九州虫草菌的人工培养方法及其子实体的应用

摘要

一种中国新纪录种九州虫草菌的人工培养方法及其子实体的应用,它是将九州虫草野生菌进行单孢子或单菌落纯化,再将纯化后的菌株回接到以无菌条件下饲养的活体豆天蛾幼虫为主要成分的培养基上,在适宜培养条件下,自然感染,即培养出与天然九州虫草相同的子实体。该方法克服了现有技术中存在的菌种败育现象严重的问题,具有菌种稳定、生产周期短、可以连续、批量生产、有效营养成分含量高的优点,采用纯子实体入药,可制成胶囊剂、片剂、也可作为药膳和保健食品、口服液、饮料和补酒等的原料。其用量少,制剂的药用效果显著。

说明书

本发明涉及一种微生物真菌的人工培养方法，特别是在我国首次发现的中国新纪录种——九州虫草菌(Cordyceps KyushuensisY.Kobayasi)的人工培养方法及其子实体的应用。

虫草菌为常用与常见真菌，野生虫草具有多种药用作用，滋补作用，已成为传统的珍贵中药材，倍受消费者的青睐。但由于其野生资源极为短缺，且生长环境特殊，野生量有限，再加上过度采挖，已远不能满足需求。为此，许多科学工作者都在致力于虫草的人工培养，试图解决现有野生虫草资源短缺的问题。据有关文献报道的一些虫草属真菌的人工培养方法主要有：《冬虫夏草菌丝的工业生产方法》(专利号85107991)与《虫草菌种814选育及其发酵工艺》(专利号85102231)，都是用其分离的纯菌种进行深层培养，以发酵工艺而获得菌丝体，到目前为止，它只完成了无性世代，尚不能人工培养。《蚕蛹虫草的人工培育方法》(专利号87106987)是利用蛹虫草的轮枝菌接种到固体培养基上，待菌丝长到一定程度再放入蚕蛹，让其自然感染而长出子实体。其培养时间长，且入药时将子实体与蛹体一起用，因蛹体大，子实体仅占其五分之一左右，蛹体内的有效成分大部分已转化到子实体上，故实际应用效果受到影响。《人工培养巴西虫草的方法》(90109380.7)是利用巴西虫草菌接种于家蚕上，而获得虫、菌结合体。其应用仍不是纯子实体。据《天津药学》98年第10卷第1期报道“虫草明显增加小鼠的脾脏重量，发现引起脾重增加的成分在子座，虫体无效。”可见虫草入药起药效作用的主要在子实体，不是虫体。《中华被毛孢及其完成有性阶段冬虫夏草的技术》(88103453)中的中华被毛孢为冬虫夏草的无性型，其菌种要经过几个月的培养才能产生孢子，再用无性孢子浸染寄主斜脉蝠蛾幼虫，经10度左右低温处理后，在18℃左右保温培养，经两个月长出子座，整个培养周期较长。由于其孢子中的败育现象存在，因而萌发率低，接种后寄生率也低，子实体难以形成，因此影响其推广应用。

本发明人曾在《北冬虫夏草菌人工栽培子实体的方法》(93105056.1)、《蛹虫草优良菌种的选育及高产栽培方法》(94110061.8)、《蛹虫草高产栽培方法》(97105853.0)等专利文献中公开了蛹虫草(又名北虫草)人工栽培的方法。该方法利用以大米为主要成份的固体培养基，成功地培养蛹虫草，但其基质单一，脱离了原生物体的营养状况，不能完全满足子实体生长的需要，菌种退化，会出现药理活性减退的问题，有效营养成分含量低。因此，上述人工培养方法有时不能保证菌种稳定，给进行连续培养虫草菌子实体的工作增加了难度。另外在《菌物系统》2000年第19卷第2期296页公开了“中国新纪录种-九州虫草”，它是在沈阳东部山区采集的寄生于豆天蛾(Clanis Bilineata Walker)幼虫体上一种虫草菌，鉴定为九州虫草(Cordyceps Kyushuensis Y.Kobayasi)。其外观和形态特征简述如下：子实体生于从豆天蛾幼虫上形成的菌索(菌丝束)上，菌索白色。子座橙红色，高1.7-8.6cm，直径0.2-0.6cm，子囊壳半内生，卵形，367-495×260-316μm。子囊圆柱形，直径3.5-4.8μm。次生子囊孢子短柱形，3.9-5.4×1.0-1.2μm。但目前国内外公开文献上尚无九州虫草人工培养方法的报道。

本发明的目的就在于提供一种中国新纪录种-九州虫草菌的人工培养方法及其子实体的应用，该方法有效克服了现有培养虫草技术中存在的不能进行全人工培养、培养时间长、菌种退化现象严重等问题，具有菌种稳定，生产周期短，可以连续、批量生产、有效营养成分含量高的优点，采用纯子实体入药，其用量少，制剂药用效果显著。

