红豆杉细胞培养中细胞生长及紫杉醇合成高峰的监测方法

摘要

本发明涉及了一种红豆杉细胞培养中细胞生长及紫杉醇合成高峰的监测方法,其技术要点是根据测得的培养液的电导率数值,监测细胞生长和紫杉醇累积的情况。本发明提供了一种简便、快捷监测红豆杉细胞生长及紫杉醇累积情况的方法,可以对培养细胞进行连续自动监测,能及时了解细胞生长状况和产物合成情况,具有节省人力、物力、提高劳动生产率的特点。

说明书

本发明涉及一种植物细胞工程，特别是一种监测红豆杉细胞培养中细胞生长及紫杉醇合成高峰的方法。

紫杉醇(Taxol)是从红豆杉中提得的一种抗癌药物，已被证明对治疗卵巢癌、乳腺癌及肺癌等有效。目前紫杉醇的提取都以红豆杉树皮为原料，不仅破坏环境，危及红豆杉资源，且红豆杉植物资源缺乏，远不能满足市场需要，因此药源奇缺，价格昂贵。此外，全化学人工合成虽已成功，但其代价极其昂贵而不能用于实际生产。所以，必须寻找可替代的生产途径，用红豆杉植物细胞培养来生产紫杉醇被认为是解决的途径之一。

在红豆杉细胞培养工艺中发现，紫杉醇在细胞培养进行到一定时间才开始快速积累，不久后达到最高值，高峰持续时间往往很短，便开始快速下降，达到高峰的时间往往受细胞培养的状况、接种量和培养条件等的影响而有一定的波动。因此，在生产中如何确定紫杉醇积累高峰的到达，避免因太早或太迟收获而浪费生产能力，成为生产工艺中的一个重要技术问题。

现有监测培养细胞的生长高峰和紫杉醇积累的高峰采用定时取样检测的方法：取样后，将细胞烘干或冻干、称重，经过连续取样测定，才能确定是否达到生长高峰；为测得紫杉醇的产量，则对各个样品的细胞及培养液分别进行浸提、萃取，然后用高效液相色谱仪检测紫杉醇的数值。用上述方法来测定细胞的生长和紫杉醇积累量并以此来确定二者的高峰，每测一个样品需时2～3天。其不足之处是手续繁琐、工作量大、费用高、多次取样容易造成培养物被污染，并且有可能因周期太长而错过产量高峰。

本发明的目的就是提供一种通过测得培养液的电导率数值而判断细胞生长状态和是否到达细胞生长高峰、紫杉醇积累高峰的监测方法。

本发明可由如下方式来实现：能够安装探头的红豆杉细胞培养容器中，把电导率的探头直接放入红豆杉细胞培养容器中，通过测得培养液的电导率数值，对细胞生长和紫杉醇合成情况进行在线监测；不能直接安装电导率探头的红豆杉细胞培养容器，则定期取样测定培养液的电导率数值，监测细胞生长和紫杉醇累积情况。红豆杉细胞是从短叶红豆杉、中间红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、浆果红豆杉或中国红豆杉诱导培养。

本发明提供了一种简便、快捷监测红豆杉细胞生长及紫杉醇累积情况的方法，可以对培养细胞进行连续自动监测，能及时了解细胞生长状况和产物合成情况，具有节省人力、物力，提高劳动生产率的特点。

下面结合附图，对本发明作进一步的描述。

图1为中国红豆杉细胞悬浮培养过程中，胞内、胞外紫杉醇的累积情况。

图2为中国红豆杉细胞悬浮培养过程中，细胞生长和紫杉醇累积与培养液的电导率变化的关系。

电导率仪实际测得的数据与培养液中的离子浓度相关，其数值是离子浓度的一个反映。由于培养液中的主要营养成份是以离子的形式存在液体中，因此，从电导率的下降程度可了解营养物质消耗的情况。而细胞的生长、次生产物的积累都与营养消耗有直接的关系。申请人在研究中发现，在红豆杉细胞悬浮培养中，培养液的电导率变化与细胞生长和紫杉醇累积曲线恰成反相关。当电导率降到最低值时，细胞干重达到高峰，而紫杉醇累积的高峰总是有规律地在细胞干重达到高峰后的一段时间(如二天)出现。因此，培养液的电导率变化可作为确定细胞干重和紫杉醇高峰期的依据。

申请人通过以下实验，得出红豆杉细胞悬浮培养过程中细胞生长和紫杉醇累积与培养液的电导率变化的关系。

1、实验材料：试验材料为经过20次继代培养的中国红豆杉悬浮培养细胞，采用B₅培养基，添加适量NAA和6-BA及2％蔗糖，培养基PH值调至5.8。

2、试验方法：在250ml锥瓶中盛100ml液体培养基，每瓶接种约0.4克(干重)鲜细胞，摇床转速为120r/min，25℃左右黑暗中培养，每隔2～3天取样一次，测定各种指标。

