分支杆菌快速变色液体培养基及分支杆菌鉴定方法及分支杆菌药敏和MIC测定方法

摘要

本发明为一种分支杆菌快速变色液体培养基及分支杆菌鉴定方法及药敏和MIC测定方法,本发明的快速变色液体培养基是在溶剂为蒸馏水的溶液中含有缓冲系统、基础成分、微量元素成分、促生长剂和混合抗生素,还含有变色剂MTT和/或XTT,变色剂含量为在1000ml溶液中含有5—8mg,该培养基具有快速、培养阳性率高的优点。采用了本发明快速变色液体培养基进行分支杆菌鉴定及药敏和MIC测定,具有快速、简便、准确和可靠的优点,几乎适应于所有抗菌素。

说明书

本发明属于分支杆菌培养、鉴定和药敏的技术领域，具体涉及一种分支杆菌快速变色液体培养基，及用此快速变色液体培养基进行结核与非结核分支杆菌快速鉴定、分支杆菌快速药敏和最小抑菌浓度(MIC)测定的方法。

目前，我国大多数医院实验室使用一种被称为“改良罗氏培养基”的固体培养基培养分支杆菌，其成分和制备方法参见由熊礼宽编著、中国科学技术出版社1992年7月出版发行的《结核病的实验室诊断及其进展》第27-28页，具体的成分及含量为：磷酸二氢钾2.4g、硫酸镁·7H₂O 0.24g、枸橼酸镁0.6g、甘油1.2ml、天门冬3.6g、淀粉30g、蒸馏水600ml、2％孔雀绿水溶液20ml、新鲜鸡卵液1000ml。制备方法为：将各盐类成分溶于水后，加入淀粉，混匀后，置沸水浴中煮沸30-40分钟，呈糊状，待冷却后，加入已消毒的纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀后，再加入孔雀绿溶液，待混匀后，分装于试管中，置血清凝固器在90℃下1-2小时，然后在4℃保存。此培养基制备较麻烦，分支杆菌培养阳性率低，为20-40％，所需时间长，一般20-56天。用此改良罗氏培养基培养分支杆菌后，再经过生化反应进行鉴别是结核分支杆菌，还是非结核分支杆菌，其鉴定程序麻烦，所需时间长，一般需28天。用此改良罗氏培养基进行药敏试验，是在其中加入一定量的药物来进行，其所需时间长，规定需28天以上才能出结果，而且药物因加热被破坏使药敏准确性差。

国外有实验室采用液体培养基培养分支杆菌，多采用含放射性的碳标记一种底物，如棕榈酸，当有活的细菌生长时，则分解14C标记的棕榈酸脱羧产生有放射性的二氧化碳，再通过检测二氧化碳含量来判断分支杆菌是否存在，如BACTEC 460检测系统，参见《结核病的实验室诊断及其进展》第70-73页。也有采用荧光底物的液体培养基培养分支杆菌，如BACTEC 9000MB和MGIT系列。这些液体培养基检测分支杆菌阳性率高于固体培养基，所需时间也明显缩短，但均需要特殊仪器，试剂昂贵，且依靠进口。

本发明的第一个目的在于针对上述各种现有培养基存在的问题，提供一种快速且培养阳性率高的分支杆菌液体培养基。

本发明的第二个目的在于针对上述各种分支杆菌鉴定方法或时间长、准确率不高，或需要专用仪器、价格昂贵的缺点，提供一种不需要仪器、准确而快速的分支杆菌鉴定方法。

本发明的第三个目的在于针对上述用改良罗氏培养基进行药敏试验所需时间长、药敏准确性差的缺点，提供一种快速而准确的分支杆菌药敏和MIC测定方法。

本发明的第一个目的是这样实现的：本发明的分支杆菌快速变色液体培养基是在溶剂为蒸馏水的溶液中含有缓冲系统、基础成分、微量元素成分、促生长剂和混合抗生素，还含有变色剂MTT和/或XTT，变色剂的含量为在1000ml溶液中含有5-8mg。上述变色剂MTT为噻唑兰(Thiazolyl)，即溴化[3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯四唑]，即3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，变色剂XTT为2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)-2H-四唑-5-carboxanilid，即2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide。MTT和XTT均为市售成品。

