一个整体。

发明概述

本发明涉及运用表型和基因分析方法监控人类免疫缺陷型病毒感染进程以及它对抗病毒治疗反应的方法。本发明还部分地基于发现了使HIV对抗病毒治疗产生抗性的逆转录酶(RT)遗传突变可以使用表型或基因分析方法直接通过患者血浆HIV RNA迅速确定这一发现，这些方法使用聚合酶链反应(PCR)，或者不使用扩增步骤使用测定编码病毒蛋白的病毒核酸序列的方法也可使本发明监控和/或改进抗逆转录病毒治疗。本发明还部分地基于发现了在非核苷类逆转录酶抑制剂(efavirenz)治疗的患者体内HIV逆转录酶225位密码子单独突变或与103位密码子同时突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加相关，并且对耐呋络平(nevirapine)的敏感性几乎不改变，这些突变是在治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在225位密码子突变和103位密码子突变的形成可作为形成抗性和最终免疫低下的指标。本发明还部分地基于发现了在接受非核苷类逆转录酶抑药物(NNRTI)治疗的患者中发生逆转录酶236位密码子突变与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低、对耐呋络平(nevirapine)的敏感性不降低相关。我们发现HIV逆转录酶在190和103和/或101位密码子突变和103位密码子突变的形成可作为表型敏感性/抗性发生改变的指标，这与抗病毒治疗失败和随后的免疫能力降低有关。本发明还部分地基于发现了在接受非核苷类逆转录酶抑剂类药物(艾发呋瑞兹efavirenz)治疗的患者体内HIV逆转录酶190位密码子单独突变或109位密码子与103和/或101位密码子同时突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加和对耐呋络平(nevirapine)的敏感性降低相关，这些突变是在NNRTI治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在236和103位密码子突变和/或181位密码子突变的形成可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。

本发明还部分地基于发现了在非核苷类逆转录酶抑制剂(耐呋络平nevirapine)治疗的患者中HIV逆转录酶230位密码子单独突变或与181位密码子同时突变，这些突变与对地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)的敏感性显著降低相关，这些突变是在NNRTI治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在230和181位密码子突变的形成可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在非核苷类逆转录酶抑制剂(耐呋络平nevirapine)治疗的患者中HIV逆转录酶181位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和耐呋络平(nevirapine)的敏感性显著降低、对艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性没有变化相关，该突变是在NNRTI治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在181位密码子发生突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在非核苷类逆转录酶抑制剂(艾发呋瑞兹efavirenz)治疗的患者中HIV逆转录酶188位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低和耐呋络平(nevirapine)的敏感性实质性降低相关，该突变是在NNRTI治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在188位密码子发生突变可作为表型敏感性/抗性发生改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在没有用非核苷类逆转录酶抑制剂治疗的患者中HIV逆转录酶188位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和耐呋络平(nevirapine)的敏感性实质性降低，以及对艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性中度降低相关，该突变是在抗逆转录病毒治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在138和188位密码子发生突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在以前没有用非核苷类逆转录酶抑制剂治疗的患者中HIV逆转录酶98位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低相关，该突变是在抗逆转录病毒治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在98位密码子突变的形成可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与抗病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。

本发明还部分地基于发现在不清楚患者接受抗逆转录病毒治疗情况时HIV逆转录酶98位密码子单独突变或者与190位密码子同时突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性提高和耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低相关，这些突变是在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在98位密码子突变和190位密码子突变可作为形成抗性和最终免疫能力降低的指标。本发明还部分地基于发现了在接受非核苷类逆转录酶抑制剂(地拉呋啶delavirdine)治疗的患者中HIV逆转录酶181位密码子单独突变或与98位密码子同时突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质降低相关，这些突变是在治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在98和181位密码子突变可作为形成抗性和最终免疫能力降低的指标。本发明还部分地基于发现了101位密码子单独突变，或者与190位密码子同时突变(例如HIV逆转录酶190S)，与接受非核苷类逆转录酶抑制剂(艾发呋瑞兹efavirenz)治疗的患者对地拉呋啶(delavirdine)敏感性没有改变和耐呋络平(nevirapine)、艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质降低相关。这些突变是在治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在101和190位密码子发生突变(例如HIV逆转录酶190S)，可作为形成抗性和最终免疫能力降低的指标。本发明还部分地基于发现了在以前没有用非核苷类逆转录酶抑制剂治疗的患者中HIV逆转录酶108位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性没有改变、耐呋络平(nevirapine)敏感性轻微降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性没有改变相关，该突变是在抗逆转录病毒治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在108位密码子突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与抗病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。

本发明还部分地基于发现了在以前没有用非核苷类逆转录酶抑制剂治疗的患者中HIV逆转录酶101位密码子单独突变或与103和/或190位密码子同时突变，与对地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性改变相关，该突变是在抗逆转录病毒治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。特别是101和190位密码子突变，例如190A，与对地拉呋啶(delavirdine)敏感性没有改变、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性显著降低相关，这些突变是在抗逆转录病毒治疗治疗开始一段时间后在血浆HIVRNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在101、103和/或190位密码子突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在用非核苷类逆转录酶抑制剂(耐呋络平nevirapine)治疗的患者中HIV逆转录酶106位密码子单独突变或者与189和/或181和227位密码子突变，与对地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性改变相关，特别是106和181位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低相关，106和189位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性没有改变相关，106和227位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低相关，181和227位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性增加相关，106、181和227位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低相关，这些突变是在NNRTI治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在106、189和/或181和227位密码子突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫能力降低相关。本发明还部分地基于发现了在用非核苷类逆转录酶抑制剂(耐呋络平nevirapine)治疗的患者中HIV逆转录酶103位密码子单独突变或者与100和/或188位密码子突变，这些突变与对地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性改变相关，特别是103和188位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低相关，100和103位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低相关，103、100和188位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低相关，这些突变是在NNRTI治疗治疗开始一段时间后在血浆HIV RNA中发现的。我们发现HIV逆转录酶在103、100和/或188位密码子突变可作为表型敏感性/抗性改变的指标，这与病毒治疗失败和随后的免疫力降低相关。

在本发明又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测225位密码子突变，还可检测包括HIV逆转录酶在103位在内的其它密码子突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低的特定模型相关。在本发明又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测236位密码子单独突变或包括HIV逆转录酶103位和/或181位在内的其它位点同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。在本发明的再一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测190位密码(G190S)单独突变或与HIV逆转录酶上101位密码子(K101E)同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶190位密码子(G190A)单独突变或与103位密码子(K103N)同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶230位密码子单独突变或与181位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的再一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶181位密码子突变，该突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上188位密码子突变，该突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶138位密码子单独突变或与188位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的再一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶98位密码子突变，该突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶98位密码子单独突变或与190位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上181位密码单独突变或与98位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的再一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上101位密码子单独突变或与190位密码子同时突变(例如190s的突变)，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的再一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上108位密码子突变，该突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上101位密码子单独突变或与103和/或190位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上106位密码子单独突变或与189和/或181和227位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。

在本发明的又一个实施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在内的PCR分析方法检测HIV逆转录酶上188位密码子单独突变或与100和/或103位密码子同时突变，这些突变与对抗逆转录病毒治疗产生抗性和随后的免疫力降低相关。一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到225和103位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到236和/或103和/或181位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到190和/或103和/或101位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到230和/或181位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到181位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到188位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到138和/或188位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到98位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到98和/或190位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到181和/或98位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到101和/或190位密码子突变，例如190S，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到108位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到101和/或103和/或190位密码子突变(例如190A)，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到106和/或189和/或181和/或227位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。同样，一旦在正在接受NNRTI抗逆转录病毒治疗的患者体内检测到188和/或100和/或103位密码子突变，就必须考虑改变治疗药物配方。在使用PCR分析方法评价抗逆转录病毒治疗后，应该确定修改治疗药物配方的时间，这依赖于包括患者病毒负载量、CD4细胞数量和以前的治疗史这几个因素。

本发明另外一个方面是提供了评价非核苷类逆转录酶抗逆转录病毒药物有效性的方法，包括：(a)将带有患者来源片段和报告基因的抗性试验载体导入宿主细胞；(b)培养来自(a)的宿主细胞；(c)检测报告基因在靶宿主细胞中的表达，其中报告基因的表达依赖于患者来源片段；和(d)将来自步骤(c)报告基因的表达与在实施步骤(a)-(c)时不加入NNRTI抗HIV药物的情况下所检测到的报告基因的表达二者进行比较，其中抗HIV药物NNRTI的试验浓度在步骤(a)-(c)；在步骤(b)-(c)；或在步骤(c)中标出。

本发明还提供了评价患者接受非核苷类逆转录酶抗逆转录病毒药物治疗有效性的方法，包括：(a)绘制NNRTI类抗HIV药物的敏感性标准曲线；(b)使用如上所述的敏感性试验确定患者NNRTI抗HIV药物的敏感性；以及(c)将步骤(b)中NNRTI抗HIV药物的敏感性与步骤(a)中确定的标准曲线进行比较，其中NNRTI抗HIV敏感性降低表明在患者体内形成了对抗HIV药物的抗性。

本发明还提供了评价HIV抗逆转录病毒候选药物复方生物有效性的方法，包括：(a)将带有患者来源片段和报告基因的抗性试验载体导入宿主细胞；(b)培养来自(a)的宿主细胞；(c)检测报告基因在靶宿主细胞中的表达，其中报告基因的表达依赖于患者来源片段；和(d)将来自步骤(c)报告基因的表达与在实施步骤(a)-(c)时不加入NNRTI抗HIV药物的情况下所检测到的报告基因的表达二者进行比较，其中抗HIV药物NNRTI的试验浓度在步骤(a)-(c)；在步骤(b)-(c)；或在步骤(c)中标出。

靶细胞中抗性试验载体所带报告基因的表达最终依赖于患者来源片段序列，报告基因的功能可有可无。

本发明的另一个方面是为指导针对HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物敏感性/抗性试验。本发明中用于HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物敏感性/抗性试验的特殊抗性试验载体载体已被标识。

本发明的另一个方面是提供了鉴定和评价对于HIV和/或AIDS治疗具有潜力的抗逆转录病毒复方生物有效性的方法。另一方面，本发明针对一个新型抗性试验载体。该载体包含有一个患者来源片段和一个报告基因。患者来源片断进一步包含有一个或更多逆转录酶基因的突变。

