当归提取物与P-糖蛋白相互作用的初步研究

摘要

一、目的:
　　 研究当归提取物及其相关成分对P.糖蛋白功能及表达的影响,以及当归提取物对P-糖蛋白底物罗丹明-123在Caco-2细胞单层模型上双向转运的影响。
　　 二、方法:
　　 1.细胞培养及形态学验证
　　 为研究当归提取物及其相关成分对P-糖蛋白功能和表达的作用而采用P-糖蛋白载体细胞(结肠癌细胞Caco-2)和阴性对照细胞(脐静脉内皮细胞ECV304)。Caco-2细胞和ECV304细胞分别采用MEM培养基、1640培养基进行常规培养；细胞免疫荧光法进行细胞膜上P-糖蛋白表达验证。
　　 2.当归水提物初步分析及细胞毒性实验
　　 首先对当归提取物进行初步的分析。然后,采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)分别考察当归提取物及其相关成分和阳性对照药物维拉帕米、地塞米松及环孢霉素对Caco-2细胞的毒性,选择细胞存活率大于90％的药物浓度作为非细胞毒性剂量进行下一步细胞实验。
　　 3.当归提取物及相关成分对P-糖蛋白功能影响
　　 采用流式细胞术测定胞内罗丹明-123的荧光强度,以地塞米松作为诱导阳性对照,维拉帕米作为抑制阳性对照,分别考察当归提取物及其相关成分对P-糖蛋白的功能有何影响。
　　 4.当归提取物及相关成分对P-糖蛋白表达的影响
　　 使用流式细胞仪分析当归提取物及其相关成分对Caco-2细胞上P-糖蛋白表达的影响,以地塞米松作为阳性诱导对照,不加药的Caco-2细胞为阴性对照。
　　 5.当归提取物及相关成分对罗丹明-123转运的影响
　　 建立Caco-2细胞单层模型,以环孢素A作为阳性抑制对照,考察当归提取物及其相关成分对经典P-糖蛋白功能探针药物--罗丹明-123跨细胞膜转运功能的影响。
　　 三结果:
　　 1.细胞培养和形态学验证
　　 Caco-2细胞和ECV304细胞在正常条件下生长旺盛；Caco-2细胞高表达P-糖蛋白,可用于研究当归提取物及相关成分对P-糖蛋白功能和表达的影响；ECV304细胞低表达P-糖蛋白,适合作为阴性对照细胞。
　　 2.当归水提物初步分析及细胞毒性试验
　　 对当归水提物的初步分析,其中阿魏酸的含量为0.107％,符合《中国药典》标准,而醇提物藁本内酯含量为1.02％,符合外经贸商业协会要求,可用于接下来的实验。
　　 根据以下其他实验所需的最长时间为72小时,选择72小时为MTT的实验时间,结果显示当归水提物、当归醇提物以及阿魏酸浓度等于或者小于100μg/mL时,细胞存活率大于90％；佛手柑内酯的非细胞毒性剂量范围较小,为0.01-1μg/mL；其他三种阳性对照药物维拉帕米、地塞米松和环孢霉素则在0.1-10μg/mL范围内对细胞几乎没有毒性。因此在探讨当归及其相关成分对P-糖蛋白功能的作用实验中,确定当归水提物、当归醇提物和阿魏酸的实验浓度为10、100μg/mL,佛手柑内酯的浓度为1、0.5μg/mL,对照品为10μg/mL。
　　 3.当归提取物及相关成分对P-糖蛋白功能影响
　　 与阴性对照组相比,药物与细胞作用1小时后,当归水提物(10、100μg/mL)对P-糖蛋白介导的罗丹明-123外排显示有一定的增强作用(P<0.05),而佛手柑内酯(1,0.5μg/mL)则有一定的抑制作用,且呈现一定的剂量相关性；当归醇提物(10、100μg/mL)和阿魏酸(10、100μg/mL)与阴性对照组相比荧光强度变化不大,其中这两个药物浓度在10μg/mL时,与阴性组相比没有统计学意义(p>0.05)。
　　 4.当归提取物及相关成分对P-糖蛋白表达的影响
　　 在蛋白水平上,药物与细胞作用72小时后,当归水提物(100μg/mL)组的荧光强度高于阴性对照组37.02％(P<0.05),当归醇提物(100μg/mL)和佛手柑内酯(1μg/mL)组则使荧光强度分别下降了27.77％、15.99％(P<0.05),而阿魏酸(100μg/mL)组较阴性对照组变化不大,结果与功能实验结果有一定的协同作用。
　　 5.当归提取物及相关成分对罗丹明-123转运的影响
　　 罗丹明-123(Rh-123)双向跨膜转运实验结果显示,与阴性对照组(不加药组)相比,当归水提物(100μg/mL)使罗丹明-123从BL-AP侧的渗透系数(Papp)增加,外排率(ER)增加(P<0.05)；当归醇提物(100μg/mL)、阿魏酸(100μg/mL)和佛手柑内酯(1μg/mL)则使BL-AP侧的渗透系数(Papp)下降,AP-BL侧的渗透系数(Papp)有所增加,从而外排率(ER)较对照组降低(P<0.05),说明当归对P-糖蛋白有调节作用,但是由于当归成分较多且复杂,当归水、醇提物以及相关成分对P-糖蛋白的调节方向也不是一致的。
　　 四.结论:
　　 1.当归水提物对P-糖蛋白具有瞬时诱导功能和72小时的表达上调作用,且在罗丹明-123双向跨膜转运中,增加罗丹明-123的外排率,其与P-糖蛋白底物合用是否会引起血药浓度、药效的改变,需要体内实验的确定。
　　 2.当归相关成分佛手柑内酯对P-糖蛋白的功能、表达表现出抑制作用,并能降低罗丹明-123(Rh-123)的外排率。
　　 3.当归醇提物与阿魏酸在罗丹明-123双向跨膜转运中,显示了一定的抑制作用,使罗丹明-123的外排率有所下降,但在P-糖蛋白功能和表达实验中并未表现出明显的作用,其对P-糖蛋白转运的影响还要进一步实验的确定。