一种微生物及其生产生物杀线虫制剂的方法

摘要

本发明是一种微生物及其生产生物杀线虫制剂的方法。微生物是厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamdosporium),其保藏登记号为CGMCC NO.0481。利用该微生物在一定的培养条件下繁殖,并用其生产生物杀线虫制剂。本发明的生物杀线虫剂为纯生物制剂,对于作物及环境无不良影响,而且生产成本低。试验过程中未发现生物杀线虫剂在试验浓度范围内对烟草有药害,没有残留,比较安全。本发明还具有性能稳定,综合性状好,易于规模化生产等特点。

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种微生物及其生产生物杀线虫制剂的方法。

根结线虫在世界范围内普遍发生，已知种类达70多种，其中南方根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫和花生根结线虫占全球农地根结线虫的95％，为害3000多种植物，每年造成的损失极为严重。在我国，根结线虫造成烟草、花卉、蕃茄、棉花、花生、大豆等作物的严重损失，成为发展这些作物的重要限制因子。

目前线虫防治主要采用化学农药，但随着科学技术的进步，人们发现众多的化学杀线剂均有副作用，尤其是使用不当，造成环境染，相继有不少化学杀线虫剂已经禁用，有的即将禁用。如在美国溴甲烷允许使用到2000年，二溴甲烷允许使用到2005年。目前生产上常用的铁灭克对根结线虫的防治效果虽然较好，但成本高，且巨毒、大量使用会破坏土壤微生物区系，污染水源，使其使用受到一定限制。轮作、抗线虫品种等在根结线虫防治中亦起到了一定的作用，但均有局限性，且到目前为止，生产上还没有可供大面积推广的抗线虫品种。鉴于此，人们除了继续开发高效低毒、低残留、高选择性的化学杀线虫剂外，并开始从生物防治角度另觅新法。线虫生防就成为研究的热点问题，引起各国的高度重视和大规模投资，目前已有3个线虫生防商品制剂问世：1、粗状节丛孢(Arthrobotrys robusta)，商品名为Royal 300，在法国用于防治双孢蘑菇线虫，使蘑菇产量比未施用该制剂的对照提高25％(Cayrol,et al.,1978)；2、不规则节丛孢(A.irregalaris)，商品名为：Royal 350，以麦粒作基物生产，大田施用对蕃茄根结线虫有一定的防效，由于防效不稳定，使用量过大未能广泛推广，仅在法国少量使用；3、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，在菲律滨已大量生产，商品名为Bioact，该制剂已大面积用于植物病原线虫的大田生防，取得了大田防治的显著效果(Davide and Zorilla,1983;Jatala,1984;Canto-Saenz,1984)。尽管这3个商品生防制剂已在很大范围内取得了成功，但在不同国家施用的最大问题是防效不稳定。

本发明的目的是培养出一种对根结线虫防效显著，性能稳定，综合性状好，且易于规模化生产制备的微生物，并用其制成杀虫效果良好的生物杀线虫制剂。

本发明是这样实现的：本发明的杀线虫制剂是将一种真菌通过大量繁殖后用载体吸附等复合方法进行制备。其步聚是：(1)先培养出微生物种子；(2)将微生物种子进入固态条件下大量繁殖；(3)将微生物种子进入液态条件下的深层发酵生产大量孢子和菌丝体；(4)将培养获得大量生物体制作成不同类生物杀虫制剂。

本发明的微生物是厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamdosporium)，其保藏登记号为CGMCC N0.0481。

上述微生物种子的培养方法是：(以下均为重量百分比)

以斜面固态培养种子，培养物为100毫升PDA基质添加1-7克的蔗糖和0.1-1.5克的甘油制成，培养温度26-30℃，培养时间3-7天；

微生物种子固态条件下的大量繁殖方法：

以豆饼粉、麸皮、和蟹壳粉或虾壳粉或几丁质等组成原料，在原料中加入水，原料和水的比例为1∶0.6-1,26-32℃下培养7-15天，得含生物体的混合物。

微生物种子进入液态条件下深层发酵生产大量孢子和菌丝体的方法：

液体培养基的组成成份为(重量体积比，即克/100毫升水)硫酸铵〔(NH₄)₂SO₄〕0.5-1.5，氯化钠(NaCl)0.5-1.5，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.01-0.07，硼酸(H₃BO₃)0.001-0.005，柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇)0.3-0.7，硫酸镁(MgSO₄)0.01-1，氯化钙(CaCl₂)0.1-1，硫酸锌(ZnSO₄)0.01-0.1，硫酸锰(MnSO₄)0.01-0.1，硫酸铜(CuSO₄)0.0005-0.007，葡萄糖(C₆H₁₂O₆)0.5-3，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)0.01-0.1，硫酸亚铁(FeSO₄)0.01-0.1，蔗糖(C₁₂H₂₂O₁₁)1-7，甘油(C₃H₈O₃)1-3，PH调为2.5-7.5，培养温度26-37℃，培养时间为24-200小时。

