乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白的复合物及其应用

摘要

本发明提供了一类与热休克蛋白结合的乙肝病毒抗原，包括核心抗原、表面抗原和聚合酶抗原。本发明还提供了乙肝病毒抗原与热休克蛋白gp96和hsp78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和hsp78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这种复合物可用于制备治疗乙肝及乙肝继发性肝癌的治疗性疫苗。

说明书

本发明涉及乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白gp96和hsp78的复合物及其应用。

热休克蛋白(hsp)gp96(glycoprotein 96)又称作grp94(glucose-regulated protein 94)，是位于细胞内质网膜上hsp90家族中的成员，分子量约96 KDa，在细胞蛋白折叠和运输过程中发挥重要作用。近几年研究发现它还存在于某些癌细胞表面。gp96分子含有2个保守区，C端区为多肽结合区，能结合5-25个氨基酸的多肽序列，N端区能结合ATP，具有ATP酶活性。热休克蛋白hsp78是细胞质中hsp70家族中的成员，分子量约78kDa，在细胞蛋白折叠和运输过程中发挥重要作用。hsp78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合，它有二个功能区：N端区有ATP酶活性，C端区结合多肽底物。

近年来研究发现从肿瘤组织或病毒感染的细胞中分离纯化的gp96和hsp78分子免疫动物后能引起机体产生针对该肿瘤或病毒的特异性免疫排斥反应，进一步研究表明gp96和hsp78能结合细胞内产生的全部肽库，其中包括抗原多肽，这种特异性免疫反应取决于gp96分子和hsp78分子结合的多肽而非热休克蛋白本身，来自肿瘤或病毒感染的细胞中的gp96分子和hsp78分子通常结合有肿瘤或病毒特异性多肽，gp96分子和hsp78分子能将其结合的抗原肽呈递给主要组织相容性抗原(MHC)分子，从而激活细胞毒性T细胞(CTL)引发机体产生细胞免疫反应。由于gp96和hsp78在细胞抗原呈递过程中发挥重要作用，因此gp96-多肽复合物和hsp78-多肽复合物可用于防治自体肿瘤和某些传染性疾病。

美国纽约大学的Pramod K.Srivastava在自己的研究基础上分别申请了6项美国专利(专利号为6017544,6017540,6007821,5837251,5830464)，这些专利主要内容是利用热休克蛋白(hsp)与非共价结合的抗原分子二者形成的复合物对原发性和已转移的肿瘤以及传染性疾病进行治疗，激发机体产生免疫反应，其中抗原分子既包括来自于体内与hsp结合的多肽，又包括在体外能与hsp形成复合物的体外抗原或免疫原性片段。Hsp主要包含hsp70,hsp90和gp96蛋白。

目前已证实gp96和hsp70分子能结合泡状口炎病毒抗原区肽、鼠H-2K^b限制的卵清蛋白抗原表位肽和L^d限制的白血病CTL表位肽等抗原多肽。但目前为止未见从病毒感染的病人组织中分离鉴定与hsp结合的抗原多肽。

据估计全世界有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)，我国约有1.2亿，HBV是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的首要原因，因此它是一类严重危害我国人民生命健康的传染病。由乙型肝炎继发肝癌的几率也很高，乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在肝癌内和肝癌周围组织中的阳性率分别为62.5％和29.2％。CTL引发的细胞免疫反应是机体清除病毒和治愈乙肝的主要途径，在乙肝感染的病人体内HBV抗原多肽在肝细胞中被加工后呈递给Ⅰ类MHC分子，激活特异CTL引发细胞免疫反应，目前已鉴定出人的一些HBV核心蛋白上的CTL表位，包括HLA-A2限制的HBcAg18-27,HLA-A11限制的HBcAg88-96等。因此研制预防和治疗乙肝和乙肝继发性肝癌的新型药物，尤其是能主动激发机体产生CTL免疫反应的药物具有非常重要的意义。

