一种槲寄生糖蛋白提取物及含有该提取物的药物组合物及其制备方法

摘要

本发明提供了一种槲寄生糖蛋白提取物,该提取物是一种分子量范围在1万—10万道尔顿之间的糖蛋白,其中该提取物中蛋白质的重量百分含量在0.1—0.8%之间;糖的重量百分含量在0.05—0.4%之间。具有比欧寄生糖蛋白提取物更强的抗肿瘤活性。同时本发明还提供了制备该提取物的方法和含有该提取物作为活性成分的药物组合物。

说明书

本发明涉及制药领域，具体来说涉及一种槲寄生属植物糖蛋白提取物，该提取物是分子量为1万-10万道尔顿的糖蛋白，它具有较强的抗肿瘤活性；本发明还涉及该提取物的制备方法和含有该提取物的药物组合物。

寄生是属于桑寄生科(Loranthaceae)半寄生在乔木、灌木等不同的植物上，其中有槲寄生属和桑寄生属，而槲寄生属中又包括槲寄生又称北寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai.)、白果槲寄生(V.album)、扁枝槲寄生(V.articulatum Burm.f.)、棱枝槲寄生(V.diospyrosicolum Hayata)等13种，目前，已有文献报道欧洲槲寄生(Viscum album L.)即白果槲寄生和朝鲜槲寄生(V.album varcoloratum)即白果槲寄生一种变种的提取物具有抗肿瘤活性。目前德国数家公司生产以欧洲槲寄生提取物为主要活性成分的制剂产品主要用于抗肿瘤的临床治疗。由于这些产品多为粗制剂，其中含有多种植物成分，除含有主要活性成分欧寄生糖蛋白外，还含有对人体有害的毒肽和小分子蛋白质。尽管如此，还没有文献报道槲寄生(Viscumcoloratum(Kom.)Nakai.)糖蛋白提取物用于抗肿瘤的治疗。本发明人通过对中国的槲寄生属进行广泛的研究，最后从槲寄生(Viscumcoloratum(Kom.)Nakai.)中获得分子量范围在1万-10万道尔顿的糖蛋白提取物，该提取物比欧寄生糖蛋白提取物具有更高的抗肿瘤活性，从而完成了本发明。

本发明的目的之一是提供一种抗肿瘤活性更高的槲寄生糖蛋白提取物，该槲寄生提取物是是一种分子量在1万-10万道尔顿之间的糖蛋白，其中该提取物中糖的重量百分含量为0.05-0.4％；蛋白质的重量百分含量为0.1-0.8％。

本发明的目的之二是提供获得槲寄生糖蛋白提取物的方法。

本发明的目的之三是提供含有槲寄生糖蛋白提取物作为活性成分的药物组合物。

由于环境和宿主植物对槲寄生主要活性成分存在较大的影响，所以本发明在原料的选择上，首先对槲寄生的不同宿主植物进行研究，对宿主植物进行了严格的限定，优选榆树、桦树、柳树、枫树、杨树、桃树、槐树、梨树、松树、橡树。

本发明槲寄生糖蛋白提取物的分子量范围为1万-10万道尔顿，优选分子量范围为4万-8万道尔顿：其中该提取物中糖的重量百分含量为0.05-0.4％；蛋白质的重量百分含量为0.1-0.8％。

本发明槲寄生糖蛋白提取物采用以下方法获得：

称取新鲜的槲寄生植物，加入1-4倍重量的重量百分比浓度为0.5-1.5％的氯化钠溶液，进行均浆，浸泡过夜，过滤残渣，把上清液离心20-30min、移去沉淀，上清液过滤，加入重量百分比浓度为50-90％的硫酸铵溶液，低温放置使其沉淀，用重量百分比浓度为0.5-1.5％的氯化钠溶液溶解，透析、上经过0.01-1.25M的盐酸溶液、碳酸钠溶液、磷酸钠溶液其中之一活化的Sepharose 4B或6B柱，用0.01-1M的氯化钠溶液、氯化钾溶液、磷酸缓冲溶液其中之一进行洗脱，接取分子量为1万-10万道尔顿或4万-8万道尔顿的槲寄生糖蛋白洗脱液。进行透析，直到无氯离子为止，即获得本发明所述的槲寄生糖蛋白提取物。

本发明提取物不含有对人体有害的毒肽和小分子蛋白质。该提取物剂量在0.003-0.03mg/kg范围内对荷瘤动物有免疫调节作用，剂量在0.03-0.2mg/kg范围内，可体外抑制多种肿瘤细胞的生长，剂量在0.2-2mg/kg范围内，可抑制动物体内多种移植肿瘤的生长。

本发明槲寄生糖蛋白提取物主要用于各种癌症及免疫抑制性疾病的治疗，如肺癌、胃癌、肝癌、子宫癌，尤其对K562、Hela、肺癌细胞具有较强的杀伤性。

本发明槲寄生糖蛋白提取物与欧寄生糖蛋白提取物在含蛋白质的量、含糖量、毒性、凝血活性方面都存在较大的差异，通过实验我们可以发现，本发明槲寄生糖蛋白提取物比欧寄生糖蛋白提取物具有毒性小、抗肿瘤活性更高的特点。