本发明的目的是这样实现的：该方法是先将九州虫草(CordycepsKyushuensis Y.Kobayasi)野生菌进行单孢子或单菌落纯化，纯化后的菌株制成液体菌种回接到以表面消毒的饲养的活体豆天蛾幼虫为主要成分的培养基上，在适宜培养条件下自然感染，继续培养直至长出九州虫草子实体。

由于本发明的人工培养方法所采用的培养基是以无菌条件下人工饲养的活体豆天蛾幼虫为主要成分，该幼虫体大，营养丰富，且体内不存在野生活体幼虫体内的杂菌，所以在对野生菌进行纯化育种时，不仅可以确保选出与野生九州虫草相同的纯菌种，而且在接种继续培养过程中能长出与天然九州虫草子实体相同的人工培养九州虫草子实体。该方法与其它虫草人工培养方法相比，生产周期短、菌种稳定，显著提高九州虫草菌的感染率，其培养成活率及长出子实体率均达到100％以上，转化率最高达168.3％，也为连续批量生产、高产打下良好基础。还可有效防止药理活性减退，经中国科学院沈阳应用生态研究所和辽宁省中药新药研制开发中心测试，其结果表明：人工培养长出的子座经切片和显微镜观察，其外部形态和内部特征均与天然九州虫草的特征相近，详见表1：

                      表 1

特征天然九州虫草人工培养九州虫草子座长度子座的色泽子座头部形状子囊壳量度子囊宽度次生子囊孢子量度1.7-8.0cm橙红色圆柱形至棍棒形367-500×250-316μm3.5-5μm3.9-5.4×1-1.2μm6-12cm橙黄色至浅橙红色圆柱形至棍棒形350-550×200-300μm3-4.5μm3.5-4.8×1-1.2μm

人工培养长出的蛹虫草子实体与人工培养长出的九州虫草子实体的营养成分差别较大：详见下表：

                       表 2

  营养成份    蛹虫草  冬虫夏草    九州虫草氨基酸   mg/100g虫草多糖 mg/g虫草素   ％维生素A  mg/KgSe       mg/KgSOD      U/mg   1936213.20.231.250.2035.7    1898811.20.070.3150.148.68    2408319.750.353.000.3942.4

由此可见，人工培养九州虫草子实体的有效营养成分含量高。采用纯子实体入药和用于保健品，不仅增强天然九州虫草的补肺、益肾、止血化痰药用和保健作用，有效治疗肺、肾两虚引起的疾病，而且还具有对荷瘤动物的扶正(促进调节免疫功能)、祛邪(抑制肿瘤生长提高生命延长率)、减毒(减轻化疗副损伤促进造血机能等药理作用。能明显抑制癌细胞生长，恢复疲劳，进一步提高人体免疫功能。因人工培养的九州虫草子实体的有效营养成分含量高，故用量少，可在确保疗效的情况下，降低制药成本。正因为如此，该人工培养九州虫草已被列入科技部的重点科技攻关项目和进行国家一类新药的研究，其子实体可制成九州虫草胶囊剂和九州虫草片剂，也可以作为药膳和保健品、口服液、饮料和补酒等原料。

以上结合附图和实施方法详细说明本发明。

图1是野生的九州虫草形态特征图。

图2是用豆天蛾幼虫培养基人工培养的九州虫草形态特征图。

图3是用混配培养基人工培养的九州虫草形态特征图。

根据图1-2所示，人工培养九州虫草与野生九州虫草的形态特征相近，详见图1-2。本发明的培养方法与其它虫草菌人工培养方法不同，其主要特点是先将采集到的野生九州虫草菌进行组织或孢子分离，再进行单菌落成单孢子纯化，培养菌丝后在显微镜下观察，将符合九州虫草菌特征的纯化菌株制成液体菌种，回接到以表面消毒的无菌条件下饲养的活体豆天蛾幼虫的培养基上或以上述豆天蛾幼虫冻干粉再混配谷米制成的混配培养基上，自然感染待菌丝充满培养基，在适宜培养条件下即可长出与野生九州虫草相同的子实体。

上述方法中，在无菌条件下饲养的豆天蛾幼虫宜选用3令-5令(生长期七天左右为一令)活体幼虫接入液体菌种。在1百重量份混配培养基中，各组分的重量比分别是：无菌条件下饲养的活体豆天蛾幼虫冻干粉3-5份，含有薏米、碎玉米、大米等谷米97-95份，营养水为上述原料总重量的1.4倍。所用的营养水是按以下方法配制的：在1千重量份的营养水中含有九州虫草子实体纯粉1-1.5份，KH₂PO₄  2-2.5份，K₂HPO₄  1-1.5份MgSO₄  1-1.5份，余量为水。所用的液体菌种是将纯化后的菌株接种到液体培养基中得到的，其液体培养基中每百重量份含有豆天蛾幼虫冻干粉3-5份，马铃薯10-15份，糖1-2份，维生素B₁ 0.001-0.002份，余量为水。