本发明的一个目的是提供一种与gp96和hsp78结合的乙肝病毒抗原的复合物。所述的乙肝病毒抗原可以分别是乙肝病毒核心蛋白上第88至第94位的氨基酸序列，其序列可以是YVNTNMG，或其变异序列；乙肝病毒核心蛋白上第88至96位的氨基酸序列，其序列可以是YVNTNMGLK，或其变异序列；乙肝病毒核心蛋白上第141至151位的氨基酸序列，其序列可以是STLPETTVVRR，或其变异序列；乙肝病毒核心蛋白上第18至27位的氨基酸序列，其序列可以是FLPSDFFPSV，或其变异序列；乙肝病毒表面蛋白上第313至321位的氨基酸序列，其序列可以是IPIPSSWAF，或其变异序列；乙肝病毒表面蛋白上第355至363位的氨基酸序列，其序列可以是WLSLLVPFV，或其变异序列；乙肝病毒聚合酶蛋白上第575至583位的氨基酸序列，其序列可以是FLLSLGIHL，或其变异序列。

本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合。

本发明的再一个目的是提供一种制备本发明的如上所述乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白gp96和hsp78的复合物的方法。

本发明的又一个目的是提供本发明的这些复合物在制备治疗乙肝及乙肝继发性肝癌的药物中的应用。

本实验室首次从六例HBV感染的人肝癌组织中与热休克蛋白gp96结合的多肽中分离出一特异7肽，经氨基酸序列分析为“YVNTNMG，或YVNVNMG”，经查询发现该序列位于HBV核心蛋白88-94位(HBcAg88-94)，人工合成该序列并与体外表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-7肽复合物，将7肽与gp96-7肽复合物免疫小鼠，均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)，gp96-7肽复合物免疫原性比单独使用肽高200倍以上。实验结果表明gp96-7肽复合物可开发成为一种新型乙型肝炎及其继发性肝癌的治疗性药物。

使用人工合成7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”和N端带荧光素标记的7肽，在体外建立gp96蛋白与荧光素标记的7肽二者结合的反应体系，根据反应公式 $>>G>+>P>>>->->->{{}_{}}_{}$>

其中G代表gp96蛋白，P代表7肽，GP代表gp96蛋白-7肽复合物，k₁、k₂为反应正反方向的速度常数。该结合反应的平衡常数k可由以下关系式得出：

                        k=k₁/k₂=[GP]/[G][P]

[GP]、[G]和[P]分别表示反应产物GP和底物G、P的浓度。确定结合反应体系最佳的温度、盐浓度、pH值、添加剂与催化剂、gp96蛋白与7肽最佳反应浓度比等因子，测定反应常数，构建最佳反应体系。

在最佳反应体系条件下，体外合成gp96蛋白-7肽复合物。

本发明还提供了一种制备乙肝病毒抗原7肽与热休克蛋白gp96的复合物的方法，包括将浓度为0.1-0.15μmol/L的gp96蛋白和浓度为2.5-3.5μmol/L的乙肝病毒抗原在含有5-10％(v/v)甘油的浓度不高于100mmol/L的低盐缓冲液中，在30-39℃下反应10-30分钟。

在本发明的方法中，反应温度最好为37℃，反应时间最好为15分钟。

在本发明的方法中，gp96蛋白的浓度最好为0.12μmol/L，乙肝病毒抗原的浓度最好为3.0μmol/L。

本发明还提供了该乙肝病毒抗原7肽与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白。人工合成对应于该肽的核酸序列，采用分子生物学常用的方法将该序列与gp96基因5’端连接后在大肠杆菌中融合表达。例如，引入限制性酶切位点BglⅡ将该7肽的核酸序列与gp96基因5’端用T4连接酶连接，连接产物的5’和3’端引入2个限制性酶切位点BamHⅠ和SacⅠ，连接到表达载体pET30a中在大肠杆菌中表达，表达产物是gp96与7肽的融合蛋白。

