增强微囊包封气体的回声和减少其衰减的方法

摘要

已经发现,与薄壁微粒相比,天然或合成聚合物制成的厚壁微粒具有显著增强的回波。已经试验性地测定了壁厚度的作用,以及插入用于预测理想条件的公式。在优选的实施方案中,聚合物是合成的生物降解性聚合物,壁厚度为约100～660nm,尽管可以使用的壁厚度为约20nm～超过500nm。制备直径适合靶组织成像的微粒,例如血管内给药时直径为0.5～8微米,胃肠道或其它空腔成像的口服给药时直径为0.5～5毫米。优选的聚合物是聚羟基酸如聚(乳酸/乙醇酸)、聚交酯或聚乙交酯,最优选聚合物与聚乙二醇或其它抑制网状内皮系统(RES)摄取的物质进行结合。微球可用于各种超声显像应用,包括心脏应用、血液灌注应用以及器官和外周静脉成像。

说明书

发明背景

本发明总体上属于诊断显像剂领域，更具体而言，涉及具有较强回波和较小衰减的微粒超声显像造影剂，该造影剂的回波和衰减是聚合物膜的厚度的函数。

应用超声来获得人或动物内部器官或结构的影像时，当超声波—那些频率大于人耳所能辨别频率的声波穿过身体时，它们被反射。不同类型机体组织对超声波进行不同的反射，检测不同体内结构对超声波所产生的反射，并将之电学转变成直观可视的图像。

对于某些医学疾病来说，得到靶结构或器官的有用图像是非常困难的，这是因为在没有反差增强剂(contrast-enhancing agent)时，由超声波反射产生的超声图像还不足以把这些结构的细节与周围组织区分开来。通过把试剂注射或输注到靶器官或其它结构中，提高它们的超声波图像的反差，可以基本上改善对某些生理和病理状况的检测和观察。在另一些情况中，检测反差增强剂本身的运动是特别重要的。例如，只有把反差增强剂注入血液中并观察血流动力学，才能将已知由特定心血管异常所引起的独特血液流动模式加以辨别。

可用作超声造影剂的物质的工作原理是：这些物质影响穿过机体时被反射而产生作为诊断依据的图像的超声波。物质的类型不同对超声波的影响方式不同，影响程度也有差别。并且，某些由反差增强剂引起的效果更容易被检测和观察。在选择理想的组合物用作造影剂时，人们更希望该物质在超声波穿过机体时对超声波产生最显著的作用。而且，对超声波的所述影响也应容易测得。在超声图像中能见到的两种影响是：反向散射和束衰减。

反向散射：当超声波经过机体时遇到结构，例如器官或其它机体组织，该结构就反射一部分超声波。机体的结构不同，反射超声能量的方式和程度也不同，检测所反射回来的能量并将之用于产生超声波所穿过的结构的图像。术语“反向散射”是指具有某种物理性质的物质向波源方向反散射超声能量的现象。

长期以来已经认识到，当已知能造成大量反向散射的物质存在时，在超声图像中就能观察到强的反差。当将这样的物质施用至机体的具体部位时，机体的该部位与不含所述物质的周围组织的超声图像之间的反差被增强。非常容易理解的是：由于物质的物理性质不同，不同物质产生反向散射的程度便不同。因此，对反差增强剂的寻找已经集中于寻找那些稳定、无毒并呈现最大量反向散射的物质上。

物质产生超声能量反向散射的能力取决于该物质的性质，如被压缩的能力。测量物质产生反向散射能力的一个特别的参数被称为“散射截面”(scattering cross-section”)，当检测不同物质时，比较该参数测量值是有用的。一个具体物质的散射截面与散射半径成比例，同时还取决于超声能的波长以及该物质的其它物理性质，J.Ophir和K.J.Parker，“超声诊断中的造影剂”(Contrast Agents in DiagnosticUltrasound)，医学和生物学中的超声(Ultrasound in Medicine & Biology)，IS卷，第4期，319-323页(1989)。

评价不同物质(即气体、液体或固体)作为超声造影剂的使用价值时，人们能计算出哪些试剂的散射截面较大，相应地，哪些物质在超声显像中可造成最大的反差。可以假定固体颗粒的压缩性远远小于周围介质的，而其密度远大于周围介质的。根据这个假设，固体颗粒反差增强剂的散射截面估计为1.75(Ophir和Parker，同上，325页)。对于纯液态散射体来说，散射体的绝热压缩系数和密度可能基本上和周围介质的相同，从而得出的结论是液体的散射截面为零。然而，当存在大量的液体物质时，液体可显示出一些反向散射。例如，使液体物质从一个非常小的容器流到一个非常大的容器以致基本上充满整个容器时，则该液体显示出能测量到的反向散射。然而，本领域技术人员认为：纯液体是相对无效的散射体。

气体的散射截面基本上不同且大于液体或固体的散射截面，部分因为气泡较液体或固体可更大程度地被压缩。再者，液体中的游离气泡显示出振荡运动如，在一定频段，气泡会在接近医学成像中常用的超声波的频率处发生谐振。结果，气泡散射截面可超出其实体尺寸的千倍以上。

