聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药

摘要

本发明公开了一种聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药。该紫杉醇或多烯紫杉醇的前药,是利用氨基酸或寡肽把水溶性的聚乙二醇与紫杉醇或者是把聚乙二醇与多烯紫杉醇键接起来构成紫杉醇或多烯紫杉醇的衍生化合物,特征在于在紫杉醇或多烯紫杉醇结构式中2’的位置OH上,键接PEG－[－(X)－CH2C(O)－A－NH－CH(R)－C=O]n基团取代H。本发明紫杉醇或多烯紫杉醇的前药,水溶性好,在人体内酶的调控作用下,达到缓释目的,制备成本低。

说明书

本发明涉及一种聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药。是属于水溶性紫杉醇或多烯紫杉醇的衍生化合物。

紫杉醇及多烯紫杉醇治疗肿瘤具有良好的疗效已被世人认知。当它们作为一种注射治疗药物时，由于它们的水溶性极差，难以被人体吸收而充分发挥其药效。因此，现行的临床注射液都是通过用聚氧乙烯蓖麻油与脱水乙醇以1∶1混合液稳定紫杉醇，配制浓度为6mg／ml溶液，再用生理盐水或5％葡萄糖稀释至最终给药体积。这样的紫杉醇注射液，其中的表面活性剂对病人有较为严重的超敏性反应副作用。因此，开发水溶性的紫杉醇、或多烯紫杉醇的前药，越来越受到人们的重视。目前，已开发出水溶性紫杉醇的衍生物包括氨基酸盐类、磺酸盐类、羧酸盐类、碳酸酯类和磷酸酯类。

本发明的目的，在于提供一种聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药。该水溶性紫杉醇或多烯紫杉醇衍生化合物，具有良好的水溶性，并可通过人体内酶的调控作用，达到良好的缓释目的，药效期长，疗效高。

为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。利用氨基酸或寡肽把水溶性的聚乙二醇与紫杉醇，或者是把聚乙二醇与多烯紫杉醇键接构成如下式1和式2所示的紫杉醇衍生物化合物，即紫杉醇的前药，及多烯紫杉醇衍生化合物，即多烯紫杉醇的前药，式1式2

其特征在于，在以上两个结构式中，位于2’位置上的OH基上，键接PEG-[(X)CH₂C(O)-A-NH-CH(R)-C=O]n基团，取代H，基团中，X为O，或为OCOCH₂或为NH，或为NHCOCH₂；A为一化学单键，或为选自(l)-丙氨酸，(l)-亮氨酸，甘氨酸，(l)-异亮氨酸，(l)-脯氨酸，(l)-苯丙氨酸，(d)-苯丙氨酸，(dl)-苯丙氨酸，(dl)-蛋氨酸中的一种氨基酸，或者为寡肽；R为氨基酸的残基；n等于1或等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为2000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为亮氨酸，n等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为6000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为亮氨酸，n等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为20000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为亮氨酸，n等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为2000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为脯氨酸，n等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为6000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为脯氨酸，n等于2；

上述的紫杉醇或多烯紫杉醇的一种前药，它的PEG分子量为20000，X为OCOCH₂，A为一化学单键，R为脯氨酸，n等于2。

下面对本发明加以详细说明。

本发明利用聚乙二醇为支载体，其理由有两点，一点是经近年来的深入研究，已证明聚乙二醇是无毒的、与生物相适的、蛋白质排斥的、无感染的和非抗原性的药物良好载体；另外，它又有着良好的水溶性及与其它有机物的良好可溶性，有利于进行化学反应修饰的特性。并且通过控制分子量的大小及药物与聚合物之间的连接臂，可以改变三者结合物在人体内循环周期和释放速度。为此，本发明确定聚乙二醇分子量在2000～20000之间为宜，其中2000、6000、20000为最佳；如果选用过大分子量的聚乙二醇，它的水溶液粘度较大，不利于输液，如果分子量小于2000，则又加大了毒性，不能使用。本发明的合成制备路线包括以下四个步骤：

1)制备官能团化的聚合物聚乙二醇二酸，其主要过程是聚乙二醇经甲苯共沸除水后与过量的丁二酸酐在干燥的氯仿中，在吡啶催化下回流反应48小时制得。

2)制备聚乙二醇二酸的活泼酯。其主要过程是聚乙二醇二酸与羟基丁二酰亚胺在二甲基甲酰胺中，在二环己基碳二亚胺及二甲氨基吡啶作用下，室温反应6～20小时制得。

3)聚乙二醇二酸与氨基酸或寡肽的连接。其主要过程是将上述过程制得的聚乙二醇二酸活泼酯溶于二甲基甲酰胺，滴加到氨基酸或寡肽的碳酸氢钠水溶液中，室温反应24小时制得。

4)药物分子的引入。其主要过程是将上述连有氨基酸的聚乙二醇与紫杉醇、或与多烯紫杉醇，在干燥的二氯甲烷中，在二环己基碳二亚胺与二甲氨基吡啶作用下，冰浴反应3小时后，再室温反应20小时制得前药。上述的过程中，主要合成路线如下式所示：