本发明的gp96蛋白-7肽复合物，包括上述gp96以非共价键与7肽体外结合形成的复合物，和上述gp96以共价键与7肽结合形成的融合蛋白，可以使用任何一种公知的免疫方式进行免疫，例如，通过皮下注射、皮内注射、腹腔注射等。gp96蛋白-7肽复合物免疫剂量可以是，例如0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol和0.50nmol。当7肽被单独用于免疫时，免疫剂量可以为0.2nmol、2nmol、20nmol。

gp96蛋白-7肽复合物和7肽在被用于免疫时可以不使用佐剂，或者使用任何公知的佐剂，例如弗氏佐剂、铬明矾等。

本实验室还人工合成了9肽“YVNTNMGLK”，按照上述最佳反应体系体外合成gp96蛋白-9肽复合物，使用任何一种公知的免疫方式进行免疫，例如皮下注射、皮内注射、腹腔注射等，gp96蛋白-9肽复合物免疫剂量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。当9肽被单独用于免疫时，免疫剂量可以为0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫时可以不使用佐剂，或者使用任何公知的佐剂，例如弗氏佐剂、铬明矾等。gp96-9肽复合物和9肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)。gp96-9肽复合物免疫原性比单独使用肽高300倍以上。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型乙型肝炎和乙肝继发性肝癌的治疗性药物。

本实验室还人工合成了11肽“STLPETTVVRR”，10肽“FLPSDFFPSV”；9肽“IPIPSSWAF”；9肽“WLSLLVPFV”；和9肽“FLLSLGIHL”。按照上述最佳反应体系体外合成gp96蛋白-多肽复合物，使用任何一种公知的免疫方式分别进行免疫，例如皮下注射、皮内注射、腹腔注射等，gp96蛋白-多肽肽复合物免疫剂量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。当多肽被单独用于免疫时，免疫剂量可以为0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫时可以不使用佐剂，或者使用任何公知的佐剂，例如弗氏佐剂、铬明矾等。gp96-多肽复合物和多肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)。gp96-多肽肽复合物免疫原性比单独使用肽高均在150倍以上。实验结果表明gp96-多肽肽复合物可开发成为一种新型乙型肝炎和乙肝继发性肝癌的治疗性药物。

本实验室还将上述合成的多种多肽，包括“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。按照上述最佳反应体系体外合成hsp78蛋白-多肽复合物，使用任何一种公知的免疫方式分别进行免疫，例如皮下注射、皮内注射、腹腔注射等，hsp78蛋白-多肽复合物免疫剂量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。当7肽被单独用于免疫时，免疫剂量可以为0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫时可以不使用佐剂，或者使用任何公知的佐剂，例如弗氏佐剂、铬明矾等。hsp78-多肽复合物和多肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)。hsp78-多肽复合物免疫原性比单独使用肽高均在150倍以上。实验结果表明hsp78-多肽肽复合物可开发成为一种新型乙型肝炎和乙肝继发性肝癌的治疗性药物。

附图简要说明

图1．以7肽和gp96-7肽复合物免疫小鼠BALB/cJ(H-2^d)7天后引发的特异性CTL反应。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准⁵¹Cr释放测定，效应细胞与靶细胞之比分别是4、8、12、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。

实施例

1．从肝组织中纯化gp96蛋白

将三份HBV感染的肿瘤组织和一份未感染的正常组织匀浆后离心，用50％-70％的(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose(Pharmacia公司)进行亲和层析，结合的蛋白用10％的α-甲基葡萄糖苷洗脱，洗脱液上POROS 20QE(PE公司BioCAD灌注层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得＞95％纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(NeoMarkers公司)进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相HPLC鉴定。

2．从gp96蛋白释放非共价结合的多肽

将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其终浓度达到0.2％(pH约2.0)，然后用超滤法(分子截留为10KDa,Pall Filtron公司)分离多肽，将多肽混合物进行MALDI-TOF质谱(PE公司Voyager-DE系统)分析，多肽分子量大多在600-1100 Da之间。

3．反相HPLC分析多肽

多肽混合物冻干后溶于溶液A(0.065％TFA,2％乙腈)，上样于C18反相柱(Sephasil peptide C18；5 nm粒度；4.6×250nm,Pharmacia公司)，从0至65％溶液B(0.05％TFA,100％乙腈)进行梯度洗脱，流速为1ml/min，用214nm波长检测。比较肝癌组织和正常组织HPLC图谱，发现一个三份肝癌组织共有而正常组织中没有的肽峰。