束衰减：在一些反差增强剂存在时，可观测到的另一效应是超声波的衰减。当超声波通过含造影剂的组织或血液时，波的强度降低。由于波与造影剂交互作用，波强度的降低既是超声因造影剂而反散射的结果又是波耗散的结果。如果束衰减过度，自造影剂远端区域返回到传感器的能量则很低，而致成像深度差。已经试图将不同类型组织使用不同的束衰减用作增强成像的方法。由于一些组织类型之间的局部衰减不同，故在常规的成像中可观测到图像反差(image contrast)。K.J.Parker和R.C.Wagg，“B-扫描图像中选择的区域内超声衰减的测量”(Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions Selected fromB-Scan Images)，IEEE Trans，Biomed.Enar.BME 30(8)，第431-37页，(1983)；K.J.Parker，R.C.Wang，和R.M.Lerner，“依赖组织特性的超声振幅和频率的衰减”(Attenuation of Ultrasound Magnitude andFrequency Dependence for Tissue Characterization)，放射学(Radiology)，153(3)，第785-788页(1984)。有人曾假设，在输注试剂前后测量组织某区域的衰减，可得到增强的图像。然而，基于衰减反差的技术作为测量液体试剂增强造影的手段尚未得到很好的开发，并且即使已被充分开发，也将受到可应用这些技术的内部器官或结构的限制。例如，在心血管系统的图像中不太可能观察到由液体造影剂引起的衰减损耗，这是因为在能测出显著的衰减反差之前，需要有大量的液体造影剂存在于指定脉管中。

总之，超声诊断是一个强有力的非侵入性的可用来获得体内器官信息的工具。灰度显像和彩色多普勒的出现大大地拓宽了该技术的范围并提高了分辨率。虽然进行超声诊断的技术已经得到显著的改进，然而对于制造和应用造影剂来说，还有必要提高心灌注和心室、实体器官、肾灌注、实体器官灌注和实时显像期间血液流速和流动方向的多普勒信号的影像的分辨率。超声造影剂的开发已经集中在使用生物相容性气体，无论是以游离气泡形式还是以包封在天然或合成的壳物质中的气体形式。

大量的天然和合成的聚合物已被用于包封气体如空气而用作显像造影剂。Schneider等，放射学研究(Invest.Radiol.)，27卷，134-139页(1992)描述了3微米的填充了空气的聚合物颗粒。据报道，这些颗粒在施压下和在血浆中是稳定的。然而，在2.5MHz时，它们的回波较低。另外一类包封气体的微泡悬浮体己经从用声波处理的白蛋白(sonicated albumin)得到。Feinstein等，J.Am.Coll.Cardiol，第11卷：59-65页(1988)。Fenistein描述了大小适合穿经肺通道的微泡的制备，该微泡在体外具有高度的稳定性。然而，由于其快速溶解于未饱和的液体如血液中，这些微泡在体内存活期短，其半衰期约为几秒钟(约相当于一个循环周期)。Wible，J.H.等，J.Am.Soc.Echocardiogr.，第9卷：442-451页(1996)。Carroll等描述了明胶包封的空气泡，(Carroll，B.A等，放射学研究(Invest.Radiol.)，第15卷：260-266页(1980)和Carroll，B.A等，放射学(Radiology)，第143卷：747-750页(1982))，由于它们尺寸太大(12和80μm)，不太可能通过肺毛细血管。激光协会公司(RasorAssociatie，Inc.)的PCT/US80/00502申请也描述了明胶包封的微泡。这些微泡是通过使明胶凝集而形成的。

Fritzsch T.等也报道了经微晶半乳糖(SHU 454和SHU 508)稳定的空气微泡，放射学研究(Invest.Radiol.)，第23卷(增刊1)：302-305页(1988)；和Fritzsch T.等，放射学研究(Invest.Radiol.)，第25卷(增刊1)：160-161页(1990)。该微泡在体外持续达15分钟，但在体内的持续时间不到20秒。Rovai，D.等，J.Am.Coll.Cardiol.，第10卷：125-134页(1987)；Smith，M.等，J.Am.Coll.Cardiol.，第13卷：1622-1628页(1989)。分子生物系统公司(Molecular Biosystems，Inc.)的WO96/04018描述了由含氟物质的壳包封的气体微泡。

Schering Aktiengesellschaftd的90901933.5号欧洲专利申请公开了用于超声显像的微囊包封气体或挥发性液体的制备和应用，其中微囊由合成聚合物或多糖制成。Sintetica S.A的91810366.4号欧洲专利申请(0 458 745 A1)公开了由在界面存积的聚合物膜围成的空气或气体微球体，为了实现治疗或诊断目的，该微球体能分散在含水载体中，用于注射至宿主动物或用于口服、直肠或尿道给药。Delta生物工程有限股份(Belta Biotechnology Limited)的WO92/18164公开了通过喷雾干燥制备微粒，在严格控制条件如温度、喷雾速度、粒子大小和干燥条件的情况下，蛋白质水溶液形成空心球体，气体被包入其中，用于显像。WO93/25242公开了用于超声显像的微粒的合成，该微粒由聚腈丙烯酸酯或聚酯壳包封的气体组成。WO92/21382公开了微粒造影剂的制备，该微粒造影剂包括含有气体的共价键结合的基质，其中所述的基质是烃。授权给Unger的美国专利5,334,381号、5,123,414号和5,352,435号专利描述了用作超声造影剂的脂质体，它包括气体、气体前体如pH活化的或光活化的气体前体以及其它液体或固体反差增强剂。Nycomed的WO95/23615公开了显像用的微囊，它由溶液的凝聚形成，所述的溶液例如为含有全氟化碳的蛋白质溶液。马萨诸塞工程研究院(Massachusetts Institute of Technology)的PCT/US94/08416公开的微粒由聚乙二醇—聚(丙交酯/乙交酯)的嵌段共聚物制成，其中包封有包括气体如空气和全氟化碳的显像剂。