附图简要说明

图1

抗性试验载体。用图形示意包含有一个患者来源片段和一个报告基因的抗性试验载体。

图2

双细胞分析。示意性地标识分析方法。通过将患者来源片段克隆到一个报告基因病毒载体中构建抗性试验载体，接着将该抗性试验载体与一个表达兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)外壳蛋白或其它能侵染的病毒或细胞蛋白的表达载体共转染，这样产生的假型病毒颗粒包含有源于患者序列的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)基因产物，接着收集颗粒用于感染新鲜细胞。使用缺陷的蛋白酶和逆转录酶序列证明荧光素酶活性依赖于有功能的蛋白酶和逆转录酶。另一方面，在病毒颗粒感染的同时或在此之前向细胞中加入逆转录酶抑制剂，该试验设有不含药物和加入不同浓度药物的多个组，测定荧光素酶的含量，测定不同试验药物浓度下的抑制百分比(％)。

图3

药物表型敏感性图例。通过绘制荧光素酶活性对log₁₀浓度(um)抑制百分比分析数据。该图用于计算抑制病毒复制的50％(IC₅₀)和95％(IC₉₅)所需的药物浓度，抑制曲线向更高药物浓度移位可以用抗药性解释。图中显示出3种典型曲线即一种核苷酸类逆转录酶抑制剂(AZT)、一种非核苷类逆转录酶抑制剂(地拉呋啶delavirdine)和一种蛋白酶抑制剂(ritonavir)。与基线(治疗前)样品或对照药物易感病毒相比，例如在基线样品不易获得时选用的PNL4-3或HXB-2，药物敏感性曲线向更高药物浓度(右移)位移反映了药物敏感性(抗性)降低。

图4

药物表型敏感性和抗性图：487例患者。实施PCR表型敏感性分析绘制表型药物敏感性和抗性图显示地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)抗性增加，这是NNRTI敏感性/抗性第一个模型的例子。通过分析血浆来源病毒证明HIV逆转录酶184密码子突变(M184V)与3TC抗性有关，103位突变(K103N)与对地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)抗性相关。

图5

逆转录酶定点突变株药物表型敏感性和抗性图。实施PCR表型敏感性分析绘制表型敏感性和抗性图显示103位和181位密码定点突变(K103N；Y181C)使地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)抗性增加，双突变株显示双突变的加和效应导致抗性进一步增加。

图6

药物表型敏感性和抗性图；487例患者。实施PCR表型敏感性分析血浆来源HIV逆转录酶的病毒核酸，绘制表型敏感性图显示对地拉呋啶(delavirdine)有抗性而耐呋络平(nevirapine)没有抗性，这是NNRTI敏感性/抗性第二个模型的例子。该患者来源病毒对试验所用蛋白酶抑制剂有抗性，也对AZT和3TC有明显抗性，对ddC、ddI和d4T敏感性轻微转移。运用PCR和测序进行基因型分析血浆来源病毒评价显示HIV逆转录酶在103和236位密码子突变(K103N；P236L)。先前报道P236L突变株引起地拉呋啶(delavirdine)抗性和耐呋络平(nevirapine)超敏(Dueweke TJet al.(1993)Proc Natl Acad Sci 90,4713-4717)。然而，在该患者样本中，地拉呋啶(delavirdine)抗性和耐呋络平(nevirapine)敏感性与野生型一样。

图7

逆转录酶定点突变株(P236L)的药物表型敏感性和抗性图。实施PCR表型敏感性分析绘制出显示P236L定点诱变突变株对地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)敏感性的表型敏感性和抗性图，结果与图6中所示的患者病毒样本的观察结果相同，后面2个方格指标K103N定点诱变突变株，2个方格下方指标双突变株K103N+P236L。在K103N突变基础上再发生P236L，引发对地拉呋啶(delavirdine)高抗性，但由于K103N因而对耐呋络平(nevirapine)抗性不产生影响。图右边显示当P236L附加于Y181→突变时会有类似结果。

图8A

药物表型敏感性抗性图：302例患者。这是NNRTI敏感性/抗性第三个模型的例子。患者病毒表型分析证明对地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)敏感性降低。该模型的特征是与地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低相比，对耐呋络平(nevirapine)敏感性更大幅度地降低，患者病毒基因型分析显示逆转录酶K103N突变与耐呋络平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)抗性以及P225H相关。

图8B

药物表型敏感性和抗性图：780例患者。这是NNRTI敏感性/抗性第三个模型的第二个例子。患者病毒表型分析显示地拉呋啶(delavirdine)和耐呋络平(nevirapine)敏感性均降低。该模型的特征是与地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低相比，对耐呋络平(nevirapine)敏感性更大幅度地降低，患者病毒基因型分析显示逆转录酶K103N位点发生突变与耐呋络平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)抗性以及P225H相关。

图8C

药物表型敏感性和抗性图：302例患者单个病毒克隆。对来自患者302的单个病毒克隆基因型分析显示带有K103N突变而没有P225H突变(K103N,1135M,R211K)的病毒，带有K103N突变同时具有P225H突变(K103N,P225H)的病毒。这些病毒克隆表型特征表明P225H突变减少与K103N突变相关的地拉呋啶(delavirdine)抗性(比较底部方格)，但不改变与K103N突变相关的耐呋络平(nevirapine)抗性(比较顶部方格)。

图8D

药物表型敏感性和抗性图：逆转录酶定点突变株。带有逆转录酶定点突变P225H的病毒的表型特征表明该突变增加对地拉呋啶(delavirdine)抗性，但对耐呋络平(nevirapine)抗性没有改变(比较顶部方格)。带有逆转录酶定点突变P225H加K013N或P225H加Y181C的病毒的表型特征图表明P225H突变降低与K103N或Y181C突变相关的地拉呋啶(delavirdine)抗性，但不降低与K103N或Y181C突变相关的耐呋络平(nevirapine)抗性。是针对地拉呋啶(delavirdine)而不是耐呋络平(nevirapine)(比较对应的中部和底部方格)。

图9A

药物表型敏感性和抗性图：644例患者。这是NNRTI敏感性/抗性第四个模型的例子。对患者病毒表型分析发现耐呋络平(nevirapine)敏感性大幅降低，地拉呋啶(delavirdine)敏感性不降低，对患者病毒基因型分析发现存在逆转录酶突变G190S，以及伴随有艾特呋啶(atevirdine)敏感性降低的K101E突变、MMP226、L-697、661和UC-10、38、57(Schinazi,Mellors,Larder resistance table)。

图9B

逆转录酶定点突变株药物表型敏感性和抗性图。包含有逆转录突变G190A或G190S的病毒的表型特征证明这些突变使耐呋络平(nevirapine)敏感性大副降低，对地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微升高(比较顶部表格)。

本发明详细描述

本发明涉及监控接受抗逆转录病毒临床治疗的患者，特别是接受非核苷类逆转录酶抑制剂抗逆转录病毒治疗的患者体内HIV的感染进程。

在一个实施方案中，本发明提供了一种评价患者抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码HIV逆转录酶的核酸，在逆转录酶上有一个或多个突变位点。突变与表型敏感性/抗性的改变呈正相关。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在225和103位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用药物表型敏感性分析，本发明证实了HIV逆转录酶225位密码单独突变或与103位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋络平(nevirapine)敏感性变化很小或不变化以及艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性不改变相关。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在236和103和/或18l位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶236位密码单独突变或与103和/或181位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性不变相关，236位单独突变或在Y181C的背景下突变不影响艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性，但很大程度恢复了由103N突变引起的敏感性丧失。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在230和/或181位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶230位密码单独突变或与181位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低相关。

在再一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在181位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶181位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性不变相关。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在188位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶188位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性显著降低相关。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在138和/或188位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶138位密码单独突变或与188位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低(抗性提高)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性中度降低相关。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在98位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶98位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性轻微降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性轻微降低相关。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在98和/或190位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶98位密码单独突变或与190位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加(抗性降低)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在181和/或98位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶181位密码单独突变或与98位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性轻微降低相关。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在101和/或190位密码子突变，例如190S的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶101位密码单独突变或与190位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性不变(野生型)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在108位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶108位密码子突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性不变(野生型)、耐呋络平(nevirapine)敏感性轻微降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性不变相关。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在101和103和/或190位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶101位密码单独突变或与130和/或190位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性或不变(101和190)或中度降低(103和190，例如190A)(抗性增加)、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在106和/或189和/或181和/或227位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶106位密码单独突变或与106和/或189和/或181和/或227位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性改变相关。特别地，106和181密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性轻微降低相关，106和189密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性不变相关，106和227密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性轻微降低相关，181和227密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加、耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性增加相关，106和181密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性轻微降低相关。在又一个特定的实施方案中，本发明提供了一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在188和100和/或103位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析本发明证实了HIV逆转录酶188位密码单独突变或与100和/或103位密码同时突变，这些突变与地拉呋啶(delavirdine)、耐呋络平(nevirapine)和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性改变相关。特别地，103和188密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质性降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关，100和103密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质性降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关，103和100和188位密码存在突变与地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质性降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质性降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)的敏感性实质性降低相关。在上述情况下，感染患者的HIV病毒的表型敏感性/抗性图和基因型图已经修改以便反映对抗逆转录病毒制剂反应性变化。对于NNRTI抗逆转录病毒治疗，感染患者的HIV病毒可能对这里所描述的一种或多种NNRTIs有抗性，但对其它NNRTIs没有抗性，因此在检测到突变后需要或者增加抗逆转录病毒制剂的剂量，或者改换另外的抗逆转录病毒制剂，或者在患者治疗的组合物中加入一种或多种额外的抗逆转录病毒制剂。例如，如果患者在接受艾发呋瑞兹(efavirenz)(DMP-266)治疗时225位发生突变，患者治疗组合物可能需要做以下修改，(Ⅰ)或者改换不同的NNRTI抗逆转录病毒制剂，例如地拉呋啶(delavirdine)或耐呋络平(nevirapine)，并停止艾发呋瑞兹(efavirenz)治疗；或者(ⅱ)增加艾发呋瑞兹(efavirenz)的剂量；或者(ⅲ)在患者治疗复方中加入其它抗逆转录病毒制剂。可以通过检测病毒负载量例如HIV DNA拷贝数评价经修改的治疗的有效性，HIV DNA拷贝数降低的确与治疗复方的有效性相关。

用在这里的术语“正相关”指特定的结果导致特定最有可能的结论，而不是其它结论。

本发明另外一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或225和103位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在225或103位密码子突变或二者同时突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或103和/或181和236位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在236和103和/或181位密码子突变。