通过对人工九州虫草子实体进行的系统研究结果如下：

药效研究表明：

人工九州虫草子实体以300mg/kg、600mg/kg的剂量灌胃给药10天，可使S₁₈₀实体瘤荷瘤小鼠的脾指数、碳素廓清指数与吞噬指数、血清溶血素与脾细胞介导的SRBC溶血素、M_吞噬指数等免疫指标明显增高，与荷瘤对照比较P＜0.05或0.01。

人工九州虫草子实体以300mg/kg、600mg/kg的剂量灌胃给药10天，可使S₁₈₀实体瘤荷瘤小鼠的TNF-β和IL-2有明显的促进作用，并明显优于以香菇多糖为复方的中药对照药强力康(P＜0.01)。

人工九州虫草子实体以300mg/kg、600mg/kg的剂量灌胃给药10天，可使S₁₈₀实体瘤荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率分别为20.83％和30.72％；对S180腹水型BALB/C小鼠的生命延长率分别为193％和185％；与环磷酰胺作用相似180％。

人工九州虫草子实体以300mg/kg、600mg/kg的剂量灌胃给药10天，对环磷酰胺所致小鼠周围血白细胞的降低有一定的保护作用，与对照组相比较P＜0.05。

此外，人工九州虫草子实体可使正常小鼠免疫器官的胸腺及脾脏重量明显增加；并可使氢考所致免疫功能低下小鼠的胸腺重量、T淋巴细胞酯酶染色率、鸡红细胞吞噬指数明显增加；还可使正常小鼠耐缺氧时间及低温水浴游泳时间明显延长。

初步临床研究结果

以每日1.2g的口服剂量连续给药28天，并于第二周开始化疗一个疗程。结果显示：30例中晚期癌肿患者的消化道副反应数、白细胞下降数、NK细胞活性升高例数均明显优于对照高聚金葡萄菌素。

                   表 3   30例患者肿瘤分布情况(见表3)

    组别  肺癌  胃肠道癌恶性淋巴癌乳腺癌其他总计人工九州虫草子实体组高聚金葡萄菌素组   197    65    31    13  13  3019

药理研究表明：人工九州虫草子实体不但可以抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，延长荷瘤动物存活期，还对荷瘤动物具有明确的免疫调节作用，特别是对荷瘤动物的TNF-β与IL-2的调节作用上明显优于目前临床广泛使用的植物多糖类免疫调节剂，证明该药具有抑制肿瘤生长和促进免疫调节机能的双重药理作用。

化学研究表明：人工九州虫草子实体含有较多的核苷类化合物、其含量明显高于同类虫草属真菌及人工制品，其主要活性成分虫草素具有明显的抑制肿瘤生长并与环磷酰胺有明显的协同作用，其含量为蛹虫草菌粉的10倍以上。人工九州虫草子实体与临床常用的扶正祛邪类复方制剂及其它人工虫草属制品相比具有剂量小(1.35g/日)、药材及制剂的可控性强，易为国际市场所接受等特点。

初步毒理研究表明：人工九州虫草子实体毒性小，用药安全。

急性毒性试验表明：人工九州虫草子实体对小鼠灌胃给药的最大耐受量为10g/Kg，相当于成人一日用量的444倍。

长期毒性试验表明：连续16周给大鼠灌胃给予人工九州虫草子实体1.2g/Kg.d及0.6g/Kg.d(相当于临床用量的53.3倍和26.7倍)，对大鼠一般体征、行动行为、生长发育、血象检查、肝、肾功能等生化检查及病理检查均未发现异常改变，提示本品长期用药安全。

综上所述，人工九州虫草子实体及其制剂具有资源丰富，药理作用明确，主要活性物质基本清楚，毒性符合我国现行新药审批要求，药材与制剂可控性强等特点，是一个非常有前途的扶正祛邪肿瘤辅助治疗药。它的开发成功不但可使我国在虫草属真菌开发领域中继续占据领先地位，还可创造相当的社会效益与经济效益。

本发明的具体实施方法及应用如下：

实施方法1：

将采集的野生九州虫草子实体进行表面消毒，剥去外层，露出髓部，用消毒刀片取0.2-0.3cm组织块放在灭菌的培养基平皿上，经过7天适温培养，挑取健壮菌丝放于试管斜面上，再适温培养7-10天，根据菌丝生长情况进行粗选，再接于平皿上，在接种点周围插片，让其生长，5天左右，取出盖玻片，在显微镜下观察菌丝形态，符合该菌株的菌丝特征的留下制成液体菌种，再回接到豆天蛾幼虫体上，能够长出与野生九州虫草子实体相同的即为入选的纯菌种。该液体菌种是将纯化后的菌株10毫克接入100毫升液体培养基中，每百分份液体培养基中含有豆天蛾幼虫冻干粉3-5份，马铃薯10-15份，糖1-2份，维生素B₁ 0.001-0.002，余量为水。