尽管迄今研究的所有超声造影剂如游离气泡或被包封气泡是强的反向散射剂，但是这些造影剂仍具有高度的衰减。高衰减导致成像深度低和远离造影剂的组织的图像缺失。许多情况下，在具有相当高浓度的造影剂的区域(如左心室)以外的区域，图像信息可完全丧失。目前研究的所有超声造影剂均存在不同程度的此类问题。

为了将与造影剂衰减有关的问题减至最小，研究者采取了一些途径。最常用的是减少造影剂的给药量以使得更多的超声波束透过造影剂。尽管衰减降低，但剂量减少导致所得图像的对比度小于许多临床指征的理想对比度。而且，超声造影剂可通过连续输注施给。这样基本上降低了造影剂的局部浓度，因而存在前述由于剂量减少而出现的问题。连续输注还存在另一缺点，即在一定时间需要的总剂量较大和在临床调试中不易操作。为了弥补低剂量的缺点，研究者们使用谐波成像以增强信噪比。然而，目前谐波成像尚不标准。

重要的是，这些途径没有致力于校正现存超声造影剂声波性质的基本问题。因此，对于具有高回波的超声造影剂而言，产生一个导致由靶区域以超出含造影剂的起始区域的深度在接受传感器处产生高的总的被返回能量的散射体是必要的。被返回能量由造影剂的反向散射和衰减共同控制。

因此，本发明的一个目的是提供具有显著增强的回波的微粒。发明的另一目的是提供具有高反向散射和低衰减的超声剂。

发明概述

已经发现，与薄壁微粒相比，由天然或合成聚合物形成的厚壁微粒具有显著增强的回波和较低的衰减。已经理论地确定了壁的厚度的影响并揭示了理想的壁厚度。制备了具有这些厚度的微粒。在一优选的实施方案中，聚合物是合成的生物降解性聚合物，壁厚度为50～660nm，尽管可使用的壁的厚度为约30nm～超过800nm。壁厚度取决于要成像的靶组织和靶器官的血流容积和组织体积。制备了其直径适合靶组织成像的微粒，例如，经血管给药时直径为0.5～8微米，在胃肠道或其它空腔成像的口服给药时直径为0.5～5毫米。优选的聚合物是聚羟基酸如聚(乳酸/乙醇酸)、聚丙交酯聚乙交酯类或聚(丙交酯/乙交酯)。这些物质可与聚乙二醇或其它抑制网状内皮系统(RES)摄取的物质结合。在各种超声成像应用中，包括心脏应用、血流灌注以及器官和外周静脉成像，均可以使用微球。

附图简述

图1是计算壁厚度对每单位体积总散射截面的影响的曲线图，所述每单位体积总散射截面是代表微囊包封稀释度为1/1620的八氟丙烷时合成聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为110nm和0.0034％C₃F₈(总气体体积分率)，165nm和0.0032％C₃F₈，220nm和0.0029％C₃F₈，330nm和0.0025％C₃F₈，440nm和0.0021％C₃F₈，660nm和0.0015％C₃F₈，880nm和0.0010％C₃F₈，及1100nm和0.0007％C₃F₈。

图2是计算壁厚度对束衰减系数影响的曲线图，所述束衰减系数是代表微囊包封稀释度为1/1620的八氟丙烷时合成聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为110nm和0.0034％C₃F₈，165nm和0.0032％C₃F₈，220nm和0.0029％C₃F₈，330nm和0.0025％C₃F₈，440nm和0.0021％C₃F₈，660nm和0.0015％C₃F₈，880nm和0.0010％C₃F₈，及1100nm和0.0007％C₃F₈。

图3是计算壁厚度对回波(每单位体积的总的被返回能量)影响的曲线图，所述回波是代表微囊包封稀释度为1/1620的八氟丙烷时合成聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为110nm和0.0034％C₃F₈，165nm和0.0032％C₃F₈，220nm和0.0029％C₃F₈，440nm和0.0021％C₃F₈，及660nm和0.0015％C₃F₈。

图4是计算壁厚度对每单位体积总散射截面的影响的曲线图，所述每单位体积总散射截面是代表微囊包封稀释度为1/1620的空气时天然聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为40nm和0.0021％空气(总气体体积分率)，80nm和0.0020％空气，150nm和0.0019％空气，300nm和0.0017％空气，600nm和0.0013％空气，及900nm和0.0010％空气。

图5是计算壁厚度对束衰减系数影响的曲线图，所述束衰减系数是是代表微囊包封稀释度为1/1620的空气时天然聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为40nm和0.0021％空气，80nm和0.0020％空气，150nm和0.0019％空气，300nm和0.0017％空气，600nm和0.0013％空气，及900nm和0.0010％空气。

图6是计算壁厚度对回波(每单位体积的总的被返回能量)影响的曲线图，所述回波是代表微囊包封稀释度为1/1620的空气时天然聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为40nm和0.0021％空气，80nm和0.0020％空气，150nm和0.0019％空气，300nm和0.0017％空气，600nm和0.0013％空气，及900nm和0.0010％空气。