本发明提取物的特性通过以下具体实验例进行详细的说明。

实验例1

糖含量对比实验

含糖量的测定采用相关文献记载的硫酸蒽酮法进行测定。其中槲寄生糖蛋白提取物中糖的重量百分含量在0.05-0.4％之间；欧洲槲寄生糖蛋白提取物中糖的重量百分含量在0.4-2％之间。

实验例2

蛋白质含量对比实验

蛋白质重量百分含量测定采用相关文献记载的Folin酚法，槲寄生糖蛋白提取物中蛋白质的重量百分含量在0.05-0.4％之间；欧寄生糖蛋白提取物中蛋白质的重量百分含量在1.0-2.8％之间。

实验例3

毒性对比实验

体重为17-20g的昆明小鼠，雌雄各半，同一次实验小鼠体重相差不超过2克，共分为5组，每组6只。将不同剂量的样品溶入注射用生理盐水，静脉注射给药，观察三天内出现的小鼠死亡数。结果发现：槲寄生糖蛋白提取物的LD₅₀为28mg/kg，欧寄生糖蛋白提取物的LD₅₀为7mg/kg。

实验例4

凝血活性对比实验

采用微量血凝实验，仪器为V字形血凝板和显微镜。主要方法为：取正常人血5ml，以柠檬酸钠抗凝，用0.015M磷酸盐稀释3倍后，4℃下，2000rpm离心10min，洗涤4次，将RBC调整为2％，悬浮于V字形板上，然后加入不同浓度含样品的磷酸缓冲溶液，混均，37℃放置2小时，用相同浓度的磷酸缓冲溶液做对照，观察实验结果，本发明槲寄生糖蛋白的凝血活性为17mg/ml，欧寄生糖蛋白提取物凝血活性为21mg/ml。

实验例5

抗肿瘤活性对比实验

采用小鼠肿瘤实验比较本发明的槲寄生糖蛋白提取物和欧寄生提取物的抗肿瘤活性，实验结果发现，本发明槲寄生糖蛋白提取物的肿瘤抑制率为71.88％；而欧寄生糖蛋白提取物的肿瘤抑制率为53.13％，抑制肿瘤活性有显著的提高。

方法：将小鼠接种Lewis肺癌细胞，接种的第二天开始给药，以控制组为对照，每天给药一次，腹腔注射连续18天后称瘤重。实验结果如下表所示：

实验表明槲寄生糖蛋白提取物和欧寄生糖蛋白提取物都有明显抑制肿瘤生长的作用，但本发明提取物的抗肿瘤活性明显高于欧寄生提取物。

采用常规的方法将本发明的槲寄生糖蛋白提取物与药学上可接受的载体制成各种剂型如片剂、胶囊剂、注射剂、冻干粉针剂及其它生物制剂。

现通过以下实施例来更详细的说明本发明。

实施例1

称取10Kg鲜槲寄生，加入2倍重量的重量百分比浓度为0.9％的氯化钠溶液进行均浆，浸泡过夜，过滤残渣，把上清液离心20min、移去沉淀，上清液过滤，加入重量百分比浓度60％的硫酸铵溶液，低温放置使其沉淀，分离出沉淀，用重量百分比浓度为0.9％的氯化钠溶液溶解，透析，上经过0.02M盐酸溶液活化的Sepharose 4B柱，用0.03M的氯化钠溶液进行洗脱，接取分子量为1万-10万道尔顿的槲寄生糖蛋白洗脱液。进行透析，直到无氯离子为止，得本发明所述的糖蛋白提取物600mg。

实施例2

称取20Kg鲜槲寄生，加入3倍重量的重量百分比浓度为0.9％的氯化钠溶液进行均浆，浸泡过夜，过滤残渣，把上清液离心30min、移去沉淀，上清液过滤，加入重量百分比浓度为65％的硫酸铵溶液，低温放置使其沉淀，分离出沉淀，用0.9％的氯化钠溶液溶解，透析，上经过0.01M盐酸溶液活化的Sepharose6B柱，用0.02M的磷酸缓冲溶液进行洗脱，接取分子量为4万-8万道尔顿的槲寄生糖蛋白洗脱液。进行透析，直到无氯离子为止，得本发明所述的糖蛋白提取物1000mg。

实施例3

称取50Kg鲜槲寄生，加入2倍重量的重量百分比浓度为0.9％的氯化钠溶液进行均浆，浸泡过夜，过滤残渣，把上清液离心30min、移去沉淀，上清液过滤，加入重量百分比浓度为70％的硫酸铵溶液，低温放置使其沉淀，分离出沉淀，用重量百分比浓度为0.9％的氯化钠溶液溶解，透析，上经过0.01M盐酸溶液活化的Sepharose4B柱，用0.02M的氯化钠溶液进行洗脱，接取分子量为4-8万道尔顿的槲寄生糖蛋白洗脱液。进行透析，直到无氯离子为止，得本发明所述的糖蛋白提取物2500mg。

实施例5

向30g实施例1所得的槲寄生糖蛋白提取物中加入药理允许常用稳定剂，用注射用水溶解至1000ml，用常规方法进行灭菌处理，进行分装，制成规格为30mg/ml的注射液。

实施例6

向50g实施例2所得的槲寄生糖蛋白提取物中加入药理允许常用生物制品支撑剂，用注射用水溶解至1000ml，灭菌，分装，用常规方法冻干，制成规格为50mg/ml的冻干制剂。