实施方法2：

将入选的纯菌种1毫升接种到经表面消毒的3令豆天蛾幼虫体上，让其自然感染30天左右，待菌丝充满其体内，覆盖经灭菌的生境土壤2厘米，20天左右，便从幼虫体上长出橙红至橙黄色九州虫草子实体。

实施方法3：

将入选的纯菌种1.5毫升接种到经表面消毒的4令豆天蛾幼虫体上，让其自然感染35天左右，待菌丝充满其体内，覆盖经灭菌的生境土壤2.5厘米，20天左右，便从幼虫体上长出橙红至橙黄色九州虫草子实体。

实施方法4：

将入选菌种2毫升接种到经表面消毒的5令豆天蛾幼虫体上，让其自然感染40天左右，待菌丝充满其体内，覆盖经灭菌的生境土壤3厘米，20天左右，便于幼虫体上长出其子实体。

实施方法5：

用豆天蛾幼虫冻干粉3公斤，薏米10公斤，碎玉米12公斤，大米75公斤，混合均匀，装入罐头瓶(或塑料瓶、袋中)每瓶装30克，加入营养水42毫升，制成混配培养基，灭菌后接入液体菌种2毫升，适温培养20天左右，待菌丝基本布满培养基表面并向下延伸，给予散射光照(2500LUX左右)，进行通风(瓶口薄膜扎眼通气)，门、窗错开每天3-4次，每次20-30分钟，室内湿度为85-90％，25-30天即可采收子实体。

实施方法6：

用豆天蛾幼虫冻干粉4公斤，薏米9公斤，碎玉米11公斤，大米76公斤，混合均匀装入瓶(或袋)中，每瓶装量40克，加营养水56毫升，灭菌后接入菌种3毫升，适温避光培养23天左右，待菌丝布满培养基表面并向下延伸给予散射光照，以下同实施方法5。

实施方法7：用豆天蛾幼虫粉5公斤，薏米8公斤，碎玉米10公斤，大米77公斤，混合均匀，装入瓶(或袋)中，每瓶装量50克，加营养水70毫升，灭菌后接入菌种4毫升，适温培养25天左右，待菌丝布满料面并向下延伸，给予散射光照，以下同实施方法5。

实施方法8：

将九州虫草子实体在60℃以下干燥粉碎，过六号筛制成纯粉，加80％左右的乙醇制粒，60℃干燥，整粒，装胶囊，用钴60照射杀菌后包装即得九州虫草胶囊，其主要成分见表4。

实施方法9：

将九州虫草子实体纯粉300克。甘露醇粉256.85克，硬脂酸镁2克，在混合机中混合均匀，并将薄荷醇0.15克溶于乙醇中作粘合剂与混合药粉制成适宜的软材，并在制粒机中制成适宜的颗粒，在50℃下干燥，6小时后，整粒，用压片机压制成标示量为560mg的枕形片，检验合格后，用铝型包装机进行气泡眼包装，再进行钴60照射杀菌，包装即得九州虫草片。

其主要成分见表5：

九州虫草胶囊经30例中晚期癌症患者使用，设治疗组，用九州虫草胶囊每日1.2克，分三次服用，对照组给予高聚金萄素注射液4毫克隔日一次肌注，时间为一个月治疗白细胞下降数为40％，明显低于对照组84％，P＜0.005；NK细胞活性升高，治疗组为83％，明显高于对照组53％，P＜0.025。对消化道副反应，治疗组明显低于对照组分别为33.3％和78.9％，P＜0.005。

九州虫草片经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所检验，认为具有调节免疫，抗疲劳和调节血脂的作用，临床用于免疫功能低下，血脂增高，从事脑力体力劳动及运动后需恢复体力的人群。含服或吞服，每天4-6片。

            表 4  九州虫草片的主要有效成分

虫草素(mg/g)    虫草多糖(％)    虫草酸(mg/g)    SOD(U/mg)  氨基酸总量(mg/100g)1.45    26.98    209    1.54    9.115VAVEVD3(mg/kg)FeZnCaSe(mg/kg)0.288    1840    1.05  58.0   38.87   302.3    0.018

          表 5  九州虫胶囊的主要有效成分

虫草素(mg/g)   总分糖(％)    虫草酸(mg/g)     SOD(U/mg)    氨基酸总量(mg/100g)2.26    17.70    87.9    42.4    21.562   VA    VE    VD3(mg/kg)    Fe    Zn      Ca   Se(mg/kg) 0.288  1.84    10    1.05    58.0    38.87     302.3    0.018