图7是计算壁厚度对回波影响的曲线图，所述回波是代表微囊包封稀释度为1/5400的空气时天然聚合物的大小分布的声频的函数，假定壁厚度为15nm和0.0006％空气，40nm和0.0006％空气，80nm和0.0006％空气，150nm和0.0006％空气，及300nm和0.0005％空气。

发明详述

描述了将作为天然或合成聚合物微粒壁厚度的函数的回波最大化的方法。所述微粒适用于各种诊断超声成像的应用，特别是诸如血管成像和超声波心动描记术中的超声操作。与相同的天然或合成聚合物的薄壁微粒相比，壁厚度增加使回波显著增加。

I.计算理想的聚合物厚度

为了更好地理解包封微泡对诊断超声的反应，使用数学模型(C.Church美国声学协会杂志(J.Acoustical Soc.Amer.)97(3)：1510-1521，1995)计算诸如反向散射和衰减系数等重要数值对诸如包封用壳的厚度和刚度的物理参数的值。所述的壳可以是天然的或合成的材料。在这样的情况下：即包封球状气泡的壳整体地呈连续的、不可压缩的、阻尼的(damped)弹性固态的情况下，模型由(非线性)Rayleigh-Plesset类的方程组成。在此处解析此方程(方程包括最低级第一和第二谐波分量)用于估算壳厚度对被包封气泡悬浮液的散射截面(被包封气泡的散射能量与入射声束强度的比值)和衰减系数(气泡自声束迁移声能的速率)的影响。然后使用这些量值来估算从被包封气泡的悬浮液到发射入射脉冲的超声传感器的总的被返回能量。

描述被包封气泡对入射声压力波反应的Rayleigh-Plesset类方程是： $>>>R>1>>>U>1>>[>1>+>>(>>>>\rho >L>>->>\rho >S>>>>\rho >S>>>)>>>>R>1>>>R>2>>>]>+>>>U>1>>2>>[>>3>2>>+>>(>>>>\rho >L>>->>\rho >S>>>>\rho >S>>>)>>>(>>>4>>>R>2>>3>>->>>R>1>>3>>>>2>>>R>2>>3>>>>)>>>>R>1>>>R>2>>>]>->->->->>(>1>)>>>s>$ >>=>>1>>\rho >S>>>[>>P>>G>>,>eq>>>>(>>>>>R>>o>1>>>>R>1>>>)>>>3>R>>>->>P>\infty >>>(>t>)>>->>>2>>\sigma >1>>>>R>1>>>->>>2>>\sigma >2>>>>R>2>>>->>>4>>U>1>>>>R>1>>>>(>>>>V>S>>>\mu >S>>+>>>R>1>>3>>>\mu >L>>>>>R>2>>3>>>)>>->>>4>>V>S>>>G>S>>>>>R>2>>3>>>>(>1>->>>R>>o>1>>>>R>1>>>)>>]>>s>其中R$$₁是充气腔的半径，U₁是界面1(内部气体和包封用实体之间的界面)的径向速度，R₂是包封材料的外半径，ρ_L是气泡周围液体的密度，ρ_S是包封壳的密度，P_G，eq是气泡内的平衡气压，R_o1是充气腔的起始半径，P_∞(t)是无穷大时的压力(包括声驱动压)，σ₁和σ₂分别是气-壳和壳-液之间的界面张力，μ_S和μ_L分别是壳和环境液体的有效粘度，V_S＝R₂³-R₁³，G_S是壳的刚度以及R_e1是气-壳界面的未应变的平衡位。可通过假定振动振辐R_o1x(t)小和将R₁＝R_o1(1+x)及相关表达式代入Church(1995)方程(1)，得到被包封气泡的散射截面σ_S1的表达式。得到的方程(2)是： $>>>\sigma >>S>I>>>>(>>R>>o>1>>>)>>=>>>4>\pi sup>>R>>o>1>>2sup>>>\omega >4>sup>>\rho >L>2sup>>>sup>>\rho >S>2sup>>>>[>1>+>>(>>>>\rho >L>>->>\rho >S>>>>\rho >S>>>)>>>>R>>o>1>>>>R>>o>2>>>>]>>2>>[sup>>>(>\omega >>0>2sup>>->>\omega >2>>>)>2>>+sup>>\delta >d>2sup>>>\omega >2>>]>>>>(>c>>m>2>>)>>->->->->>(>2>)>>>s>其中\omega 是入射声波的(径向)频率，\omega$₀是被包封气泡的谐振频率，而δ_d是被包封气泡的阻尼常数；截面的代表性单位在方程后的附加注解中给出。