上述优选温度为30-34℃，10吨容积以上发酵优选时间为72-100小时。

微生物制备杀线虫制剂的方法是：

浓缩或添加辅料和承载物后，在温度为40-45℃条件下烘干即得。

上述的辅料是活性炭，蟹壳粉，虾壳粉，几丁质等，承载物是农作物秸杆糠，草碳，锯木屑，硅藻土等。

以下是本发明的生物杀线虫剂在农作物上试验应用情况。

对烟草根结线虫病的防治效果进行了试验，结果如下：

1、试验药剂

供试药剂：生物杀线虫剂粉剂(含孢量2.5×10⁸/克)

对照药剂：5％涕灭威颗粒剂(山东宁阳化工厂生产)

2、试验处理

(1)生物杀线虫粉剂0.5千克/亩

(2)生物杀线虫粉剂1千克/亩

(3)生物杀线虫粉剂2千克/亩

(4)5％涕灭威颗粒剂3千克/亩

(5)空白对照

3、试验方法

供试作物为烟草(Nicotiana tabacum)，品种为感病品种NC82，试验地点在山东安丘，棕壤土，移栽作物，田间管理按生产规范进行。试验设三行区，四次重复，小区面积为30平方米。移栽时生物杀线虫剂可与有机肥等混合一次施入穴中，但涕灭威要注意不要离根部太近。旺长期在烟株附近开穴施入生物杀线虫剂。

4、调查方法

第一次用药调查根结病情基数，生长中期及采完最后一片叶后立即调查各处理根结病情指数、病株率及土壤中幼虫数量，计算防治效果及增产、增值效果。同时注意药害调查。分级标准按全国烟草行业烟病害调查分级标准Yc/T39-1996进行。病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法Yc/T40-1996计算。

5、试验结果

表1 各处理病情指数变化及防效*处理        病情指数 防效   二龄幼虫数量   防效(％)   (个/200cm³)    (％)杀线灵0.5kg 5.18     50.2      17.5        79.8杀线灵1kg   7.9      24.0      35.5        58.9杀线灵2kg   7.95     23.6      22.0        74.6涕灭威3kg   5.1      50.9      15.5        82.1空白        10.4     -         86.5        -*表中数据为7月8日调查结果，病情指数为四次重复平均数，幼虫数量为混样二次观察数据平均数。

对各处理土壤中二龄幼虫数量进行方差分析，结果如表2：表2 方差分析表变异来源  平方和   自由度  均方     F值区组间    3.6000   1       3.6000   0.054处理间    7014.40  4       1753.6   26.330**误差      266.400  4       66.6000总变异    7284.402        3       4        5LSR05     22.68    23.14   23.2     23.20LSR01     37.57    39.24   39.82    40.39处理          平均      5％显著水平   1％显著水平空白          86.50      a             A杀线灵0.5kg   35.50      b             B杀线灵1kg     22.0000    b             B杀线灵2kg     17.5000    b             B涕灭威3kg     15.5000    b             B

表3各处理对烟草产量及产值的影响处理        产量    均价  上等烟 中等烟 亩产值(公斤/亩)  (元)   (％)   (％)   (元)杀线灵0.5kg  169.3    5.82   17.1   42.9  994.16杀线灵1kg    144.9    5.94   20.6   39.7  870.55杀线灵2kg    155.0    5.87   21.6   37.4  919.55涕灭威3kg    169.7    6.42   26.4   39.1  1092.05空白         126.4    4.62   9.5    34.5  580.05

6、结果与分析

根据以上田间拨根调查病情指数结果来看，使用三个剂量的生物杀线虫粉剂都对烟草根结线虫病有控制作用，其中以生物杀线虫粉剂亩用0.5千克效果最好，效果与对照化学药剂涕灭威相近。

从土壤中幼虫数量调查结果来看，生物杀线虫粉剂亩用0.5千克和2千克的土壤中幼虫数量与对照药剂涕灭威相近，与空白对照相比防效为79.8％和74.6％，从统计分析结果来看，二龄幼虫数量在处理间差异显著，重复间差异不显著。三个剂量的生物杀线粉剂与空白对照差异显著，与对照药剂涕灭威间差异不显著。

通过统计不同的处理对烟叶产量和产值的影响表明，生物杀线虫粉剂亩用0.5千克，产值、产量都与对照药剂涕灭威相近，其它两个剂量产值、产量较低，但也显著好于空白组。可以看出通过使用生物杀线虫剂，烟叶亩产可以增加400元。