本发明再一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或101和190位(G190S)密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在190(G190S)和101密码位突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或103和190位(G190A)密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在190(G190A)和103位密码子突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或230和181位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在230和181位密码子突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或181位突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在181位突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或188位突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在188位突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或138和188位突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在138和188位突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或98位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在98位密码子突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或98和190位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在190和98位密码子突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或98和181位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在98和181位密码子突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或101和190位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在190位，例如190S和101位密码子突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或108位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在108位密码子突变。本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或101和103和190位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在101和103和190位密码子突变，例如190A。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或106和189和181和227位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在106和189和181和227位密码子突变。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(Ⅰ)从HIV感染的患者中采集生物样品；(ⅱ)从生物样品中扩增HIV编码的RNA，即将RNA逆转录为cDNA，并用HIV引物扩增HIV序列，这样扩增出的PCR产物包含有逆转录酶基因；(ⅲ)用引物进行PCR扩增，这样扩增出的PCR产物包含有野生型或188和100和103位密码子突变；以及(ⅳ)通过PCR产物确定是否存在188和100和103位密码子突变。存在HIV逆转录酶225和103位密码子突变表明现有或将来的NNRTI治疗的有效性需要改进，因为如本发明所显示的那样103位密码子突变降低易感性，这可通过225位密码子突变部分恢复易感性。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶上存在236和103和/或181位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在190(G190A)和103(K103N)位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在190(G190S)和101(K101E)位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在230和181位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在181位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在188位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在138和188位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在98位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在98和190位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在181和98位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在101和190位密码子突变，例如190S，表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在108位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在101和103和190位密码子突变，例如190A，表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在106和189和181和227位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。同样，使用本发明的手段和方法证实HIV逆转录酶存在188和100和103位密码子突变表示现有或将来的NNRTI治疗的有效性已经被降低。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在236和103和/或181位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现这3个突变的确与地拉呋啶(delavirdine)抗性相关，运用表型敏感性分析发现这3个突变的确与耐呋络平(nevirapine)抗性相关。在又一个实施方案中，HIV逆转录酶236位突变的密码编码亮氨酸(L)。在一个进一步的实施方案中，逆转录酶在103密码子突变、181密码子突变或二者一并突变并伴随HIV逆转录酶236位密码子突变。在又一个进一步的实施方案中，103突变密码编码天冬酰胺(N)，并且103突变密码编码半胱氨酸(C)。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价患者NNRTI抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在225和103位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶225密码单独突变或与103位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，而对耐呋络平(nevirapine)敏感性不产生影响。在又一个实施方案中，225突变密码编码组氨酸，230密码编码亮氨酸，181密码编码半胱氨酸。

本发明提供了一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码181密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现181密码子突变的确与地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度减少、耐呋络平(nevirapine)敏感性明显减少和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性不变相关。在一个实施方案中，181突变密码编码异亮氨酸。

本发明提供了一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码188密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现188密码子突变的确与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性显著降低相关。在一个实施方案中，188突变密码编码半胱氨酸、组氨酸或亮氨酸。

本发明提供了一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码190密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现190密码子突变的确与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性大幅度降低相关。在一个实施方案中，190突变密码编码丙氨酸或丝氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在230和181位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶230密码单独突变或与181位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在138和188位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶138密码单独突变或与188位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性中度降低。在又一个实施方案中，138突变密码编码丙氨酸、188突变密码编码亮氨酸。

本发明提供了一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码98密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现98密码子突变的确与地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低、耐呋络平(nevirapine)敏感性轻微降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低相关。在一个实施方案中，98突变密码编码甘氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在98和190位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶98密码单独突变或与190位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。在又一个实施方案中，190突变密码编码丝氨酸、98突变密码编码甘氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在181和98位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶181密码单独突变或与98位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低。在又一个实施方案中，98突变密码编码甘氨酸、181突变密码编码半胱氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在101和190位密码子突变，例如190S的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶101密码单独突变或与190位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性不变，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。在又一个实施方案中，190突变密码编码丝氨酸、101突变密码编码谷氨酸。

本发明提供了一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，包括：(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码108密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现108密码子突变的确与地拉呋啶(delavirdine)敏感性不变、耐呋络平(inevirapine)敏感性轻微降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性不变相关。在一个实施方案中，108突变密码编码异亮氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在101和190位密码子突变，例如190A的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶101密码单独突变或与190位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性不变，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性显著降低。在又一个实施方案中，190突变密码编码甘氨酸、101突变密码编码谷氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在103和190位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶103密码单独突变或与190位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性显著降低。在又一个实施方案中，190突变密码编码丙氨酸、103突变密码编码天冬酰胺。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在106和181位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶106密码单独突变或与181位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性显著降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。在又一个实施方案中，106突变密码编码丙氨酸、181突变密码编码半胱氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在106和189位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶106密码单独突变或与189位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性不变。在又一个实施方案中，189突变密码编码亮氨酸、106突变密码编码丙氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在106和227位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶106密码单独突变或与227位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性轻微降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低。在又一个实施方案中，227突变密码编码亮氨酸、106突变密码编码丙氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在181和227位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶181密码单独突变或与227位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性增加，对耐呋络平(nevirapine)敏感性显著降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性增加。

在又一个实施方案中，227突变密码编码亮氨酸，181突变密码编码半胱氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在106和181和227位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶106密码单独突变或与181和227位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性轻微降低。

在又一个实施方案中，106突变密码编码丙氨酸，181突变密码编码半胱氨酸，和227密码编码亮氨酸。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在103和188位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶103密码单独突变或与188位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性实质降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。在又一个实施方案中，188突变密码编码亮氨酸，103突变密码编码天冬酰胺。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在100和103位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶100密码单独突变或与103位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。

在又一个实施方案中，100突变密码编码异亮氨酸，103突变密码编码天冬酰胺。

本发明又一个优选的、非限定性特定实施方案如下：一种评价对HIV感染的患者进行抗逆转录病毒治疗有效性的方法，(a)从HIV感染的患者中采集生物样品；和(ⅱ)确定生物样品是否包含有编码在100和103和188位密码子突变的HIV逆转录酶的核酸，运用表型敏感性分析发现HIV逆转录酶100密码单独突变或与103和188位密码同时突变引起地拉呋啶(delavirdine)敏感性实质降低，对耐呋络平(nevirapine)敏感性中度降低和艾发呋瑞兹(efavirenz)敏感性实质降低。

在又一个实施方案中，100突变密码编码异亮氨酸，103突变密码编码天冬酰胺，以及188密码编码亮氨酸。

本发明还提供了使用抗性试验载体的手段和方法，载体含有HIV基因，更进一步地含有药物筛选所需的NNRTI突变。尤其是，本发明描述了包含有HIV逆转录酶的抗性试验载体，逆转录酶具有药物筛选所需的225和103密码子突变。本发明还描述了包含有在236和103和/或181密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体，本发明还描述了包含有在190(G190A)和103(K103N)密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体，本发明还描述了包含有在190(G190S)和101(K103E)密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在230和181密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在181密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在188密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在138和188密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在98密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在98和190密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在181和98密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在101和190密码子突变，例如190S的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在108密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在101和103和/或190密码子突变，例如190A的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在106和189和/或181和/或227密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明还描述了包含有在188和100和/或103密码子突变的HIV逆转录酶抗性试验载体。

本发明进一步涉及用于分离和鉴定非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂抗性突变株的新型载体、宿主细胞及组份，以及使用这些载体、宿主细胞和组份实施抗病毒筛选。本发明还涉及根据其抑制所述突变株的能力筛选候选药物。

实施例1

使用抗性试验载体测定药物表型敏感性和抗性

使用PCT国际申请(申请号No.PCT/US/01609，申请日1997年1月29)上所述手段和方法进行药物表型敏感性和抗性试验。

这些试验中有一段来自患者的片段(PDS)。这个片段，或者是通过从HIV患者血清中的病毒粒子里分离出病毒RNA，再利用逆转录-聚合酶链式反应从病毒RNA中扩增出来的一段片段；或者是对抗性试验载体DNA父系克隆进行定点突变，所获得的野生型HIV-1突变体。这段来自患者的片段对应于HIV蛋白酶和逆转录酶区域。使用标准操作程序分离病毒RNA，例如RNAgents Total RNA Isolation System(普洛麦格公司，美国威斯康星州麦迪逊)或RNAzol(泰尔-泰施特公司，美国得克萨斯州福兰德伍德)。逆转录-聚合酶链式反应操作程序分为两步。利用逆转录病毒的逆转录酶，例如Moloney MuLV的逆转录酶(罗氏分子系统公司，美国新泽西州布兰奇堡)，或者禽成髓细胞性白血病病毒AMV的逆转录酶(宝灵曼公司，美国印第安那州印第安纳波利斯)，从病毒RNA复制cDNA。然后使用热稳定性DNA聚合酶扩增cDNA，例如Taq酶(罗氏分子系统，美国新泽西州布兰奇堡)，Tth酶(罗氏分子系统，美国新泽西州布兰奇堡)，PrimeZyme酶(从栖热菌属brockianus中分离，生物统计公司，德国歌廷根)扩增cDNA，或按“长片段PCR”的描述使用组合使用热稳定性聚合酶(Barnes,W.M.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci,USA91,2216-2220)[例如扩增高保真PCR(Taq+Pwo)(宝灵曼公司，美国印第安那州印第安纳波利斯)或GeneAmp XL PCR试剂盒(Tth+Vent)，(罗氏分子系统公司，美国新泽西州布兰奇堡)]。使用ApaⅠ引物(PDSApa)和AgeⅠ引物(PDSAge)扩增来自病人的片段，通过在PCR产物5’和3’端分别引入ApaⅠ和AgeⅠ酶切位点，请分别参见见PCT国际申请，申请号PCT/US97/0169，申请日1997年1月29日。

按PCT国际申请(申请号PCT/US97/01609，申请日1997年1月29日)中所述的方法，以病毒RNA作为模板，以寡聚核苷酸PDSApa和PDSAge为引物，进行逆转录-聚合酶链式反应扩增该片段，然后用ApaⅠ和AgeⅠ或同裂酶PINAI消化制备1.5KB的DNA产物，通过逆转录-PCR掺入来自于患者的“试验”片段构建抗性试验载体。为保证在对应于所合成抗性试验载体的质粒DNA中含有特定患者血清中HIV病毒准种的代表性样本，在构建特定抗性试验载体时采集大肠杆菌转化体，将大量(＞100)独立的大肠杆菌转化体合并作为制备质粒DNA。

一个编码兼嗜性逆转录病毒MuLV 4070A env基因产物的包装表达载体，能够在抗性试验载体宿主细胞中合成抗性试验载体病毒颗粒。此颗粒能有效感染人靶细胞。除了env基因以外，编码其它所有HIV基因的抗性试验载体都被用来转染一种包装的宿主细胞(一旦宿主细胞被转染，就称其为抗性试验载体宿主细胞)。编码兼嗜性逆转录病毒MuLV4070A env基因产物的包装表达载体和抗性试验载体一起被用于在抗性试验载体宿主细胞中合成具有伪型特征的(pseudotyped)抗性试验载体侵染性颗粒。