上述缓冲系统包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，基础成分包括硫酸镁·7H₂O、枸橼酸钠·2H₂O、甘油、谷氨酸钠和小牛血清，微量元素成分包括硫酸铵、硫酸锌、硫酸铜、枸橼酸铁铵、氯化钙，促生长剂包括白蛋白-油酸-葡萄糖液、盐酸吡哆醇、泛酸钙、生物素、触酶，上述各组分的含量为，在1000ml溶剂为蒸馏水的溶液中，磷酸二氢钾1.875-2.5g、磷酸氢二钠1.875-2.5g、硫酸镁·7H₂O 25-50mg、硫酸铵250-500mg、硫酸锌1-2mg、硫酸铜1-2mg、枸橼酸铁铵20-40mg、枸橼酸钠·2H₂O 200-400mg、氯化钙0.5-1mg、盐酸吡哆醇1-2mg、泛酸钙1-2mg、生物素0.25-0.5mg、触酶200-400μg、甘油2-5ml、谷氨酸钠250-500mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液50-200ml、小牛血清50-l00ml、混合抗生素20-100mg、变色剂MTT和/或XTT5-8mg。其配制方法为：把除小牛血清、抗生素混合液等不能高压灭菌的组分之外的其余组分均匀混合在一起，然后高压灭菌，待冷却后加入小牛血清、抗生素混合液等不能高压灭菌的组分即可。采用上述快速变色液体培养基与传统的罗氏培养基比较，经130例对照试验，结果显示：(1)时间：采用罗氏培养基分支杆菌平均生长时间22天，采用本发明的快速变色液体培养基分支杆菌平均生长时间为8天；(2)阳性率：采用罗氏培养基分支杆菌培养阳性率为30.8％(40/130)，采用本发明的快速变色液体培养基分支杆菌培养阳性率为52.3％(68/130)；(3)污染率：采用罗氏培养基污染率为2.3％(3/130)，采用本发明的快速变色液体培养基污染率为1.5％(2/130)。

本发明的快速变色液体培养基具有快速、培养阳性率高和污染率低的优点。

本发明的第二个目的是这样实现的：往每个鉴定组中加入50-100体积份数的有机溶剂、100-200体积份数的稀释菌液和对硝基苯甲酸，对硝基苯甲酸作为结核分支杆菌抑制剂，其终浓度为0.5mg/ml，稀释菌液是把待鉴定菌液用本发明的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照组中加入50-100体积份数的有机溶剂与1-2体积份数浓度为5mg/ml的变色剂，变色剂的种类与鉴定组中相同，然后在35-37℃下培养，观察结果，当对照组变紫或变红色后，往测试组中再加入1-2体积份数的同种变色剂，35-37℃培养1-3小时，观察结果，当两组均变紫或变红色，则待鉴定菌为非结核分支杆菌，当对照组变紫或变红色，而鉴定组不变色，则待鉴定菌为结核分支杆菌。

上述有机溶剂最好选用液体石蜡。

上述分支杆菌鉴定方法由于采用了本发明的快速变色液体培养基，具有如下优点：1．快速，只需1-6天。2．简便，不需仪器；3．准确，准确性达99.5％。

本发明的分支杆菌鉴定方法通过对人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲分支杆菌、卡介苗、堪萨斯分支杆菌、海分支杆菌、猿分支杆菌、瘰疬分支杆菌、戈分支杆菌、苏分支杆菌、鸟分支杆菌、蟾分支杆菌、溃疡分支杆菌、胃分支杆菌、胞内分支杆菌、地分支杆菌、malmoense分支杆菌、无色分支杆菌、次要分支杆菌、嗜血分支杆菌、副结核分支杆菌、shimaidei分支杆菌、偶发分支杆菌、副偶发分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、龟分支杆菌脓肿亚种、耐热分支杆菌、转黄分支杆菌、草分支杆菌、耻垢分支杆菌和牡牛分支杆菌等ATCC、MTC分支杆菌标准株及临床分离株进行试验后发现，本发明的鉴定方法可快速、准确的将非结核与结核分支杆菌进行鉴别，将传统的方法需28天缩短为1-6天。

本发明的分支杆菌鉴定方法与采用传统的罗氏培养基的鉴定方法比较，进行结核分支杆菌和非结核分支杆菌鉴别试验，经200例对照试验，结果显示：在罗氏培养基上需要28天，而本发明的快速变色液体培养基只需1-6天，鉴定结果两者完全一致。