4．多肽微量测序与序列分析

收集该特异肽峰用MALDI-TOF质谱(PE公司Voyager-DE系统)鉴定其纯度，只发现分子量为798 Da的单一峰。对该肽微量测序(Procise^TM491蛋白测序仪，PE公司)，其氨基酸序列为“YVNTNMG，或YVNVNMG”，三份肝癌组织得到的序列一致。将该序列在PubMed网上蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查询，发现它位于HBV核心蛋白88-94位。

5．gp96基因克隆

采用宝生物工程(大连)有限公司的RNA提取试剂盒(Catrimox-14^TMRNA Isolation Kit Ver.2.11)从0.5mL经42℃热激2小时的人血液中用异硫氰酸胍法提取总RNA,步骤按试剂盒说明。

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人gp96基因，使用宝生物工程(大连)有限公司的RT-PCR试剂盒(TaKaRa RNA LA PCR^TM KitAMV Ver.1.1)，步骤按试剂盒说明，所用引物为：

引物1:5′CCGGATCCGAACTTGATGTGGATGGTACA 3′

引物2:5′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′

PCR反应条件如下：94℃ 4分钟；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 3分钟，共30循环；72℃ 5分钟。

PCR产物为约2.4 Kd的片段，片段的5′端和3′端人为引入二个酶切位点BamHⅠ和SacⅠ，将扩增片段进行测序，gp96基因包含2343 bp，碱基序列与文献报导(Maki,RG,et al.GeneBank，编号：003299)一致。

6．gp96基因及gp96基因与乙肝病毒抗原多肽核酸的连接片段在大肠杆菌中表达与蛋白纯化

将扩增片段经BamHⅠ与SacⅠ酶切后连接到表达载体pET30a(+)转化大肠杆菌BL21。同时人工合成下列多肽对应的核酸序列：“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。并在上述核酸序列两端引入限制性酶切位点BglⅡ，插入到含有gp96基因的pET30a(+)中。

将构建的载体经1mM IPTG诱导4小时后产物表达，以10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量约100Kda，与理论值基本一致。

将gp96蛋白和gp96蛋白与乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白用Ni亲和层析柱(Pharmacia公司)亲和层析和POROS 20QE(PE公司BioCAD灌注层析系统)进行阴离子层析纯化，以10％SDS-PAGE电泳和银染鉴定纯度，得到大于95％纯度的gp96蛋白及其融合蛋白。表达的gp96蛋白产物和gp96蛋白与乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(NeoMarkers公司)进行Westem鉴定。

7．gp96蛋白与人工合成的多肽体外组装条件试验

人工合成N端带有荧光素标记的7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”(委托赛百盛生物工程公司合成)，将gp96蛋白与多肽体外组装，进行以下一系列试验以确立最佳反应条件：

反应体系温度试验：55℃、39℃、37℃、30℃、或28℃

反应体系盐浓度试验：低盐缓冲液(20mmol/L HEPES,pH7.9,20、100或500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl₂)，高盐缓冲液(20mmol/LHEPES,pH7.9,0.5、1.0、或2.2mol/L NaCl,2mmol/L MgCl₂)

反应体系pH值试验：pH6.0、pH7.0、pH7.9和pH9.0

反应体系添加剂与催化剂：10mmol/L ADP,10mmol/L ATP,和10％(V/V)甘油

gp96蛋白与7肽最佳反应浓度及其浓度比率：反应体系7肽浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μmol/L，反应体系gp96蛋白浓度分别为0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21μmol/L。测定反应常数k。gp96蛋白含量由以下公式计算，c=1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀,c为蛋白浓度，A₂₈₀和A₂₆₀分别为280nm和260nm光吸收。荧光素标记的7肽含量以378nm处的吸收值计。结合反应后用超滤法(分子截留为10KDa,Pall Filtron公司)去除未结合的7肽，gp96蛋白-7肽复合物的含量以378nm处的吸收值计。

8．gp96蛋白与人工合成的多肽体外组装最佳反应体系构建

通过多组分方差分析优化反应条件，确定最佳反应条件。

人工合成7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”(委托赛百盛生物工程公司合成)，建立最佳体外结合反应体系：20mmol/L HEPES,pH7.9,20mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl₂,10％(V/V)甘油，3.0μmol/L 7肽，0.12μmol/L gp96蛋白，37℃反应15分钟，超滤法(分子截留10KDa,Pall Filtron公司)去除未结合的多肽。通过分析测定gp96与7肽在体外有较高的亲和力，该结合反应的平衡常数k约为5-10。