以上述步骤和工艺路线所制备的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药为白色粉末，熔点在36～60℃之间。

本发明制备的前药的体外抗癌活性明显好于紫杉醇和多烯紫杉醇。例如PEG_2K-SUC-Pro-Taxol和PEG_2K-SUC-Leu-Taxol对人体乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率在10^-11M为84．7％和61．1％，而紫杉醇仅为43．1％。

下面再以实施例对本发明加以进一步说明。

实施例一：

聚乙二醇-2000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PEG_2K-SUC-Pro-Taxol)

1．聚乙二醇-2000-二酸(PEG_2K-SUC)的合成

称取10．0g(0．005mol)的聚乙二醇-2000溶于50ml甲苯中与甲苯共沸蒸馏除水，待甲苯蒸掉三分之二后向反应体系中加入15ml三氯甲烷和事先称量好的5．0g(0．05mol)丁二酸酐，并加入2ml的吡啶，在60℃左右回流反应48小时。反应完毕后减压蒸干溶剂，而后向残余物中加入20ml的0．1M的碳酸氢钠水溶液，再抽滤，滤液用0．1N的盐酸20ml酸化，用浓盐酸将溶液pH值调到3-4，而后在用3×15ml的乙酸乙酯洗涤水层，合并乙酸乙酯溶液用2×15ml的饱和氯化钠水溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，一小时后抽滤溶液，旋转蒸干滤液中的溶剂，加入2ml的乙酸乙酯加热使之将残余物溶解，而后在超声震荡中向溶液中加入大量无水乙醚，冷冻结晶，抽滤，用少量乙醚洗涤滤饼得白色固体，真空干燥至恒重，称重9．8g，产率89％，熔点46．5-47．5℃产物无需纯化直接用于下步反应。

2．聚乙二醇-2000-二酸-活泼酯(PEG_2K-SS)的合成

5．0g(2．28mmol)的聚乙二醇-2000-二酸(PEG_2k-SUC)溶于25ml干燥的二氯甲烷中，并冷却至0-5℃后，加入1．04g(5．0 mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)和0．58g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于25ml二氯甲烷的溶液，并于此温度下搅拌反应2小时，室温下反应24小时。反应完毕后用30ml的蒸馏水洗涤反应液，用30ml饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥。一小时后过滤，浓缩滤液，在加入30ml二氯甲烷并加热使之溶解，再过滤溶液，浓缩滤液后加入3ml二氯甲烷加热使之溶解，在超声震荡中倾入30ml无水乙醚中，冷冻结晶，抽滤溶液，用少量乙醚洗涤滤饼得白色固体，真空干燥至恒重，5．0g，产率93％，测熔点36-37℃。

3．聚乙二醇-2000-二酸-脯氨酸(PEG2K-SUC-Pro)的合成

将1．0g(0．418mmol)聚乙二醇-2000-二酸活泼酯(PEG2K-SS)溶于3ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将0．1000g(1．0mmol)脯氨酸溶于4ml 1M NaHCO3溶液，并超声震荡10min使之充分溶解，向活泼酯的DMF溶液中滴加氨基酸的碳酸氢钠溶液，反应液变浑浊并且放热，室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，减压蒸馏除去反应体系中的水和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，蒸馏后的残余物用20ml 2％的HCl溶解，放出大量CO2气体，再用3×5ml的二氯甲烷萃取，合并萃取液用10ml的蒸馏水洗涤溶液，10ml饱和氯化钠溶液洗涤至澄清，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，加入30ml的乙醚，冷冻结晶，抽滤，用少量乙醚洗涤滤饼得白色固体，真空干燥至恒重，0．9800g，测熔点41．5-42．5℃。

4．聚乙二醇-2000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PEG_2K-SUC-Pro-Taxol)的合成

先将100．0mg(约0．0418mmol)的聚乙二醇-2000-二酸-脯氨酸(PEG_2K-SUC-Pro)加入50ml烧瓶中，再用移液管加入10ml的二氯甲烷，在冰水浴中搅拌至0℃，加入100．0mg(0．1170mmol)的紫杉醇(Taxol)，15．0mg(0．1030mmol)对二甲基氨基吡啶(DMAP)和30．0mg(0．1450mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应24hr。反应完毕后，向反应体系中滴加1ml 10％的HAC／THF溶液。十分钟后加入10ml 0．1N HCl溶液洗涤有机相，后用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和氯化钠溶液洗去有机相中的水，加入少量无水硫酸钠干燥。一个小时后过滤，并浓缩滤液，再加入15ml二氯甲烷溶液，用脱脂棉过滤，再浓缩滤液，后加入2ml异丙醇溶液冷冻结晶，减压过滤，得白色固体，用乙醚洗涤固体，真空干燥至恒重，0．0796g，熔点44-45℃。紫杉醇含量为22％。