本发明的第三个目的是这样实现的：往每个鉴定组中加入50-100体积份数有机溶剂、100-200体积份数的稀释菌液和待测药物，其中稀释菌液是把菌液用本发明的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照组中加入50-100体积份数的有机溶剂与1-2体积份数浓度为5mg/ml的变色剂，变色剂的种类与鉴定组中相同，然后在35-37℃下培养，观察结果，当对照组变紫或变红色后，往测试组中再加入1-2体积份数的同种变色剂，35-37℃培养1-3小时，观察结果，当两组均变紫或变红色，则为耐药，当对照组变紫或变红色，而鉴定组不变色，则为敏感，以不变色的最低药物浓度组的药物浓度为其MIC。

上述有机溶剂最好选用液体石蜡。

本发明的分支杆菌药敏试验和MIC测定方法由于采用了本发明的快速变色液体培养基，具有如下优点：1．快速，只需1-6天。2．简便，不需仪器；3．准确，准确性达99.5％。4．传统的方法只适用于异烟肼、链霉素、对氨基水杨酸钠、利福平、乙胺丁醇、氨硫脲、乙硫异烟胺、卡那霉素和卷曲霉素这些药物，而本发明的方法除适用于上述药物外，几乎适用于所有的抗菌素，如阿米卡星、吡嗪酰胺、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、罗红霉素、阿齐红霉素、米若环素、亚胺培南、多西环素、妥布霉素、头胞西丁、环丙沙星、氧氟沙星和斯帕沙星等。

把本发明的药敏试验方法与采用传统的罗氏培养基的药敏试验方法相比较，进行了异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和利福平药敏试验，经200例对照试验，结果显示：在罗氏培养基上需要28天，而采用本发明的快速变色液体培养基的方法只需1-6天，药敏结果一致。

采用了本发明的分支杆菌MIC测定方法对20例非结核分支杆菌进行MIC测定，能在1-6天内测出阿米卡星、吡嗪酰胺、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、罗红霉素、阿齐红霉素、米若环素、亚胺培南、多西环素、妥布霉素、头胞西丁、环丙沙星、氧氟沙星和斯帕沙星的MIC。

实施例一：

分支杆菌快速变色液体培养基，在1000ml溶剂为蒸馏水的溶液中含：磷酸二氢钾1.875g、磷酸氢二钠1.875g、硫酸镁·7H₂O 25mg、硫酸铵250mg、硫酸锌1mg、硫酸铜1mg、枸橼酸铁铵20mg、枸橼酸钠·2H₂O 200mg、氯化钙0.5mg、盐酸吡哆醇1mg、泛酸钙1mg、生物素0.25mg、触酶200μg、甘油2ml、谷氨酸钠250mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液50ml、小牛血清50ml、混合抗生素20mg、变色剂MTT5mg。其中混合抗生素包括两性霉素5mg、多粘菌素5mg、萘啶酸5mg、磺胺5mg。

实施例二：

分支杆菌快速变色液体培养基，在1000ml溶剂为蒸馏水的溶液中含：磷酸二氢钾2.5g、磷酸氢二钠2.5g、硫酸镁·7H₂O 50mg、硫酸铵500mg、硫酸锌2mg、硫酸铜2mg、枸橼酸铁铵40mg、枸橼酸钠·2H₂O 400mg、氯化钙1mg、盐酸吡哆醇2mg、泛酸钙2mg、生物素0.5mg、触酶400μg、甘油5ml、谷氨酸钠500mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液200ml、小牛血清100ml、混合抗生素100mg、变色剂MTT8mg。其中混合抗生素包括两性霉素25mg、多粘菌素25mg、萘啶酸25mg、磺胺25mg。

实施例三：

分支杆菌快速变色液体培养基，在1000ml溶剂为蒸馏水的溶液中含：磷酸二氢钾2.0g、磷酸氢二钠2.0g、硫酸镁·7H₂O 40mg、硫酸铵350mg、硫酸锌1.5mg、硫酸铜1.5mg、枸橼酸铁铵30mg、枸橼酸钠·2H₂O 300mg、氯化钙0.75mg、盐酸吡哆醇0.75mg、泛酸钙1.75mg、生物素0.35mg、触酶300μg、甘油3.5ml、谷氨酸钠350mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液100ml、小牛血清75ml、混合抗生素60mg、变色剂MTT6mg。其中混合抗生素包括两性霉素15mg、多粘菌素15mg、萘啶酸15mg、磺胺15mg。