9．gp96蛋白-7肽稳定性分析

将体外组装的gp96蛋白-7肽复合物于磷酸缓冲液(PBS)中4℃、-20℃、-70℃保存均不稳定，以10％SDS-PAGE电泳和银染鉴定，30天后gp96蛋白开始形成二聚体或多聚体。冷冻干燥后于4℃保存，复合物稳定性较好，90天后用10％SDS-PAGE电泳和银染以及反相HPLC检测，其降解率＜5％。

10．免疫小鼠

选用生长12-16周的BALB/cJ小鼠(H-2^d)用于本实验。

免疫方式采用将样品溶于100μl的PBS中颈背皮下注射。皮内注射虽然需要的免疫剂量较低，但不易操作，故没有采用。腹腔注射则要求免疫剂量较大，约需0.5nmol才有效，故也没有采用。

gp96蛋白-7肽复合物的最适免疫剂量为0.1nmol。

免疫时间为第一次免疫一周后进行第二次免疫效果优于免疫一次的效果。

免疫佐剂使用实验发现gp96蛋白-7肽复合物使用弗氏不完全佐剂(FIA)、弗氏完全佐剂、使用铬明矾不仅没有免疫增效作用，而且使其免疫原性降低，原因可能佐剂对gp96蛋白-7肽复合物结构有破坏作用。对于7肽使用弗氏佐剂、使用铬明矾均能显著提高其免疫活性，弗氏佐剂效果优于铬明矾。

因此采用皮下注射免疫，将7肽溶于缓冲液(90％PBS,10％DMSO/0.1％TFA)，gp96-7肽复合物溶于PBS中，注射前剧烈振荡1分钟，每支小鼠免疫剂量7肽分别为0.2nmol,2nmol和20nmol，将肽与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。gp96-7肽复合物免疫剂量分别是0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol，采用颈背皮下注射，第一次免疫一周后进行第二次加强免疫，7天后进行细胞毒性分析。每一处理使用10只小鼠。

11．细胞毒性(CTL)分析

小鼠免疫7天后，从每只小鼠收获得约3×10⁷脾细胞悬于含有10mMHEPES缓冲液、5×10^-5M巯基乙醇，抗生素和10％(V/V)FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射(4500 Rad)的同源LPS-刺激的B淋巴细胞(3∶1)和1μg/ml肽在完全培养基中37℃培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准⁵¹Cr释放实验(具体方法见Kuhrober,A,et al.1997.InternationalImmunology,9(8):1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，靶细胞用10ug/ml肽于37℃致敏30分钟后加入不同数量的效应细胞，反应体系为100ul的完全培养基。37℃共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。

从⁵¹Cr释放实验可以看出7肽和gp96-7肽复合物均可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，但gp96-7肽复合物免疫原性为7肽的200倍以上，每只小鼠免疫0.1nmol(约10ug)的gp96-7肽复合物即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在60％以上。实验结果表明gp96-7肽复合物可开发成为一种新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治疗药物。实施例12．其它gp96-多肽复合物的免疫活性测定