(1)细胞干重的测定：取样后，将悬浮培养物用120目筛过滤，滤液用三角瓶盛好，待用。所得细胞用蒸馏水洗干净，滴干后置60℃烘干、称重。

(2)电导率的测定：过滤所得培养液用DDS-11D电导仪测定电导率，单位为ms/cm。

(3)紫杉醇的提取与检测：量取50ml培养液，用二氯甲烷(体积比为1∶1)萃取三次，合并后回收二氯甲烷，残渣用少量甲醇溶解、定容。另外，称取0.5克干细胞样品(研细、过80目筛)，用30ml甲醇浸提过夜，并超声15分种，静置后收集上层清液，重复3次。合并甲醇后回收，残渣用蒸馏水洗三次，洗液用相同体积的二氯甲烷萃取，其它操作同培养液的萃取。样品检测采用Waters HPLC系统；流动相为甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)；流速1ml/min；检测波长227nm。标准品购自SIGMA公司。

3、结果

(1)中国红豆杉细胞悬浮培养过程中，胞内、胞外紫杉醇的累积情况。

实验结果见表1和图1，从表1可以看出，细胞接种到新鲜培养基后，起始并不累积紫杉醇，胞内紫杉醇含量逐渐降低，培养一段时间后，胞内胞外的紫杉醇含量逐渐上升，且两者累积的趋势是一致的，见图1。培养25天时，两者同时达到最高点，此时胞外的紫杉醇含量是7.43mg/L，胞内的紫杉醇含量是0.019％(占细胞干重)，约合2.6mg/L。说明这种细胞产生的紫杉醇主要是分布在胞外的(约占总量的74％)。从图1还可看出，紫杉醇产量达到最高点后下降比较快，表明在生产中确定最佳收获期是极为重要的。

表1中国红豆杉细胞悬浮培养中细胞生长和紫杉醇累积与培养液中电导率的变化培养时间(天)    0      7      11     15     18     21     23     25     28     30细胞干重(g/l)   4.0    7.2    8.1    8.6    11.7   12.8   14.0   13.6   13.2   13.0胞内紫杉醇(％)  0.0060 0.0027 0.0040 0.0080 0.0109 0.0129 0.0167 0.0190 0.0190 0.0170胞外紫杉醇(mg/l)0      0．48  0.57   0.78   1.39   2.72   5.37   7.43   6.02   4.99紫杉醇总量(mg/l)0.24   0.67   0.89   1.47   2.66   4.37   7.80   10.03  8.53   7.20电导率(ms/cm)   4.05   3.60   3.40   3.30   2.94   2.65   2.50   2.50   2.50   2.50

(2)中国红豆杉细胞悬浮培养过程中，细胞生长和紫杉醇累积与培养液的电导率变化的关系。

实验结果见图2，可见细胞接种到新鲜培养基后，基本上没有延迟期，细胞干重逐渐增加。培养至11天时，细胞干重增加了一倍，18天后增加了二倍，培养了23天后，细胞干重达到最高点，显示细胞生长已达到末期。而细胞生长与紫杉醇累积并不是同步的，细胞生长迅速的指数很少合成紫杉醇，当细胞生长进入稳定期(约18天)后，紫杉醇含量迅速增加，从18天到25天的培养过程中，紫杉醇的总量增加了4倍，第25天达到高峰，比细胞干重的高峰延迟了2天。细胞干重达到最高点后缓慢下降，而紫杉醇含量达到高峰后下降很快，故紫杉醇累积曲线的峰形较尖陡，而生长曲线的峰形较平缓。

从图中还可以看出，细胞接种后，培养液的电导率数值逐渐下降，最后稳定于一个最低点，此时，细胞干重正好达到最高点，紫杉醇的累积最高点在电导率达稳定低值的两天后出现，说明培养液的电导率与细胞生长和紫杉醇累积存在着一定的相关性。从而，我们可以通过测定电导率的变化来监测细胞的生长及紫杉醇合成情况，因此，电导率可以作为生产中确定最佳收获日期的一个依据。

实施例一

在红豆杉细胞培养反应器中，把电导率的探头直接放入细胞培养器中，便可直接连续读得电导率的数值，对细胞生长和紫杉醇合成情况进行在线监测。当电导率数值逐渐下降，最后稳定一个最低点(2.5ms/cm)时，紫杉醇的累积高峰在电导率达稳定低值的两天后出现，应做好采收准备。

红豆杉细胞是从短叶红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉、浆果红豆杉、中间红豆杉、南方红豆杉或西藏红豆杉诱导培养。

实施例二

不能直接安装电导率探头的红豆杉细胞培养器，二天取一次样，测定培养液的电导率数值，其它与实施例一相同。