上述三个实施例中的变色剂MTT可以用变色剂XTT或MTT和XTT的任意比的混合变色剂替代。

实施例四：分支杆菌快速鉴定方法

鉴定在微量反应板上进行。往每个鉴定孔中加入液体石蜡50μl、稀释菌液100μl和对硝基苯甲酸，对硝基苯甲酸的终浓度为0.5mg/ml，稀释菌液是把待鉴定菌液用实施例一的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照孔中加入变色剂MTT 1μl，MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡50μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照孔变紫或变红色后，往测试孔中再加入MTT 1μl,35-37℃培养1-3小时，观察结果，当鉴定孔和对照孔均变紫或变红色，则待鉴定菌为非结核分支杆菌，当对照组变紫或变红色，而鉴定组不变色，则待鉴定菌为结核分支杆菌。

实施例五：分支杆菌快速鉴定方法

鉴定在微量反应板上进行。往鉴定孔中加入液体石蜡100μl、稀释菌液200μl和对硝基苯甲酸，对硝基苯甲酸的终浓度为0.5mg/ml，稀释菌液是把待鉴定菌液用实施例二的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往对照孔中加入变色剂MTT2μl，MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡100μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照组变紫或变红色后，往测试组中再加入MTT2μl,35-37℃培养1-3小时，观察结果，当鉴定孔和对照孔均变紫或变红色，则待鉴定菌为非结核分支杆菌，当对照孔变紫或变红色，而鉴定孔不变色，则待鉴定菌为结核分支杆菌。

实施例六：分支杆菌快速鉴定方法

鉴定在微量反应板上进行。往每个鉴定孔中加入液体石蜡80μl、稀释菌液150μl和对硝基苯甲酸，对硝基苯甲酸的终浓度为0.5mg/ml，稀释菌液是把待鉴定菌液用实施例三的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照孔中加入MTT1.2μl,MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡150μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照孔变紫或变红色后，往测试孔中再加入MTT 1.2μl,35-37℃培养1-3小时，观察结果，当鉴定孔和对照孔均变紫或变红色，则待鉴定菌为非结核分支杆菌，当对照孔变紫或变红色，而鉴定孔不变色，则待鉴定菌为结核分支杆菌。

上述实施例四至实施例六中，如果快速变色液体培养基是采用变色剂XTT或MTT和XTT的混合变色剂，则对照孔中加入同种类型的变色剂。

实施例七：分支杆菌快速药敏和MIC测定方法

测定在微量反应板上进行。往每个鉴定孔中加入液体石蜡50μl、稀释菌液100μl和待测药物，其中稀释菌液是把菌液用实施例一的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照孔中加入变色剂MTT 1μl，MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡50μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照孔变紫或变红色后，往测试孔中再加入MTT 1μl,35-37℃培养1-3小时，观察结果，以不变色的最低药物浓度孔的药物浓度为其MIC。

实施例八：分支杆菌快速药敏和MIC测定方法

测定在微量反应板上进行，往每个鉴定孔中加入液体石蜡100μl、稀释菌液200μl和待测药物，其中稀释菌液是把菌液用实施例二的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，，往每个对照孔中加入变色剂MTT 2μl,MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡100μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照孔变紫或变红色后，往测试孔中再加入MTT 2μl,35-37℃培养1-3小时，观察结果，以不变色的最低药物浓度孔的药物浓度为其MIC。

实施例九：分支杆菌快速药敏和MIC测定方法

测定在微量反应板上进行。往每个鉴定孔中加入液体石蜡80μl、稀释菌液150μl和待测药物，其中稀释菌液是把菌液用实施例三的快速变色液体培养基稀释成5×10⁵-5×10⁷菌落数/ml而成，往每个对照孔中加入MTT 1.2μl，MTT的浓度为5mg/ml，液体石蜡80μl，然后在35-37℃下培养，每天观察结果1次，当对照孔变紫或变红色后，往测试孔中再加入MTT 1.2μl，35-37℃培养1-3小时，观察结果，以不变色的最低药物浓度孔的药物浓度为其MIC。

上述实施例七至实施例九中，如果快速变色液体培养基是采用变色剂XTT或MTT和XTT的混合变色剂，则对照孔中加入同种类型的变色剂。