除上述抗原7肽之外，我们又选取其它6个乙肝病毒抗原多肽与gp96体外组装并测定其免疫活性，这6个抗原多肽分别是(1)核心抗原多肽“YVNTNMGLK”(位于核心蛋白氨基酸序列88-96位)；(2)核心抗原多肽“STLPETTVVRR”(位于核心蛋白氨基酸序列141-151位)；(3)核心抗原多肽“FLPSDFFPSV”(位于核心蛋白氨酸酸序列18-27位)；(4)表面抗原多肽“IPIPSSWAF”(位于表面蛋白氨基酸序列313-321)；(5)表面抗原多肽“WLSLLVPFV”(位于表面蛋白氨基酸序列355-343)；(6)聚合酶抗原多肽“FLLSLGIHL”(位于聚合酶蛋白氨基酸序列575-583)。分别人工合成这6种多肽，采用实施例8中所述的最佳反应体系在体外与gp96结合，这6种多肽与gp96均有较高的亲和力，通过测定结合反应平衡常数K,6种肽与gp96结合反应中K值均在5以上。采用实施例10中所述的方法用上述6种乙肝病毒抗原多肽与gp96形成的复合物，和上述gp96与7种乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白分别免疫小鼠，并采用实施例11中所述的方法分别对这6种复合物进行CTL分析，从51Cr释放实验可以看出这6种乙肝病毒抗原多肽与gp96形成的复合物均可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，6种多肽与gp96形成的复合物的免疫活性比单独多肽高150-300倍。每只小鼠免疫剂量为0.1nmol(约10μg)时即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，通过对这6种多肽与gp96形成的复合物的细胞毒性测定发现靶细胞的裂解率在60％-85％之间。

以上实验结果表明gp96与乙肝病毒抗原多肽体外组装合成的复合物可开发成为一种新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治疗药物。由于实验条件所限本发明专利不可能对每一种乙肝病毒抗原多肽进行体外组装及免疫活性测定，但我们通过选取7种有代表性的乙肝病毒核心抗原、表面抗原及聚合酶抗原作研究对象，在体外与gp96结合并进行免疫活性测定，大量实验表明gp96与这些乙肝病毒抗原多肽形成的复合物均能刺激小鼠产生强烈的免疫反应，gp96可作为乙肝病毒抗原多肽的新型良好佐剂，可开发成为一种新型治疗疫苗。因此，除上述7种乙肝病毒抗原多肽之外，其它任何乙肝病毒抗原多肽与gp96结合作为新型疫苗也应当在本发明的保护范围之内。实施例13．热休克蛋白hsp70基因克隆与表达

采用宝生物工程(大连)有限公司的RNA提取试剂盒(Catlimox-14TMRNA Isolation Kit Ver2.11)从200mg的人肝癌组织中用异硫氰酸法提取总RNA，步骤按试剂盒说明。采用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人hsp70家族中hsp78，使用宝生物工程(大连)有限公司的RT-PCR试剂盒，步骤按试剂盒说明。所用引物为：引物1:GG GGATCC ATG AAG TTC ACT GTG GTG GCG GCG引物2:GG GTCGAC CTA CTA CTC ATC TTT TTC TGA TGTPCR反应条件如下：94℃ 4分钟；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 2分钟，其30循环；72℃ 5分钟。PCR产物为约2.0kb的片段，片段的5′端和3′端人为引入二个酶切位点BamHⅠ和SalⅠ，将扩增片段进行测序，hsp78基因包含1965bp，碱基序列与文献报导(Mech.Ageing Dev.1998,104(2):149-158)一致。将扩增片段经BamHⅠ与SalⅠ酶切连接到表达载体PET30a(+)转化大肠杆菌BL21，同时人工合成下列多肽对应的核酸序列：“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。并在上述核酸序列两端引入限制性酶切位点BglⅡ，插入到含有hsp78基因的pET30a(+)中。将构建的载体经1mM IPTG诱导4小时后表达，以10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测表达产物分子量约80 kDa，与理论值基本一致。将表达产物用ADP-Agarose亲和层析(Sigma)和MonoQ(Pharmacia)阴离子层析纯化，以10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色(电泳上样量约5μg)鉴定纯度，得到大于95％纯度的蛋白。表达的HSP78极其融合蛋白用hsp70单克隆抗体(Sigma)进行Western鉴定。实施例14．hsp 78-多肽免疫原性测定

将hsp78与7种多肽体外组装形成的复合物，最佳反应体系同gp96(见实施例8)，将体外合成的复合物和hsp78与7种多肽的融合蛋白免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫剂量以及免疫程序同gp96(见实施例10)。细胞毒性(CTL)分析方法同gp96(见实施例11)。从51Cr释放实验可以看出hsp78-7肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，hsp78-7肽复合物的免疫原性为单独7肽的150倍以上，每只小鼠免疫0.1nmol(约10μg)即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50％以上。实验表明hsp78-7肽复合物可开发成为一种新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治疗药物。