方程(2)适于对单个被包封气泡的反应感兴趣的情况。在诊断超声中，更为通常的是对数百万个被包封的气泡的悬浮液的反应感兴趣。当存在许多一定尺寸范围的被包封气泡时，通过将代表性体积的悬浮液中的每一个被包封气泡的截面简单相加即可估算出来每单位体积的总散射截面： $>>>\sigma >>Sltot>/>vol>>>=sup>>\int >0>\infty sup>>>\sigma >>S>1>>>>(>>R>01>>)>>f>>(>>R>01>>)>>d>>R>01>>>(>>cm>2>>/>>cm>3>>)>>->->->->>(>3>)>>>s>其中f(R$_o1)dR_o1是每单位体积被包封气泡的数量，气泡的半径在R_o1和R_o1+dR_o1之间。使用K.W.Commander和A.Prosperetti在“气泡液体中的线性压力波：理论和实践的比较”(“Linear pressure waves in bubblyliquids：Comparison between theory and experiments”)，美国声学协会杂志(J.Acoust.Soc.Amer.)85(2)：732-746(1989)中给出的方法，可估算出悬浮液的衰减系数。通过对气泡介质的平均压、密度、粘度等方面的描述，作者得出声波在悬浮液中的复合速度C_m的表达式。对于被包封的气泡， $>>A>=>8.686>>(>>\omega v>C>>)>>>(>dB>/>cm>)>>->->->->>(>4>)>>>s>其中系数8.686是由奈培(neper)转换为dB所必需的。方程(3)和(4)结合可得到下面与被返回能量的关系：$ >>>>P>=>I>>O>>>\sigma >>Sltot>/>vol>>>Gexp>>(>->>>4>A>>8.686>>x>)>>=>>I>O>>>\sigma >>Sltot>/>vol>>>Gexp>>(>->>>4>\omega v>>C>>x>)>>(>W>/>cm>->->->->>(>5>)>>>s>其中x是传感器和样本体积之间的距离，因子G表示其它几何因数，所述几何因数包括传感器孔径、传感器和样本体积之间的距离及在接收传感器处被发自每一个气泡散射的球面波截取的立体角。$$

为了使用这些结果，有必要提供被包封气泡大小的分布并估算模型中所用的物理参数的值。应考虑两种情况。第一种是由聚酯制备的合成微粒，第二种是由白蛋白制备的微粒。本案使用的合成颗粒的大小分布是为经喷雾干燥制备的PLGA-PEG微粒测定的，按照1996年7月29日提交的序号为08/681,710的美国专利申请中所描述的那样进行，其教导在此引入作为参考。描述分布特征的总体参数的值，按CulterMultisizer^分析测得：总浓度：2.4×10⁹微粒/mL，数均直径：2.2μm，体积平均直径：4.6μm，和气体体积分率：6.5％。下面给出的计算值是假定稀释1/1620而进行的。相应浓度是4.4×10⁶颗粒/mL，气体体积分率为约0.01％。模型中使用的参数值是：内气：适于全氟丙烷的值，外液：适于水的值，壳密度：1.5g/cm³，壳浓度：30泊，壳刚度：10MPa和壳厚度：22，55，110，165，220，330，440，660，880和1100nm。

图1显示在所使用的PEG-PLGA壳厚度范围内在驱动频率处的总散射截面的计算结果。在最低频率处，截面增至接近该频率的4次方，正如所预期的关于小的，即，瑞利散射体那样。在高一些的生物医学频率处，总散射截面只是以频率的1.5次方增加。在更高些的频率处，散射强度平稳然后下降。增加壳厚度的效果是使总散射截面按近似等于或有些大于厚度变化比例的量而减少。因此通过变化壳的厚度可以控制被包封气泡的悬浮液所显示出的总散射截面。

图2显示不同壳厚度处作为驱动频率函数的衰减系数的计算结果。增加壳厚度的效果是按近似等于或有些小于厚度变化比例的量降低衰减系数。因此通过变化壳的厚度可以控制衰减系数。

总散射截面和衰减系数按近似与壳厚度降低成比例地增加的事实可能似乎表明：壳厚度的变化对预期被反向散射到发射声波进入被包封气泡悬浮液中的传感器的总的被返回能量无影响。然而，基于方程(5)进一步考虑，看来具有厚壳的被包封气泡的悬浮液将呈现出更大的总的被返回能量。这一结果如图3所示。此中原因是：尽管总反向散射能量与总散射截面直接成正比，但它也与衰减系数成指数比例。因而，如果壳厚度以系数2减小，总散射截面增加的效果将是总反向散射能量以近似于2的系数增加，而同时衰减的作用将是以近似指数(-2)＝1/7.4的系数使总反向散射能量“增加”，净降低约73％。随着壳厚度增加，总的被返回能量增加。

正如图4-6所示，由白蛋白制备的微粒揭示了类似的结果。白蛋白微粒使用的参数在C.Church美国声学协会杂志(J.Acoustical Soc.Amer.)，97(3)：1510-1521(1995)中公开。

合成聚合物微粒(图3)和白蛋白微粒(图6)的总的被返回能量是稀释系数为1/1620的微粒的被返回能量。理想的壳厚度(定义为在被包封气泡的悬浮液内2cm深度处提供最大总的被返回能量的厚度)将取决于被包封气泡的稀释度(即被包封气泡的浓度)。图7表示白蛋白微粒在稀释1/5400时的情况。由于悬浮液被稀释，故使用薄壳的微粒是可能的。出现这种可能，是因为尽管以“每个气泡”计，薄壳导致更大的衰减和更大的散射强度，但是这可以被大量微粒所产生的更大返回能量而充分抵消。

下表总结了白蛋白和PEG-PLGA微粒在三种稀释浓度时的理想壳厚度。

    稀释度           理想壳厚度(nm)    白蛋白微粒   PEG-PLGA微粒    1/540    300-600    660    1/1620    150-300    220    1/5400    40-80    55-110