在利用抗性检测进行抗性试验时，使用了包装宿主和靶宿主细胞。靶宿主细胞是人胚胎肾细胞系293(细胞培养设备公司，美国加州大学旧金山分校)或Jurkat白血病T细胞系(Arthur Weiss，美国加州大学旧金山分校)。

使用抗性试验载体在两种类型的宿主细胞中进行抗性试验。抗性试验载体的病毒颗粒由第一种宿主细胞(抗性试验载体宿主细胞)产生，利用使用抗性试验载体和包装表达载体共同转染一个包装宿主细胞，制备该抗性试验载体宿主细胞。然后用抗性试验载体病毒颗粒感染第二种宿主细胞(靶宿主细胞)，在靶宿主细胞中检测报告基因的表达。

构建带有一个功能性荧光素酶的基因盒的抗性试验载体，并用该抗性试验载体DNA转染宿主细胞。抗性试验载体带有来自患者的序列，此序列包括逆转录酶和蛋白酶序列，它们对抗逆转录病毒药剂(如核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷酸逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)具有敏感性或抗性。用抗性试验载体DNA转染宿主细胞，产生抗性试验载体病毒粒子。无论蛋白酶抑制剂存在与否，用该载体DNA感染靶细胞，靶细胞生长时不加NRTI或NNRTI药物，或药物浓度不断增加的环境中。存在药物时被感染的靶细胞中产生的荧光素酶活性数量与不加药物时被感染靶细胞产生荧光素酶的量相比较。用抑制不加药物时荧光素酶活性的50％所需要的药量(半数抑制浓度，IC50)来测量药物抗性。用抑制百分数对Log₁₀药物浓度作图，测定IC50值。

宿主细胞接种于直径10cm的培养皿中，加入抗性试验载体质粒DNA和包被表达载体模板，数天后用磷酸钙法进行转染。转染后1到24小时内，用新鲜细胞培养基替换含DNA沉淀的培养基。转染后1到4天内，收获含有抗性试验载体病毒颗粒的细胞培养基，用0.45mm的滤膜过滤后在-80℃保存。收获的细胞培养基中HIV衣壳蛋白(p24)表达水平用EIA方法，按厂商说明书(SIAC公司，美国马里兰州佛勒德利克)。感染前，先将靶细胞(293和293/T)接种到细胞培养基中。感染实验对照组是(不含DNA的)伪转染或不含包膜表达质粒的抗性试验载体质粒DNA转染。感染后1到3天或更多天以后弃去培养基，向每孔中加入细胞裂解缓冲液(普洛麦格公司)。检测细胞裂解物的荧光素酶活性(图3)。通过以下方程计算药物抑制效果：

％荧光素酶抑制率=1-(RLUluc[_药物]/RLUluc)×100

其中RLUluc[_药物]为存在药物时被感染细胞荧光素酶活性的相对光单位，RLUluc是不存在药物时被感染细胞的荧光素酶活性的相对光单位。用荧光素酶活性抑制百分比对的log₁₀药物浓度作图，从此S形曲线上找到IC50值。药物抑制曲线见图3。

实施例2：分析基因型建立基因型与表型敏感性之间的关联性

患者HIV样本的表型敏感性分析

如实施例1中所述构建抗性试验载体。对抗性试验载体或来自抗性试验载体库的克隆进行表型敏感性试验，准确而定量地测定一系列抗逆转录病毒药物的敏感水平。这组抗逆转录病毒药物可能包括所说的核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs)类药物、非核苷酸逆转录酶抑制剂(NNRTIs)类药物及蛋白酶抑制剂(PRIs)类药物。如果有新药或新药物靶可利用则可扩大这组药物。在每一个抗性载体库上，测定每一个试验药物的半数抑制浓度IC50。将所有试验药物的敏感性模型与已知的敏感性模型进行比较。可以对患者样本做进一步检查，找出与已观察到的敏感性模型相关的基因型变化。

患者HIV样本基因型分析

用实施例2中所述的基因测型方法分析抗性试验载体库或其克隆。在本发明的一个实施方案，纯化病毒RNA进行逆转录-PCR扩增，用ABI链终止子方法自动测序。测出序列与数据库中的对照序列进行比较。或者，如有可能，与在患者接受治疗之前所采集的样本比较。检查该基因型序列，找出不同于对照或治疗前样本的序列，并建立与所观察到的表型之间的相关性。

定点突变体基因型敏感性分析

在背景明确的野生型背景下，构建带有特定突变的抗性试验载体，观察基因型变化和表型敏感性，分析两者之间的关联性。突变可以单独导入抗性试验载体；或与其它药物抗性突变组合导入抗性试验载体。这些药物抗性突变被认为调节了HIV对某一特定药物或一类药物的敏感性。可用任何一种广为人知的定点突变方法将突变导入抗性试验载体。在本发明的一个实施方案中，使用大引物PCR方法进行定点突变。然后按照前面所述的表型敏感性分析方法，对带有特定突变或一组突变的抗性试验载体进行的测定。测得的敏感性图与另一野生型抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，缺乏特定突变。观察对试验中抗逆转录病毒药物敏感性表型发生的变化，这些变化归因于导入抗性试验载体的特定突变。

实施例3

建立P225H基因型分析与表型敏感性的关联性

患者97-302表型分析

如实施例1所述用患者97-302样本构建抗性试验载体。该患者接受过大约10个月d4T、indinavir和DMP-226治疗。分离病毒RNA，进行逆转录-PCR扩增出一段来自患者的片段。该片段包括了编码蛋白酶全长及逆转录酶1-313氨基酸的病毒片段。将该片段插入带有报告基因的病毒载体内，得到抗性试验载体命名为RTV-302。使用表型敏感性试验准确而定量地测定RTV-302对一系列抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这些药物包含所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTIs(地拉呋啶，耐呋络平)及PRIs(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。测定每一试验药物的半数抑制浓度IC50。检测患者病毒对每一个试验药物的敏感性并与已知的敏感性模型比较。观察到患者RTV-302对NNRTI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，耐呋络平敏感性显著降低(抗性增加)，地拉呋啶敏感性中度降低(见图8A)。进一步检测患者97-302样本找到与所观察到敏感性模型相关的基因型变化。

患者97-302基因型的确定

使用ABI链终止子法自动测定RTV-302的DNA序列。核苷酸序列同野生型分枝B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos,NM)比较，找出与对照序列不同的序列。在逆转录酶K103N,T200A及P225H位点发现突变。K103N与NNRTI类药物抗性相关，使用表型敏感性试验已经证明K103N突变与地拉呋啶及耐呋络平抗性下降相关，降低程度相等。已知在HIV野生型(药物敏感)变体之间，1135M和T200A位点具有序列多态性。利用定点突变和表型敏感性分析，鉴定P225H突变，建立225位氨基酸变化与NNRTI类药物敏感性之间的关联性。

定点诱变

构建抗性试验载体，使其带有P225H突变，或者同时还带有含有其它一些药物抗性突变(K103N,Y181C)。已知这些药物抗性突变能调节HIV对NNRTI类药物敏感性。使用大引物PCR方法将定点突变导入抗性试验载体(Sakar G和Sommar SS(1994)Biotechniques8(4),404-407)。使用以前所述的表型敏感性试验，检测含有P225H突变的抗性试验载体，并另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在225位点为野生型。与野生型RTV比较，NNRTI类药物地拉呋啶的敏感性模型发生改变。P225H-RTV处于野生型背景，仅含有P225H突变时。与野生型对照RTV比较，P225H-RTV对地拉呋啶更加敏感。P225H-RTV对耐呋络平的敏感性没有显著变化。P225H突变还导入到一个还含有其它突变(K103N,Y181C或K103N+Y181C)的RTV。在所有情形之下，相应于与不带P225H突变的RTV载体，带有P225H突变的RTV载体对地拉呋啶抑制更加敏感(Fig.8D)。在所有情形之下，P225H突变不会显著改变耐呋络平敏感性(Fig.8D)。

实施例4

建立HIV P236L位点基因型与表型之间的关联性

HIV患者97-268样本的表型分析

如实施例1中所述，用患者97-268样本构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物治疗：AZT和3TC (NRTI类药物)；indinavirhe和saquinavir(PRJ类药物)；以及地拉呋啶(NNRTI类药物)。治疗时间在1个月到2个月之间。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生的抗性试验载体，命名为RTV-268。然后对RTV-268进行表型试验，准确而定量地测定RTV-268对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查患者病毒对每一种试验药物的敏感性，并与对照病毒的敏感性比较。观察到患者样本RTV-268对NNTRI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，病毒样本对地拉呋啶具有抗性而对耐呋络平不具有抗性。进一步检查该样本找出敏感性模型相关的基因型变化。

HIV患者97-268的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-268 DNA自动测序。所得核酸序列，与野生型进化枝B HIV-1(新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。分析该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在逆转录酶如下位点发现突变：M41L,D67N,M184V,T200A,E203D,L210W,T215Y,K219Q和P236L。已知在HIV野生型(药物抗性)变体之间，T200A和E203D处突变具有序列多态性。在M41L,D67N,L210W,T215Y和K219Q位点处突变与AZT抗性相关。M184V位点的突变与3TC抗性相关。P236L位点的突变与地拉呋啶抗性相关，并与耐呋络平敏感性增加相关(Dueweke等，Ibid.)。与以前报道相反，RTV-268样本对耐呋络平敏感性没有改变。利用定点突变和体外敏感性表型试验，鉴定P236L突变，以建立236位氨基酸改变与表型敏感性改变之间的关联性。

定点突变

制备抗性试验载体，使这些载体仅带有P236L突变，或者还同时带有已知与抗药性相关的其它突变(K103N,Y181C)。已知这些与抗药性相关突变可调节HIV-1对NNTRI类药物的敏感性。利用大引物PCR方法，进行定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变导入抗性试验载体。抗性试验载体P236L-RTV含有P236L突变。对P236L-RTV进行表型敏感性分析，将试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在236位点是野生型。试验结果证明P236L-RTV对NNRTI类药物的敏感性改变了。P236L-RTV处于野生型背景，仅含有P236L突变，对地拉呋啶的敏感性不如野生型对照RTV。与Dueweke等人的报道相反，观察到P236L突变并没有使耐呋络平敏感性发生显著改变。P236L突变还被导入带有K103N和(或)Y181C突变的RTV载体上。与相应的不带有P236L突变的RTV比较，在所有的情况下，带有P236L突变的RTV对地拉呋啶都不如前者敏感(抗性更高)。在所有的情况下，P236L突变不会显著改变耐呋络平敏感性。