综合以上三个方面的研究，生物杀线虫剂可以在生产上应用，虽然综合防效和增值效果与化学药剂涕灭威相近，但本发明的生物杀线虫剂为纯生物制剂，对于作物及环境无不良影响，而且生产成本低。试验过程中未发现生物杀线虫剂在试验浓度范围内对烟草有药害，没有残留，比较安全。本发明还具有性能稳定，综合性状好，易于规模化生产等特点。

本发明在温室试验中对蕃茄根结线虫均有较理想的生防作用。从经济角度考虑，纯孢子粉和可湿性粉剂适于远距离的运输供应使用；复合粉剂以农作物秸杆作为承载体的制剂，成本最低，而且对发酵液的承载量大，也有利于农作物秸杆还田，改良土壤，无需考虑毒性。

实施例1：

种子和小样制备及性能检验。

(1)以斜面固态培养种子，培养物为100毫升PDA基质添加4克的蔗糖和1克的甘油制成，培养温度26-30℃，培养时间3-7天；

(2)将菌种贴斜面铲起约5×5mm接入液体培养基，培养基的组成为(克/100毫升水)：硫酸铵〔(NH₄)₂SO₄〕0.5，氯化钠(NaCl)0.8磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.03，硼酸(H₃BO₃)0.004，柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇)0.53，硫酸镁(MgSO₄)0.02，氯化钙(CaCl₂)0.5，硫酸锌(ZnSO₄)0.04，硫酸锰(MnSO₄)0.1，硫酸铜(CuSO₄)0.001，葡萄糖(C₆H₁₂O₆)2，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)0.03，硫酸亚铁(FeSO₄)0.04，蔗糖(C₁₂H₂₂O₁₁)3，甘油(C₃H₈O₃)1配制而成，PH调为7.5，500ml三角瓶装100ml液体培养基，以转速为150rpm/min旋转摇瓶，30℃培养3天即得液体种子。

(3)上述(1)中得到的液体种子再摇瓶培养6天，得发酵成熟的真菌生物体，合并后主要计量孢子数(用血球计数器)得液体状生防治菌剂，温室试验使根结线虫的卵、幼虫和雌虫分别比未施菌剂的对照减少76.9％,95.3％和80.3％，使蕃茄增产30％。该菌剂1％浓度使蕃茄种子发芽率增加20％，对蕃茄种子芽生长有显著促进作用。苗移花盆育培，蕃茄成活率80％，对照苗成活率60％。

该菌剂除菌的滤液(代谢产物混合物)，0.5％的浓度使蕃茄种子发芽率提高20％。菌制剂或除菌滤液对蕃茄种子发芽培养过程中的水份保持有一定作用。对剪枝蕃茄无根苗新生根有显著的刺激促进作用，在一定浓度下新生根数量可比自来水对照样增加1倍以上。

实施例2：

扩大培养生物体及制剂制备(中试情况)。

用上述(2)中液体种子接入20升或50升全自动发酵罐，30-31℃恒温培养48小时成熟，液体培养基的组成与上述(2)中的培养基相同。用双层滤纸，布氏漏斗抽滤，冰冻干燥，得纯孢子粉(包括菌丝体)制剂；加入4％硅藻土混匀，倒于双层滤纸并撒有1‰碳酸钙(CaCO₃)的布氏漏斗中抽滤，42℃鼓风机干燥，并辅以一定量的硫酸铵((NH₄)₂SO₄)得可温性粉剂；用3-4千克草炭吸附1000ml发酵液的比例，或用300-400克农作物秸杆糠吸附承载1000ml发酵液的比例，辅以2％活性炭(等辅料)助剂得复合制剂。

实施例3：

用上述微生物制备生物杀线虫制剂粉。(大规模生产)

将(2)中所得液体种子接入4000立升发酵罐中，30-34℃培养48小时后移接入30000立升的发酵罐发酵培养96小时，培养基与(2)中相同投入活性炭、几丁质等辅料复合，放出，用农作物秸杆糠吸附承载并混匀，农作物秸杆糠的用量为1立方发酵液加300-400千克(草糠400千克，豆杆糠350千克，玉米杆糠、甘蔗渣糠300千克)摊晒或42℃烘干即可。

实施例4：

固态法直接制备生物杀线虫制剂。

将上述(1)中所得微生物菌种接入干料100克的瓶或500m三角瓶内培养基中培养，培养基组成为62％麸皮，20％豆饼粉，10％蟹壳粉或虾壳粉，4％蔗糖，3％木屑，1％蚕蛹粉组成原料，加入与原料等量的水，即原料∶水=1∶1，28℃下培养10天，烘干，以1∶1的配比配入草炭即得产品制剂。此产品耐贮藏，存活率高，杀线虫能力强，适用于产量较小的生产，小范围应用的情况，不适于大规模产。