对气泡而言，气泡尺寸的分布在体内是相对稳定的，因此可基于在靶器官中的预期颗粒浓度来选择理想的壳厚度。为描述如何选择壳厚度，以前述的合成微粒为例。如果微粒的剂量约为0.25mL/kg并假定血液量为50mL/kg，则静脉注射后微粒被稀释到1/200。在心肌，血液占总房室容积的10％，微粒在房室内被进一步稀释10倍。因此，最终稀释度接近1/2000。在此稀释度下，理想的壳厚度可由表中数据推算出来，即200nm。故用作心肌灌注剂的这类微粒的理想厚度为大约200nm。

基于这种信息，应当使用厚壳以优化用于包封气体的特定微粒的设计，使衰减最小化和反向散射能量最大化，使得可使用衰减最小的高剂量超声造影剂。本文公开了制备具有适宜壁厚度的微粒的方法。

II.制备不同壳厚度微粒的试剂和方法

除另有说明外，本申请中所用术语“微粒”包括微球体和微囊，同时也包括微粒体。微粒可为球形也可不为球形。将具有包围另一种核心物质(在本案中该核心物质为气体)的聚合物外壳的微粒定义为微囊。微球体一般是具有由贯穿聚合物的孔构成的蜂窝状结构或蜂窝状和微半状结构的微粒体，所结构中充有用于成像目的的气体，如下所述。术语“壁厚度”或“聚合物厚度”指从微粒内侧到外侧的聚合物直径。对于具有中空芯的微囊，其壁厚度等于聚合物厚度。聚合物球上具有通道或孔的带孔微粒，其壁厚度等于微粒直径的一半。

聚合物

生物不可降解的和可生物降解的基质均可用于气体的微半包封，虽然可生物降解的基质是优选的，尤其静脉注射时更是如此。肠内的给药超声时可应用非侵蚀性的聚合物。可使用合成或天然聚合物来制造微粒。优选合成聚合物，因为其更容易再生和控制降解。基于所需的其体内稳定性时间来选择聚合物，换言之，根据分配到打算成像的部位时所需的时间及成像所需时间来选择聚合物。

代表性的合成聚合物是：聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳酸/乙醇酸)，聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯/乙交酯)、聚丙交酯和聚乙交酯的共混物，聚酸酐，聚原酸酯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，聚烷撑氧如聚环氧乙烷，聚对苯二甲酸亚烷基二醇酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇，聚乙烯酯，聚乙烯醚，聚卤化乙烯如聚氯乙烯，聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯，聚苯乙烯，聚氨基甲酸乙酯及它们的共聚物，纤维素衍生物如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素酯、纤维素醚、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和纤维素硫酸钠盐(在此统称为“合成纤维素”)，丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物或它们的共聚物或它们的衍生物包括酯如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯(在此统称为聚丙烯酸类)，聚丁酸(poly(butyric acid))、聚戊酸(poly(valeric acid))和聚(丙交酯/己内酯)、它们的共聚物和共混物。此处所用的“衍生物”包括有取代基的聚合物，附加有化学基团例如烷基、亚烷基的聚合物或经羟基化、氧化和本领域技术人员所作的其它常规修饰而得的聚合物。

优选的生物不可降解性聚合物的例子包括乙烯基醋酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺，它们的共聚物和混合物。

优选的可生物降解聚合物的例子包括羟基酸如乳酸和乙醇酸的聚合物，聚丙交酯，聚乙交酯，聚(丙交酯/乙交酯)，和它们与PEG的共聚物，聚酸酐，聚(原)酸酯，聚氨基甲酸乙酯，聚丁酸，聚戊酸，聚(丙交酯/己内酯)，它们的共混物和共聚物。

优选的天然聚合物的例子包括蛋白质例如白蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原、聚氨基酸、明胶、乳球蛋白和谷醇溶蛋白(例如玉米醇溶蛋白)和多糖(如藻酸盐、纤维素)及聚羟基链烷酸酯(如聚羟基丁酸酯)。通过与试剂如戊二醛交联或热变性可使蛋白质得以稳定。

用于粘性表面如胃肠道成像的特别有用的生物粘性聚合物包括聚酸酐、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯。

溶剂

此处定义的聚合物溶剂是指微量给药至人体能接受的并且是挥发性的或低沸点的或真空下能除去的有机溶剂，例如二氯甲烷、水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、乙酸、二甲亚砜(DMSO)或其组合。一般来说，将聚合物溶于溶剂形成聚合物溶液，使其重量/体积比(w/v)浓度为0.1～60％，优选0.25～30％。

气体

所有生物相容的或药学上可接受的气体均可被掺入到微粒中。术语“气体”是指本身为气体或在进行成像时的温度下能变成气态的任何化合物。该气体可由一种化合物如氧气、氮气、氙气、氩气、含氟气体组成或由混合物如空气组成。优选含氟气体。含氟气体的实例包括CF₄、C₂F₆、C₃F₈、C₄F₈、SF₆、C₂F₄和C₃F₆。特别优选全氟丙烷，因为它是可药用的。通常使用已经公开的方法制备充有空气的中空微粒，微粒内的空气可与已知的任何生物相容性气体进行交换。这种气体交换通常是对微粒施以真空以除去空气，然后施给特定温度和压力下的生物相容性气体。被交换气体的温度和压力取决于微粒的特性。