实施例5

建立HIV G190S位点基因型与敏感性表型之间的关联性

HIV患者97-644样本的表型分析

如实施例1中所述，用患者97-644样本构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物治疗：d4T(NRTI类药物)；indinavir(PRI类药物)；以及艾发呋瑞兹(NNRTI类药物)。治疗时间从5个月到17个月不等。分离病毒RNA进行逆转录-PCR反应，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入带有报告基因的病毒载体内，产生的抗性试验载体，命名为RTV-644。然后对RTV-644进行表型试验，准确而定量地测定RTV-644对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查患者病毒对每一种试验药物的敏感性，并与一种对照病毒比较。观察到患者样本RTV-644对NNRTI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，病毒样本对耐呋络平具有抗性而对地拉呋啶几乎不具有抗性。进一步检查该样本找出与敏感性模型相关的基因型变化。

HIV患者97-644的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-644 DNA自动测序。所得核酸序列，与野生型进化枝B HIV-1(新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。分析该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在逆转录酶K101E和G190S位点发现突变。已知在HIV野生型(药物敏感)变体之间，位于T200A和E203D两位点处的突变具有序列多态性。在L101E位点处突变与一些NNRTI类药物敏感性相关，但并不是与全部NNRTI类药物敏感性都相关。G190A突变和G190S突变均与耐呋络平和loviride抗性相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，鉴定G190S和G190A突变，以建立190位氨基酸变化与表型敏感性变化之间的关联性。

定点突变

构建带有G190S和G190A突变的抗性试验载体。利用大引物PCR反应，进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变导入抗性试验载体。抗性试验载体G190S-RTV带有G190S突变，G190A-RTV带有G190A突变。利用表型敏感性试验突分析G190S或G190A的敏感性，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在G190位点为野生型。G190S-RTV和G190A-RTV对NNRTI类药物敏感性都发生了改变。在野生型背景下，这些RTV对耐呋络平敏感性显著低于野生型对照RTV，对地拉呋啶敏感性则稍强于野生型对照RTV。

实施例6

通过鉴定HIV-1逆转录酶中氨基酸变化预测对非核苷酸逆转录酶抑制剂的反应

HIV-1逆转录酶236位氨基酸突变的表型与基因型之间的相关性

在本发明的一个实施方案中，使用如下方法评价HIV-1逆转录酶蛋白质236位氨基酸变化引起的效应，这些方法包括：(ⅰ)收集HIV-1感染者生物样本；(ⅱ)判断该生物样本中编码HIV-1逆转录酶的核酸序列在密码子236位是否发生突变；密码子236位突变(P236L)与地拉呋啶敏感性降低相关，而耐呋络平敏感性则没有改变。

这些生物样本由全血和血液组分组成，包括外周血单核细胞(PBMC)、血清、血浆(使用不同的抗凝剂制备的血浆，例如EDTA、柠檬酸-葡萄糖、肝素)、组织活检、脑脊液(CSF)，或者其它细胞、组织或体液。在本发明的另一个实施方案中，可以直接从生物样本中分离HIV-1核酸或逆转录酶蛋白；或者先从生物样本中纯化出病毒颗粒然后再从中分离HIV-1核酸(基因组RNA)或逆转录酶蛋白。可以使用不同的方法分析HIV-1逆转录酶第236位密码子是否发生突变，例如直接鉴定编码HIV-1逆转录酶的病毒核酸或直接鉴定HIV-1逆转录酶蛋白本身。可以利用经典或新型蛋白测序方法直接鉴定逆转录蛋白，或者利用抗体或其它特异的结合蛋白或化合物进行表位识别，都能测定HIV-1逆转录酶第236位氨基酸。此外，还可以通过扩增和鉴定编码逆转录酶蛋白的HIV-1核酸序列，测定HIV-1逆转录酶第236位氨基酸。有许多方法可用来扩增HIV-1核酸序列，这些方法包括逆转录-PCR反应、NASBA、SDR、RCR或3SR，这些方法只要具有普通技能的技术人员就能知道。直接测定编码HIV-1逆转录酶的核酸序列就可以判断第236位密码子是否发生突变，测定核酸序列可以用引物延伸-链终止法(SANGER,ABI/PE and Visible Genetics)或链断裂法(Maxam andGilbert)；或者例如飞行时间质谱(matrix assistedlaser desorptoin-ionizationtime of flight,MALDI-TOF)、质谱(Sequenom,Gene Trace Systems)这些新近开发的测序方法。此外，也可利用各种探针杂交方法测定编码236位氨基酸的核酸序列，例如基因芯片杂交测序技术(Affymetrix)，狭缝杂交技术(LiPA；Murex)，以及差异杂交技术(Chiron)。

在本发明一个首选实施方案中，使用从生物样本中制备的抗性试验载体DNA进行敏感性表型分析，对生物样本中HIV-1逆转录酶236位的氨基酸是野生型还是突变型进行了测定。在一个实施方案中，收集血浆样本，纯化病毒RNA并用逆转录-PCR反应技术扩增出一段编码HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域来自患者的核酸片段。经过DNA连接和细菌转化，将这段来自患者的扩增片段掺入一个带有报告基因的病毒载体内，从而产生一个抗性试验载体。从细菌培养物分离抗性试验载体，并按实例1中所述进行敏感性表型试验。试验结果与一个发生P236L突变患者样本进行比较。用荧光检测链终止循环测序法(ABI/PE)，测定患者268样本中HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的核酸(DNA)序列。该方法被用来测定代表送检样本中混合存在的各种HIV-1变体的共有序列(代表准种)。该方法也被用来测定每种变体的核酸序列。

患者样本的表型敏感性图和定点突变证明地拉呋啶和耐呋络平敏感性与HIV-1逆转录酶103位，181位，或236位不发生突变相关。患者样本的表型敏感性图和定点突变证明地拉呋啶敏感性的显著降低(抗性增加)。在编码HIV-1逆转录酶103位，181位不发生突变时，236位氨基酸L的核酸序列发生突变，与之相关的耐呋络平敏感性却几乎没有降低。

患者样本的表型敏感性图和定点突变证明，在逆转录酶103位，181位或103位+181位氨基酸出现突变(K103N,Y181C,或K103N+Y181C)时，236位脯氨酸并不引起delvirdine或耐呋络平敏感性进一步增加。然而，患者样本的表型敏感性图和定点突变证明在与NNRTI抗性相关联的逆转录酶突变(K103N,Y181C，或K103N+Y181C)之外，236位L引起地拉呋啶敏感性进一步降低(抗性增加)而对耐呋络平的敏感性则几乎没有进一步降低。

HIV-1逆转录酶225位氨基酸突变的表型与基因型之间的相关性

利用患者样本的表型敏感性图和定点突变体证明，在不出现与NNRTI抗性相关的逆转录酶突变(K103N,Y181C)时，HIV-1逆转录酶225位出现脯氨酸不会引起地拉呋啶或耐呋络平敏感性的改变。然而，利用患者样本的表型敏感性图和定点突变体也证明，在不出现与NNRTI抗性相关的逆转录酶突变(K103N,Y181C)时，225位出现组氨酸引起地拉呋啶敏感性增加而耐呋络平敏感性几乎没有变化。

利用患者样本的表型敏感性图和定点突变体证明除了产生与NNRTI抗性相关的逆转录酶突变(K103N,Y181C或K103N+Y181C)之外，225位出现脯氨酸不引起地拉呋啶和耐呋络平敏感性进一步降低。与此相反，利用患者样本的敏感性表型和定点突变体证明在逆转录酶出现与NNRTI抗性相关的突变(K103N,Y181C或K103N+Y181C)时，225位出现组氨酸引起地拉呋啶敏感性增加，而耐呋络平敏感性则几乎没有变化。

在HIV-1逆转录酶190位氨基酸突变的基因型和表型之间的关联性

利用患者样本的表型敏感性图和定位突变证明，在逆转录酶不出现与NNRTI类药物抗性相关的突变(K103N,Y181C)时，如果在190位出现G，不引起地拉呋啶和耐呋络平敏感性改变。利用定点突变体的表型敏感性图证明，在逆转录酶不出现与NNRTI类药物抗性相关的突变时，在190位出现A，将引起地拉呋啶敏感性增加，耐呋络平敏感性降低。利用患者样本表型敏感性图和定点突变体证明，在逆转录酶不出现与NNRTI抗性相关的突变时，190位出现S引起地拉呋啶敏感性增加和耐呋络平敏感性降低。

实施例8

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV Y181I位点基因型和NNRTI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者HIV样本98-964的表型

如实例1所述，用患者样本98-964构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物的治疗：ddI,d4T,AZT,3TC和ddC (NRTI类药物)；saquinavir和nelfinavir(PRI类药物)；耐呋络平(NNRTI类药物)和HU。分离病毒RNA进行逆转录-PCR反应，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。将这个片段插入一个带有报告基因的病毒载体内，得到一个抗性试验载体，命名为RTV-964。然后对RTV-964进行表型分析，准确定量地测定其对一组抗逆转录病毒药物的敏感性。这组药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir，和saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检察抗性试验载体对每一种试验药物的敏感性模型，与已知的药物敏感性模型比较。观察到患者RTV-964对NNRTI类药物的一种敏感性模型。在此模型中，RTV-964对地拉呋啶的敏感性发生中度降低(10倍)，而对耐呋络平的敏感性则显著降低(750倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-964 DNA自动测序。所得核酸系列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出不同于对照的序列。与对照序列相比较，在载体RTV-964中如下位置发现突变：M41L,K43E,D67N,K70R,L74I,V75S,Y181I,R211T,T215Y,D218E和K219Q。M41L,D67N,K70R,L74I,V75S,T215Y和K219Q与NRTI类药物抗性相关。已知在HIV的各种野生型(药物敏感)变体之间，R211T位突变具有序列多态性。以前已经证明Y181I与耐呋络平高水平抗性相关。我们用定点突变和体外敏感性表型试验检查突变Y181I，建立基因型变化与表型之间的关联性。

利用定点突变证明HIV特定突变在抗逆转录病毒敏感性(表型)中的作用

利用大引物PCR方法进行定点突变，将突变Y181I导入抗性试验载体(Sakar和Sommar,Ibid.)。抗性试验载体Y181I-RTV带有Y181I突变。按前面所述方法对Y181I-RTV进行表型试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在181位点为野生型。我们在Y181I-RTV载体上测定了NNRTI类药物地拉呋啶，耐呋络平和艾发呋瑞兹的敏感性模型。Y181I-RTV仅含有Y181I突变，处于野生型背景。与野生型对照RTV比较，地拉呋啶敏感性中度降低(20倍)，耐呋络平敏感性显著降低(740倍)，对艾发呋瑞兹表现出野生型敏感性(1.4倍)。

实施例9

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV Y188位点基因型和与NNRTI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者HIV样本97-300的表型