实施例二：

聚乙二醇-6000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PEG_6K-SUC-Pro-Taxol)

制备疗法与实施例一相同，各步骤主要条件为：1、聚乙二醇-6000-二酸(PEG_6K-SUC)

称取60．0g(0．0100mol)的聚乙二醇-6000溶于200ml甲苯中与甲苯共沸蒸馏除水，待甲苯蒸掉三分之二后向反应体系中加入100ml三氯甲烷和事先称量好的5．0g(0．05mol)丁二酸酐，并加入2ml的吡啶，在60℃左右回流反应48小时。得到产品52．0g，熔点54．0-55．5℃。2、聚乙二醇-6000-二酸-活泼酯(PEG_6K-SS)

31．0g(5mmol)的聚乙二醇-6000-二酸(PEG-SUC)溶于100ml甲苯中，共沸去水后，冷却至室温，加入100ml干燥的二氯甲烷，并冷却至0-5℃后，加入把2．0800g的二环己基碳二亚胺(DCC)和1．2040g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并于此温度下搅拌反应2小时，室温下反应24小时。得到产物26．2g，产率93％，熔点52．5-54．0℃。3、聚乙二醇-6000-二酸-脯氨酸(PEG_6K-SUC-Pro)

将3．0g(0．4827mmol)聚乙二醇-6000-二酸活泼酯(PEG_6K-SS)溶于10ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将0．2000g(1．7mmol)脯氨酸溶于4ml 1M NaHCO₃溶液，并超声震荡10min使之充分溶解，向活泼酯的DMF溶液中滴加氨基酸的碳酸氢钠溶液，反应液变浑浊并且放热，室温下搅拌反应24小时。得产品2．2991g，产率76％，熔点41．5-42．5℃。4、聚乙二醇-6000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PEG_6K-SUC-Pro-Taxol)

先将0．2500g(约0．0401mmol)的聚乙二醇-6000-二酸-脯氨酸(PEG_6K-SUC-Pro)加入50ml烧瓶中，再用移液管加入10ml的二氯甲烷，在冰水浴中搅拌至0℃，加入100．0mg(0．1170mmol)的紫杉醇(Taxol)，15．0mg(0．103mmol)对二甲基氨基吡啶(DMAP)和30．0mg(0．1450mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应24hr。得前药0)．2311g，产率81％，紫杉醇含量为9．1％。

实施例三：

 聚乙二醇-20000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PERG_20K-SUC-Pro-Taxol)

制备方法与实施例一相同，各步骤主要条件为：1、聚乙二醇-20000-二酸(PEG_20K-SUC)

称取100．0g(0．01mol)的聚乙二醇-20000溶于300ml甲苯中与甲苯共沸蒸馏除水，待甲苯蒸掉三分之二后向反应体系中加入100ml三氯甲烷和事先称量好的5．0g(0．05mol)丁二酸酐，并加入2ml的吡啶，在60℃左右回流反应48小时。得产品98．1g，熔点57．0-58．5℃。2、聚乙二醇-20000-二酸-活泼酯(PEG_20K-SS)

38．4g的聚乙二醇-20000-二酸(PEG_20K-SUC)溶于100ml甲苯中，共沸去水后，冷却至室温，加入100ml干燥的二氯甲烷，并冷却至0-5℃后，加入2．0800g的二环己基碳二亚胺(DCC)和1．2040g的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于30ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并于此温度下搅拌反应2小时，室温下反应24小时。得产物35．6g，产率95％，测熔点58．5-59．0℃。3、聚乙二醇-20000-二酸-脯氨酸(PEG_20K-SUC-Pro)

将5．0g(0．2473mmol)聚乙二醇-20000-二酸活泼酯(PEG_20K-SS)溶于25ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将0．1200g(1．0400mmol)脯氨酸溶于4ml 1M NaHCO₃溶液，并超声震荡10min使之充分溶解，向活泼酯的DMF溶液中滴加氨基酸的碳酸氢钠溶液，反应液变浑浊并且放热，室温下搅拌反应24小时。得产品2．2913g，产率45％。

4、聚乙二醇-20000-二酸-脯氨酸-紫杉醇(PEG_20K-SUC-Pro-Taxol)

先将0．4000g(约0．0197mmol)的聚乙二醇-20000-二酸-脯氨酸(PEG_20K-SUC-Pro)加入50ml烧瓶中，再用移液管加入10ml的二氯甲烷，在冰水浴中搅拌至0℃，加入50．0mg(0．0585mmol)的紫杉醇(Taxol)，10mg的对二甲基氨基吡啶(DMAP)和20mg的二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应24小时。得产品0．3366g，产率84％，紫杉醇含量为3．8％。

本发明的聚乙二醇支载的水溶性紫杉醇或多烯紫杉醇前药，具有良好水溶性，在人体内通过酶的调控作用，达到良好的缓释目的，疗效期长，疗效高，其制备路线简单，成本较低。