孔形成剂

孔形成剂可被微囊包封以产生内部空腔。孔形成剂可是液体或挥发性或可升华(sublimable)的盐，所述盐可在微囊化期间被除去或在使用真空干燥或冷冻干燥而形成微粒之后去除。去除了孔形成剂之后，形成了可以充填有关气体的内腔。可使用一种以上的孔形成剂。为增加孔的形成，可将孔形成剂包括在聚合物溶液中，其量为0.01％～90％(重量/体积)。例如，在喷雾干燥、溶剂蒸发中，孔形成剂如挥发性盐，例如碳酸铵、醋酸铵、氯化铵或苯甲酸铵或其它可冷冻干燥的盐，可以以固体颗粒或溶液形式进行包封。如果孔形成剂是以溶液形式包封的话，则含有孔形成剂的溶液要与聚合物溶液一起乳化以在聚合物中形成孔形成剂液滴。然后将含有孔形成剂颗粒的聚合物溶液或孔形成剂的聚合物乳液喷雾干燥或经过溶剂蒸发/萃取过程。在聚合物凝结后，将变硬的微粒冷冻并冷冻干燥以除去残留的孔形成剂或者将变硬的微粒经真空干燥以除去孔形成剂。

稳定包封气体的添加剂

脂类

一般来说，在制备微粒中掺入有效量的疏水性化合物，由此可限制微粒对水的渗透和摄取，这对稳定其中包封有气体，尤其是氟化气体例如全氟化碳的聚合物微粒的回波是非常有效的。可用来增加气体在聚合微粒内的稳定性的脂类包括(但不仅仅限于)下列类型的脂类：脂肪酸及其衍生物，甘油单酯、二酯和三酯，磷脂，鞘脂，胆甾醇和甾体衍生物，萜类和维生素。其中的脂肪酸及其衍生物包括(但不仅仅限于)饱和与不饱和脂肪酸、奇数和偶数碳脂肪酸、顺式和反式异构体，和脂肪酸衍生物包括醇、酯、酸酐、羟基脂肪酸类和前列腺素类。所用的饱和与不饱和脂肪酸包括(但不仅仅限于)含有12-22个碳原子的支链或直链形式的分子。可用的饱和脂肪酸的例子包括(但不仅仅限于)月桂酸、十四烷酸、软脂酸和硬脂酸。所用的不饱和脂肪酸的例子包括(但不仅仅限于)月桂烯酸、5-十四烯酸、9-十四烯酸、9-十六烯酸、6-十八烯酸和油酸。可用的支链脂肪酸的例子包括但并不仅仅限于异月桂酸、异十四烷酸、异软脂酸、异硬脂酸和类异戊二烯类。脂肪酸衍生物包括12-(((7′-二乙氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)十八烷酸；N-[12-(((7′二乙氨基香豆素-3-基)羰基)甲基—氨基)十八酰基]-2-氨基软脂酸，N-琥珀酰基二油酰基磷脂酰基乙醇胺和软脂酰基高半胱氨酸；和/或它们的组合物。可以应用的甘油单酯、二酯和三酯或其衍生物包括(但不仅仅限于)含有脂肪酸或含有6-24个碳原子脂肪酸混合物的分子，二半乳糖基二甘油酯，1，2-二油酸-sn-甘油酯，1，2-二软脂酸-sn-3-琥珀酸甘油酯，和1，3-二软脂酸-2-琥珀酸甘油酯。

可以应用的磷脂类包括(但不仅仅限于)磷脂酸、含有饱和脂类和不饱和脂类的卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心肌磷脂和β-酰基-y-烷基磷脂。磷脂的例子包括(但不仅仅限于)卵磷脂例如二油酰基卵磷脂、二(十四酰基)卵磷脂、二(十五酰基)卵磷脂、二月桂酰基卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰基卵磷脂(DSPC)、二(二十酰基)卵磷脂(DAPC)、二(二十二酰基)卵磷脂(DBPC)、二(二十三酰基)卵磷脂(DTPC)、二(二十四酰基)卵磷脂(DLPC)；和磷脂酰基乙醇胺例如二油酰基磷脂酰基乙醇胺或1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油磷酸乙醇胺。也可使用合成的具有不对称酰基链的磷脂(如一个酰基链有6个碳原子，另一个酰基链有12个碳原子)。

可以应用的鞘脂包括神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、硫苷脂和溶血硫苷脂。鞘脂的例子包括(但不仅仅限于)神经节苷脂GM1和GM2。

可以应用的甾体包括(但不仅仅限于)胆甾醇、硫酸胆甾醇、半琥珀酸胆甾醇酯、6-(5-胆甾醇-3β-酰基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫-α-D-半乳糖吡喃糖甙，6-(5-胆甾醇-3β-酰基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫-α-D-甘露糖吡喃糖甙，和胆甾醇-4′-三甲基35铵丁酸酯(cholesteryl(4′-trimethyl 35 ammonil)butanoate)。

可以应用的另外的脂类化合物包括生育酚及其衍生物，油和油的衍生物如硬脂酰胺。

大量的阳离子脂类如DOTMA，N-[1-(2，3-二油酰基氧)丙基-N，N，N-三甲基铵氯化物；DOTAP，1，2-二油酰基氧-3-(三甲基铵)丙烷；和DOTB，1，2-二油酰基-3-(4′-三甲基铵)丁酰基-sn-甘油，均可以应用。