如实例1所述，用患者样本97-300构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物的治疗：d4T和3TC(NRTI类药物)；indinavir(PRI类药物)；和艾发呋瑞兹(NNRTI类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR反应，扩增到一段来自患者的核酸片段(PDS)。该片段包括了病毒用于编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的核酸序列。将这个片段插入一个带有报告基因的病毒载体内，得到一个抗性试验载体，命名为RTV-300。然后对RTV-300进行表型分析，准确定量地测定其对一组抗逆转录病毒药物的敏感性。这组药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，efarenz和耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查抗性试验载体对每一种试验药物的敏感性模型，与已知的药物敏感性模型比较。观察到患者RTV-300对NNRTI类药物的一种敏感性模型。在此模型中，RTV-300对地拉呋啶的敏感性发生中度降低(25倍)，而对耐呋络平敏感性则有实质性地降低(大于800倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子对RTV-300 DNA自动测序。所得核酸系列，与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在载体RTV-300中，发现如下突变：K32N,M184V和Y188L。M184V与3TC抗性相关。以前已经证明突变Y188L与艾发呋瑞兹高水平抗性相关。已有报道说用数种NNRTI类药(E-ePseU,E-EPS,HEPT，耐呋络平，BHAP,U-8720,TIBO R82913,Loviride)治疗，筛选Y188位的其它突变，即Y188C和Y188H。我们用定点突变和体外敏感性表型试验检查Y188L突变，建立基因型改变与表型之间的关联性。

利用定点突变技术证实HIV中特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR方法进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.),将突变Y188L导入抗性试验载体。抗性试验载体Y188L-RTV含有Y188L突变。应用早先描述的表型试验方法，对抗性试验载体Y188L-RTV进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在188位点为野生型。我们在抗性试验载体Y181L-RTV上，测定NNRTI类药物地拉呋啶，耐呋络平和艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。Y188L-RTV处于野生型背景下，只含有Y188L突变。相对于野生型对照RTV，Y188L-RTV对地拉呋啶的敏感性有轻微降低(9倍)，对耐呋络平敏感性有实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹的敏感性有显著降低(109倍)。对艾发呋瑞兹的敏感性降低大约100倍，这个数值没有以前报道的那样高。

应用定点突变技术证实HIV中特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

利用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变Y188C导入抗性试验载体。抗性试验载体Y188C-RTV含有Y188C突变。应用早先描述的表型试验方法，对Y188C-RTV进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在188位点为野生型。我们在抗性试验载体Y188C-RTV上，测定NNRTI类药物地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。Y188C-RTV处于野生型背景下，只含有Y188C突变。相对于野生型对照RTV,Y188C-RTV对地拉呋啶的敏感性有轻微降低(3倍)，对耐呋络平敏感性有中度降低(30倍)，对艾发呋瑞兹敏感性也中度降低(20倍)。

应用定点突变技术证实HIV中特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.),将突变Y188H导入抗性试验载体。抗性试验载体Y188H-RTV含有Y188H突变。应用早先描述的表型试验方法，对Y188H-RTV进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在188位点为野生型。我们在抗性试验载体Y188H-RTV上，测定NNRTI类药物地拉呋啶和耐呋络平的表型敏感性模型。Y188H-RTV处于野生型背景，只含有Y188H突变。相对于野生型对照RTV,Y188H-RTV对耐呋络平的敏感性有中等程度降低(3.5倍)。没有测定对艾发呋瑞兹的敏感性。

实施例10

应用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV E138和Y188位点基因型和与NNRTI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者HIV样本97-209的表型

如实例1所述，用患者样本97-209构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物的治疗：AZT,ddI,d4T和3TC(NRTI类药物)；indinavir(PRI类药物)；和adefovir(NNRTI类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR反应，扩增到一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。将这个片段插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生一个抗性试验载体，命名为RTV-209。然后对RTV-209进行表型分析，准确定量地测定其对一组抗逆转录病毒药物的敏感性。这组药物包括了所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查抗性试验载体对每一种试验药物的敏感性模型，与已知的药物敏感性模型比较。观察到患者RTV-209对NNRTI类药物的敏感性模型。在此模型中，RTV-209对地拉呋啶的敏感性中度降低(75倍)，而对耐呋络平的敏感性则有实质性降低(大于800倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子对RTV-209 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在载体RTV-209中如下位置发现突变：A62V,S68G,V76I,F77L,F116Y,E138A,Q151M,M184V,Y188L和E291D。在A62V,V75I,F77L,F116,Q151M和M184V这些位点上的突变与NRTI类药物抗性相关。以前已经证明E138K位点突变与数种NNRTI类药物抗性相关联，Y188L位突变与艾发呋瑞兹敏感性降低相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了突变Y188L和E138A，建立基因型变化与表型之间的关联性。

利用定点突变技术证实HIV中特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.),将突变E138A单独导入或者与Y188L一起导入抗性试验载体。抗性试验载体E138A-RTV含有突变E138A，抗性试验载体E138A-Y188L-RTV含有E138A和Y188L两个突变。应用早先描述的表型试验方法，对这两个抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在138位点为野生型。我们在抗性试验载体E138A-RTV,Y188L-RTV和E138A-Y188L-RTV上测定NNRTI类药物地拉呋啶，耐呋络平和艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。E138A-RTV只含有E138A突变。相对于野生型对照RTV,E138A-RTV对地拉呋啶敏感性处于野生型水平(1.6倍)，对耐呋络平敏感性处于野生型水平(1.3倍)，对艾发呋瑞兹敏感性处于野生型水平(1.4倍)；Y188L-RTV对地拉呋啶敏感性轻微降低，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，而对艾发呋瑞兹敏感性显著降低(110倍)；E138A-Y188L-RTV对地拉呋啶和艾发呋瑞兹的敏感性均中度降低，地拉呋啶降低75倍，艾发呋瑞兹降低88倍，对耐呋络平的敏感性发生实质性降低(大于800倍)。与单独突变(指E138A或Y188L单个突变)时所观察到的效应相比较，组合突变(指E138A和Y188L双突变)对地拉呋啶敏感性的效应增加了。

实施例11

应用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV A98位点基因型和与NNRTI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者HIV样本98-675的表型

如实例1所述，用患者样本98-675构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物的治疗：ddI,AZT和3TC(NRTI类药物)；saquinavir和nelfinavir(PRJ类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR反应，扩增到一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒核酸序列。将这个片段插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生一个抗性试验载体，命名为RTV-675。然后对RTV-675进行表型分析，准确而定量地测定其对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组药物包括通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，艾发呋瑞兹和耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查抗性试验载体对每一种试验药物的敏感性模型，与已知的药物敏感性模型比较。观察到患者RTV-675对NNRTI类药物的一种敏感性模型。在此模型中，观察到RTV-675对地拉呋啶敏感性处于野生型水平(2.1倍)，而对耐呋络平的敏感性则有轻微降低(6倍)。

测定患者HIV样本的基因型

利用ABI链终止子法对RTV-675 DNA自动测序。所得核酸序列，与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列；在如下位点发现突变：M41L,S48T,L74V,A98G,M184V,T215Y。这些突变与NRTI类药物抗性相关。以前已经证明在A98G位点上的突变与耐呋络平抗性相关。利用定点突变和体外表型敏感性试验，我们检查A98G突变以建立基因型变化与表型之间的关联性。

利用定点突变技术证明HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

利用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变A98G导入抗性试验载体，产生带有该突变的抗性试验载体A98G-RTV。应用早先描述的表型试验方法，对这个抗性试验载体进行抗性试验。试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，在98位点为野生型。我们在A98G-RTV上测定NNTRI类药物地拉呋啶，耐呋络平，艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。A98G-RTV处于野生型背景，只有A98G突变。相对于野生型对照RTV,A98G-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低了3倍，对耐呋络平敏感性轻微降低了8倍，对艾发呋瑞兹轻微降低了3倍。

实施例12

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV A98和G190位点基因型与NNTRI类药物抗性敏感性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者B HIV样本的表型

如实施例1中所述，用患者B样本构建抗性试验载体。不清楚患者B所受过的抗逆转录病毒治疗。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括编码蛋白酶全长和逆转录酶1-133位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生的抗性试验载体，命名为RTV-B。从RTV-B库中筛选出单个克隆。然后对单个克隆进行表型试验，准确定量地测定RTV-B单个克隆对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，艾发呋瑞兹)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体克隆上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查全部试验药物的敏感性模型，与已知的敏感性模型比较。观察到患者RTV-B克隆1对NNTRI类药物的一种敏感性模式。在该模型中，克隆1对地拉呋啶敏感性增加了0.55倍，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(640倍)，对艾发呋瑞兹敏感性显著降低(250倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-B克隆1DNA自动测序。所得核酸序列，与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出不同于对照的序列。与对照序列比较，在如下位点发现突变：M41L,A98G,M184V,L210W,R211,T215Y,E297A,G190S。M41L,M184V,L210W和T215Y与NRTI抗性相关。以前已经证明在A98G位点的突变与耐呋络平抗性相关。以前已经证明在G190A位点的突变与耐呋络平敏感性改变相关。对190位的其它突变，即由G突变为E,Q和T已有报道。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查突变A98G和G190S以建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证实HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

利用大引物-PCR技术进行定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变A98G和G190S单独或组合导入抗性试验载体。抗性试验载体A98G-RTV含有A98G突变；抗性试验载体G190S-RTV含有G190S突变，抗性试验载体A98G-G190S-RTV含有A98G和G190S双突变。应用早先描述的表型试验方法，对这三个带有突变的抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，其98和190位点都是野生型。在这三个载体上，我们测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平、艾发呋瑞兹的敏感性模型。A98G-RTV，处于野生型背景下，只含有A98G突变。相对于野生型对照RTV,A98G-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低了3倍，对耐呋络平敏感性轻微降低8倍，对艾发呋瑞兹敏感性中度降低了3倍。G190S-RTV处于野生型背景下，只含有G190S突变。相对于野生型对照RTV,G190S-RTV对地拉呋啶敏感性增加了0.5倍，对耐呋络平敏感性中度降低(75倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低了8倍。相对于野生型对照RTV,A98G-G190S-RTV对地拉呋啶敏感性增加了0.8倍，但对耐呋络平和艾发呋瑞兹敏感性均发生实质性降低，分别大于800倍和250倍。虽然观察到单独突变时艾发呋瑞兹敏感性只有轻微降低，A98G和G190S同时突变引起耐呋络平抗性的降低却大于两个单独突变抗性降低之和。

实施例13

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV Y181和A98位点基因型与NNTRI类药物抗性敏感性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并对患者98-1057样本进行表型分析

如实施例1中所述，用患者98-1057样本构建抗性试验载体。该患者以前接受过下列药物治疗：ddI,d4T,AZT和3TC(NRTI类药物)；saquinavir和indinavir(PRI类药物)；以及地拉呋啶(NNRTI类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生抗性试验载体，命名为RTV-1057。然后对RTV-1057进行表型试验。准确而定量地测定RTV-1057对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，艾发呋瑞兹，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查全部试验药物的敏感性模型，与已知的敏感性模型比较。观察到患者RTV-1057对NNTRI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，RTV-1057对地拉呋啶敏感性中度降低(35倍)，对耐呋络平敏感性显著降低(610倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-1057 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出不同于对照的序列。与对照序列比较，在如下位点发现突变：T39A,M41L,A62V,D67E,T69SST,A98G,I135T,Y181C,T200I和T215Y。这些突变与NNRTI类药物抗性相关。已知在HIV野生型(对药物敏感)变体之间，I135T和T200I突变具有序列多态性。以前已经证明在Y181C和A98G位点的突变与特定的NNRTI类药物抗性相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了突变Y181C和A98G以建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证实HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

利用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变Y181C和A98G单独或同时导入抗性试验载体。抗性试验载体Y181C-RTV含有Y181C突变；抗性试验载体A98G-RTV含有A98G突变，抗性试验载体Y181C-A98G-RTV含有A98G和G190S双突变。应用早先描述的表型试验方法，对这三个带有突变的抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，其181和98位点都是野生型。在这三个载体上，我们测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平、艾发呋瑞兹的敏感性模型。Y181C-RTV只含有Y181C突变，处于野生型背景下。相对于野生型对照RTV,Y181C-RTV对地拉呋啶的敏感性中度降低(35倍)，对耐呋络平敏感性显著降低(161倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(3倍)。相对于野生型对照RTV，A98G-RTV对地拉呋啶敏感性轻微降低(3倍)，对耐呋络平敏感性轻微降低(8倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(3倍)。相对于对照野生型RTV,Y181C-A98G-RTV对地拉呋啶敏感性显著降低(240倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(7倍)。这些数据说明，与Y181C和A98G单独突变相比较，两者同时突变引起耐呋络平敏感性降低的效应，大于两个单独突变引起抗性降低之和。

实施例14

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV K101和G190位点基因型与NNTRI类药物抗性敏感性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并对患者98-644和98-1060 HIV样本进行表型分析

如同实施例1中所述，用患者98-644 HIV样本构建抗性试验载体，命名为RTV-644。该患者以前接受过下列药物治疗：d4T(NRTI类药物)，indinavir(PRI类药物)，以及艾发呋瑞兹(NNRTI类药物)。如同实施例1中所述，用患者98-1060 HIV样本构建另一抗性试验载体，命名为RTV-1060。该患者以前接受过下列药物治疗：d4T(NRTI类药物)，indinavir(PRJ类药物)，以及艾发呋瑞兹(NNRTI类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生的抗性试验载体，分别命名为RTV-644和RTV-1060。然后对RTV-644和RTV-1060进行表型试验，准确而定量地测定它们对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查全部试验药物的敏感性模型，与已知的敏感性模型比较。观察到患者RTV-644对NNTRI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，RTV-644对地拉呋啶敏感性降低非常轻微(2.5倍)，对耐呋络平敏感性显著降低(600倍)。观察到患者RTV-1060对NNTRJ类药物的敏感性模型。在该模型中，RTV-1060对地拉呋啶敏感性表现为野生型水平(1.5倍)，对艾发呋瑞兹敏感性显著降低(900倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-1060 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在RTV-644中K101E和G190S位点发现突变。与对照序列比较，在RTV-1060中如下位点发现突变：K101E,G190S,T200A和T215Y。在T215位点的序列是野生型和突变型混合(存在)。以前已经证明在K101E位点的突变与数种NNTRI药物抗性相关，包括对地拉呋啶的高水平抗性。以前已经证明在G190A位点的突变与耐呋络平敏感性改变相关。在G190位点的其它突变，即由G突变为E、Q和T，也有报道。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了突变K101E和G190S，建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证实HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

利用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变K101E和G190S单独或同时导入抗性试验载体。抗性试验载体K101E-RTV含有K101E突变；抗性试验载体G190S-RTV含有G190S突变。利用先前所述的表型试验方法，对这两个带有突变的抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，其101和190位点都是野生型。在这两个载体上，我们测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平、艾发呋瑞兹的敏感性模型。K101E-RTV只含有K101E突变，处于野生型背景下。相对于野生型对照RTV，K101E-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低(5倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(5倍)，对耐呋络平敏感性中度降低(12倍)。相对于野生型对照RTV,G190S-RTV对地拉呋啶敏感性增加(0.5倍)，对耐呋络平敏感性中度降低(75倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(7.6倍)。相对于对照野生型RTV,K101E-G190S-RTV对地拉呋啶敏感性处于野生型水平(1.4倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性发生实质性降低(250倍)。

在这个实施例中，G190S和K101E同时突变出现了新的敏感性模型。观察到G190S和K101E同时突变会逆转G190S单独突变对地拉呋啶敏感性的效应，二者同时突变对耐呋络平和艾发呋瑞敏感性的影响大于其单独突变之和。

实施例15

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV V108I位点基因型与NNTRI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并对患者98-652 HIV样本进行表型分析

如同实施例1中所述，用患者98-652HIV样本构建抗性试验载体，命名为RTV-652。该患者以前未接受过抗逆转录病毒治疗。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生一个抗性试验载体，命名为RTV-652。然后对RTV-652进行表型试验，准确而定量地测定它们对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。该组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI,ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶，耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查全部试验药物的敏感性模型，与已知的敏感性模型比较。观察到患者RTV-652对NNTRI类药物的一种敏感性模型。在该模型中，RTV-652对地拉呋啶敏感性增加(0.97倍)，对耐呋络平敏感性轻微降低(5倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-652 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。与对照序列比较，在RTV-644中K101E和G190S位点发现突变。与对照序列比较，在如下位点发现突变：M41L,V108I,I135T,L210W和T215D。M41L,L210W和T215D位点与NRTI类药物敏感性和抗性相关。已知在HIV野生型(药物敏感)变体之间，1135T和R211K位点的突变具有序列多态性。已知V108I与数种NNRTI类药物抗性相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了突变V108I以建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证实HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中所具有的作用

利用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变V108I导入抗性试验载体。抗性试验载体V108I-RTV含有V108I突变。利用先前所述的表型试验方法，对抗性试验载体V108I-RTV进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，其108位点是野生型。在载体V108I-RTV上，我们测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平、艾发呋瑞兹的敏感性模型。抗性试验载体V108I-RTV处于野生型背景下，只含V108I突变。相对于野生型对照RTV，V108I-RTV对地拉呋啶表现出野生型敏感性(1.3倍)，对艾发呋瑞兹表现出野生型敏感性(1.7倍)，对耐呋络平敏感性轻微降低(3倍)。

实施例16

利用抗性试验载体和定点突变体建立HIV K103 K101和G190位点基因型与NNRTI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并对患者98-955HIV样本进行表型分析

如实例1中所述，用患者样本98-955构建了抗性试验载体。该患者以前接受过nelfinavir(PRI类药物)治疗。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段包括了编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒核酸。这段PDS序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生一个抗性试验载体，命名为RTV-955。然后进行表性分析，准确而定量地测定RTV-955对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶、艾发呋瑞兹、saquinavir),PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir,saquinavir)。在抗性试验载体上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检验RTV-955对所有试验药物的敏感性模型，并与已知的敏感性模型比较。观察到(患者)RTV-955对NNRTI类药物的一种敏感性模型，发现地拉呋啶敏感性轻微降低(4倍)而耐呋络平敏感性却显著降低(530倍)。

测定患者HIV样本的基因型

用ABI链终止子技术对RTV-955 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列比较。与对照序列比较，检查该基因型找出不同于对照的序列。在如下发现突变：K20R,V35I,A62V,D67N,T69D,V75I,F77L,K101E,K103N,Y115F,F116Y,Q151M,I167V,Y181C,M184V,G190A,I202V,R211K,F214L,T215V和K219Q。在K101E,K103E,Y181C,G190A和F214L位点的突变是突变型和野生型混合(存在)。A26V,D67N,T69D,V75I,F77L,Y115F,F116Y,Q151M,M184V,T215V和K219Q与NRTI抗性相关。已知在不同HIV野生型(药物敏感)变体之间，在V35I,R211K和F214L位点的突变具有序列多态性。以前已经证明K101E突变与NNRTI类药物抗性相关。以前已经证明Y181I位点突变与耐呋络平高水平抗性相关。以前已经证明在K103N位点的突变与对地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹这三个NNRTI类药物的抗性相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了K101E,J103N和G190A突变，建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证明HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR技术进行点定点突变，将突变K101E,K103N和G190A单独或组合导入抗性试验载体(Saker and Sommar,Ibid.)。抗性试验载体K101E-RTV含有K101E突变；抗性试验载体K0103E-RTV含有K103N突变；抗性试验载体G190A-RTV含有G190A突变；抗性试验载体K101E-G190A-RTV和抗性试验载体K103N-G190A-RTV分别各两个突变。应用早先描述的表型分析法，对这五种含有突变的抗性试验载体进行抗性试验。将试验结果与另一抗性试验载体比较。此载体遗传背景明确，在101,103,190位点均为野生型。我们在全部5个载体上测定其对NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹表型敏感性模型。K101E-RTV处于野生型背景下，只含有K101E突变。相对于野生型对照RTV,K101E-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低(5倍)，对耐呋络平的敏感性中度降低(55倍)，对艾发呋瑞兹敏感性中度降低(30倍)。G190A-RTV处于处于野生型背景，只含有G190A突变。相对于野生型对照RTV,G190A-RTV对艾发呋瑞兹的敏感性增加8倍。相对于野生型对照RTV,K101E-G190A-RTV对地拉呋啶表现出野生型敏感性(2倍)，对耐呋络平敏感性有实质上降低(大于800)，对艾发呋瑞兹的敏感性显著降低(120倍)。向带有G190A单突变的抗性试验载体中导入第二个突变，导致地拉呋啶敏感性发生逆转。G190A突变体对地拉呋啶敏感性增加。但是向G190A导入K101E或K103N中两者之中任意一种突变，就引起对地拉呋啶敏感性的轻度下降。其次，G190A和K101E同时突变引起耐呋络平和艾发呋瑞兹敏感性下降，下降的程度大于两种单独突变(所观察)效应之和。最后，G190A和K103N同时突变，引起对耐呋络平和艾发呋瑞兹的敏感性都降低，降低程度大于两种单独突变(所观察)效应之和。

实施例17

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV V106 V189 V181和F227位点基因型与NNTRI类药物敏感性抗性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并对患者98-1033和98-757 HIV样本进行表型分析

正如实例1中所述，用患者样本98-1033构建抗性试验载体。该患者先前接受过下列药物的治疗：AZT,d4T,3TC和ddI(NRTI),saquinavir,indinavir和nelfinavir(PRIs)，耐呋络平(NNTRI)。在另一时间采集该患者的另一份样本98-757。如实例1中所述，用样本98-757构建了另一抗性试验载体。在8周附加治疗期间，该患者接受了耐呋络平(NNTRI),d4T(NRTI),saquinavir和nelfinavir(PRJ类药物)这四种药物的治疗。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出一段来自患者的片段(PDS)。该片段编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生两个抗性试验载体，分别记为RTV-1033,RTV-757。然后进行表型分析，准确而定量地测定RTV-1033和RTV-757对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶和耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查(抗性试验载体)对全部试验药物的敏感性模型，并与已知的敏感性模型比较。观察到患者抗性试验载体RTV-1033对NNTRI类药物的一种敏感性模型。在该模型里，地拉呋啶敏感性中度降低(30倍)，耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，艾发呋瑞兹敏感性显著降低(200倍)。观察到患者抗性试验载体RTV-757对NNTRI类药物的敏感性模型。在该模型里，地拉呋啶敏感性轻微降低(10倍)，耐呋络平敏感性有实质性降低(大于800倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子技术对RTV-1033和RTV-757 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。在载体RTV-1033中如下位置发现突变：V35I,D67N,T69D,K70R,V106A,V189L,T200A,I202T,R211K,T215F,D218E,K219Q,H221Y,F227L,L228H和R284K。与对照序列相比较，在载体RTV-757中如下位置发现突变：V35I,D67N,T69D,K70R,V106A,V108I,L109V,Y180C,V189L,T200A,I202T,R211K,T215F,D218E,K219Q,H221Y,L228H,L283I和R284K。在V106A,V108I和L109V位点的序列是野生型与突变型混合(存在)。D67N,T69D,K70R,T215F和K219Q与NTRI抗性相关。已知在不同HIV野生型(药物敏感)变体之间，V35I,T200A,R211K和R284K这些位点的突变具有序列多态性。以前已经证明V106A突变与耐呋络平抗性增加相关，V189I位突变与NNRTI抗性相关。V189I位点处氨基酸突变为L，与NNTRI抗性相关，这一点以前并未报道过。以前已经证明V108I位点的突变与地拉呋啶和耐呋络平抗性增加相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验检查V106A,V189L,V181C和F227L突变，建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证明HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR技术进行点定点突变，将突变V106A,V189L,V181C,F227L单独导入或组合导入抗性试验载体(Saker和Sommar,Ibid.)。抗性试验载体V106A-RTV含有V106A突变；抗性试验载体V189L-RTV含有V189L突变；抗性试验载体Y181C-RTV含有Y181C突变；抗性试验载体F227L-RTV含有F227L突变；抗性试验载体V106A-Y181C-RTV,V106A-V189L-RTV,V106A-F227L-RTV和V181C-F227L-RTV各两种突变。抗性突变载体V106A-Y181C-F227L-RTV含有三种突变。应用早先描述的表型分析方法，对这九个含有突变的抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，106,189,181,227位点均为野生型。我们在全部9个载体上测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。V106A-RTV背景为野生型，只含有V106A突变。相对于野生型对照RTV,V106A-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低(5倍)，对耐呋络平的敏感性中度降低(60倍)，对艾发呋瑞兹表现出野生型敏感性水平(1.7倍)。V189L-RTV背景为野生型，它只含V189L突变。相对于野生型RTV(对照)，V189L-RTV对地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹敏感性均在野生型水平，分别为1.8倍，1.3倍，1.3倍。Y181C-RTV背景为野生型，只含有Y181C突变。相对于对照野生型RTV,Y181C-RTV对地拉呋啶敏感性显著降低(100倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微下降(4倍)。F227L-RTV背景为野生型，只含有F227L突变。相对于对照野生型RTV,F227L-RTV对地拉呋啶(0.03倍)和艾发呋瑞兹(0.48倍)敏感性轻微增加，对耐呋络平敏感性轻微下降(3倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微下降(4倍)。相对于对照野生型RTV,V106A-Y181C-RTV对地拉呋啶敏感性显著降低(100倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微下降(4倍)。相对于对照野生型RTV,V106A-V189L-RTV对地拉呋啶敏感性轻微下降(3倍)，对耐呋络平敏感性中度降低(50倍)，对艾发呋瑞兹表现为野生型敏感性(1倍)。相对于对照野生型RTV,V106A-F227L-RTV对地拉呋啶敏感性轻微下降(3倍)，对耐呋络平敏感性有实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻度下降(8倍)。相对于对照野生型RTV,Y181C-F227L-RTV对地拉呋啶(0.89倍)和艾发呋瑞兹(0.99倍)敏感性增加，对耐呋络平敏感性显著降低(285倍)。相对于对照野生型RTV,V106A-Y181C-F227L-RTV对地拉呋啶敏感性中度下降(50倍)，对耐呋络平实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微下降(12倍)。

实施例18

利用抗性试验载体和定点突变体，建立HIV Y188、L100和K103位点基因型与NNTRI类药物敏感性抗药性相关表型之间的关联性

制备抗性试验载体并分析患者HIV样本98-1058的表型

正如实例1中所述，用患者样本98-1058构建抗性试验载体。该患者先前接受过ddI,d4T,AZT,3TC,ddC和abacavir(NRTI类药物)，indinavir和amprenavir(PRI类药物)。分离病毒RNA进行逆转录-PCR，扩增出处一段来自患者的片段(PDS)。该片段编码蛋白酶全长和逆转录酶1-313位氨基酸的病毒序列。将这段序列插入一个带有报告基因的病毒载体内，产生抗性试验载体，命名为RTV-1058。选择RTV-1058各个单克隆，然后进行表型分析，准确而定量地测定RTV-1058对一组抗逆转录病毒药物的敏感性水平。这组抗逆转录病毒药物包括了通常所说的NRTI类药物(AZT,3TC,d4T,ddI和ddC),NNRTI类药物(地拉呋啶和耐呋络平)和PRI类药物(indinavir,nelfinavir,ritonavir和saquinavir)。在抗性试验载体库上测定每一种试验药物的半数抑制浓度IC50。检查抗性试验载体对全部试验药物的敏感性模型，并与已知的敏感性模型比较。观察来自患者RTV-1033的三个克隆(克隆4,5,10)的敏感性模型。克隆4对地拉呋啶敏感性有显著降低(85倍)，对耐呋络平的敏感性发生实质性降低(大于800倍)。克隆5对地拉呋啶的敏感性发生实质性降低(250倍)，对耐呋络平敏感性显著降低(120倍)。克隆10对地拉呋啶的敏感性发生实质性降低(大于250倍)，对耐呋络平敏感性也发生实质性降低(大于800倍)。

测定患者HIV样本的基因型

应用ABI链终止子对RTV-1058 DNA自动测序。所得核酸序列与野生型进化枝B HIV-1(美国新墨西哥州，洛斯阿拉莫斯，HIV序列数据库)的共有序列作比较。检查该基因型找出与对照不同的序列。在RTV-1033中如下位置发现突变：M41L,A62V,D67N,T69SST,L74V,L100I,K103N,V181I,I135T,T200S,L210W,R211K和T215Y。L74V和L100I位点是野生型和突变型序列混合存在。克隆4含有K103N和Y188L突变。克隆5含有L100I和K103N位点突变。克隆10含有L100I,K103N和Y188L突变。M41L,A62V,D67N,T69SST,L74V,L210W和T215Y与NTRI抗性相关。已知在不同HIV野生型(药物敏感)变体之间，I135T,T200S和R211T位点的突变具有序列多态性。以前已经证明L100I位点突变与地拉呋啶和耐呋络平抗性相关，K103N位点突变与地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹抗性相关。利用定点突变和体外敏感性表型试验，我们检查了突变Y188L,L100I和K103N，建立基因型变化与表型之间的关联性。

应用定点突变技术证明HIV特定突变在抗逆转录病毒药物敏感性(表型)中的作用

使用大引物-PCR技术进行点定点突变(Saker and Sommar,Ibid.)，将突变Y188L,L100I和K103N单独导入或组合导入抗性试验载体。抗性试验载体Y188L-RTV含有Y188L突变；抗性试验载体L100I-RTV含有L100I突变；抗性试验载体K103N-RTV含有K103N突变；抗性试验载体K103N-Y188LRTV,L100I-K103N-RTV各含有两种突变。抗性突变载体L100I-K103N-Y188L-RTV含有三种突变。应用早先描述的表型分析方法，对这6个含有突变的抗性试验载体进行抗性试验，试验结果与另一抗性试验载体比较。该载体遗传背景明确，188,100和103位都是野生型。我们在全部6个载体上测定了NNTRI类药物地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹的表型敏感性模型。Y188L-RTV只含有Y188L突变。相对于野生型对照RTV,Y188L-RTV对地拉呋啶的敏感性轻微降低(9倍)，对耐呋络平敏感性发生实质性降低(大于800倍)，对艾发呋瑞兹敏感性中度降低(110倍)。L100I-RTV只含有L100I突变。相对于野生型RTV(对照)，L100I-RTV对地拉呋啶敏感性中度降低(30倍)，对艾发呋瑞兹敏感性轻微降低(10倍)，对耐呋络平敏感性轻微降低(3倍)。K103N只含有K103N突变。相对于对照野生型RTV,K103N-RTV对地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹敏感性中度降低，地拉呋啶降低50倍，耐呋络平降低55倍，艾发呋瑞兹降低30倍。相对于对照野生型RTV，K103N-Y188L-RTV对地拉呋啶、耐呋络平和艾发呋瑞兹敏感性发生实质性降低，地拉呋啶降低大于250倍，耐呋络平降低大于800倍，艾发呋瑞兹降低大于250倍。相对于对照野生型RTV,L100I-K103N-RTV地拉呋啶和耐呋络平发生实质性降低，地拉呋啶降低大于250倍，艾发呋瑞兹降低大于250倍，对耐呋络平的敏感性中度降低(70倍)。相对于对照野生型RTV,L100I-K103N-Y188L-RTV对地拉呋啶，耐呋络平和艾发呋瑞兹的敏感性发生实质性降低，地拉呋啶敏感性降低大于250倍，耐呋络平降低大于800倍，艾发呋瑞兹降低大于250倍。突变按新方式组合，产生了出乎意料的敏感性模型。这些新模型与单个突变所具有的模型不同。