最优选的脂类是磷脂，优选DPPC、DAPC、DSPC、DTPC、DBPC、DLPC，最优选DPPC、DAPC和DBPC。

脂类的含量范围是0.01-30(脂类重量/聚合物重量)；最优选0.1-12(脂类重量/聚合物重量)。可在微粒形成前将脂类加入到聚合物溶液中。

其它疏水性化合物

优选的其它疏水性化合物包括氨基酸例如色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，芳香化合物例如对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸。

微粒及其制备方法

在最佳实施方案中，用喷雾干燥法制备微粒。将聚合物和孔形成剂通过一个喷嘴而雾化，用加热的干燥气体将聚合物溶剂蒸发掉。也可用其它技术例如溶剂萃取、热熔包封和溶剂蒸发，来制备具有适宜直径的壁厚度的微粒，从而优化回波。孔形成剂通常被用来形成内部空腔。孔形成剂被微囊包封并在微粒形成之后经冷冻干燥或真空干燥而去除。E.Mathiowitz等在显微镜扫描杂志(J.Scanning Microscopy)4，329(1990)；L.R.Beck等在Fertil.Steril.31，545(1979)；和S.Benita等在药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)73，1721(1984)中描述了溶剂蒸发法。E.Mathiowitz等在反应聚合物(Reactive Polymers)，6，275(1987)中描述了热溶微囊包封法。

合成微粒过程中可加入各种表面活性剂。可使用的示范性的乳化剂或表面活性剂(0.1-5％重量)包括大多数生理适用性乳化剂。实例包括天然和合成形式的胆酸盐或胆酸，二者结合或不结合有氨基酸，如牛磺酰脱氧胆酸盐和胆酸。

微粒大小

在优选的实施方案中，制备能通过肺毛细血管床的可注射微粒，该微粒直径应该为约1-10微米。更大的微粒可能阻塞肺毛细血管床，更小的微粒则不能提供足够的回波。如果不是经注射给药途径，例如经口服(用来检测胃肠道)、给药至其它粘膜表面(直肠、阴道、口腔、鼻腔)或经吸入给药时，更大的微粒是有用的。口服时，优选的颗粒大小为约0.5微米-5毫米。在库尔特粒度仪上，应用光学显微镜、电子扫描显微镜或透射电子显微镜可进行颗粒大小的分析。

控制壁厚度

优选壁厚度大于20nm，更优选范围为160～220nm到700nm，在700nm增加壁厚度的优势开始逐渐减少。对于每一种前述微囊包封技术，有数种方式控制聚合物微粒的最终壳厚度。

聚合物浓度

在包封过程中通过增加聚合物相的浓度可以增加最终的聚合物壳的厚度。这适用于合成聚合物或天然聚合物如蛋白质或多糖。在聚合物液滴的大小一定时，使用更浓缩的聚合物溶液将使每单位体积中含有更多的聚合物液滴，由此产生更厚的壳层。获得指定壳厚度的聚合物浓度主要取决于聚合物类型、聚合物溶剂、聚合物在溶剂系统中的溶解度和进行包封的温度。可使用的聚合物浓度范围为0.1～60％。优选聚合物浓度范围为0.5～30％。

如前所述，孔形成剂如挥发性或可升华盐可用于制备具有内部空腔的微粒。孔形成剂可按固体或者按含水溶液或溶于聚合物的溶液形式被微囊包封。使用固体孔形成剂时，被包封的固体试剂的固体颗粒的大小和用量决定最终聚合物壳的厚度。当固体孔形成剂颗粒的直径相对于聚合物液滴相而增加或者当固体孔形成剂的重量相对于聚合物液滴相而增加时，产生的微粒的壳较薄。固体孔形成颗粒的直径为聚合物液滴相直径的1～95％。使用标准技术如气流粉碎机可将固体孔形成剂的直径调整至适当直径。包封的固体孔形成剂的重量为1～50％(重量/聚合物重量)。

使用溶于聚合物溶剂中的孔形成剂时，壳厚度由被包封的孔形成剂的量控制。孔形成剂的总量增加时，最终的壳厚度即增加。

孔形成剂以含水溶液形式被微囊包封时，最终的聚合物壳厚度由被包封的孔形成剂溶液相对于聚合物相的体积、被微囊包封的孔形成剂的重量及孔形成剂溶液的液滴大小相对于聚合物液滴大小来控制。当孔形成剂溶液的体积相对于聚合物相而增加时，最终聚合物壳的厚度将减小。孔形成剂溶液与聚合物相的体积比为0.002～0.5，优选比值范围0.01～0.1。孔形成剂的体积比不变时，聚合物壳的厚度将随着被包封的孔形成剂溶液中孔形成剂的浓度增加而降低。被包封的孔形成剂的重量为1～50％(重量/聚合物重量)。随着被包封的孔形成剂溶液的液滴大小相对于聚合物溶液而减少时，最终微粒的壳厚度将增加。可以使用产生液滴的方法来控制孔形成剂溶液的液滴大小。孔形成剂溶液液滴直径范围为聚合物液滴相直径的1～95％。如果使用均化技术来产生孔形成剂液滴，所使用的均化速度(500-20,000rpm)、均化时间(0.1-10分钟)、均化温度(4-50℃)和叶片类型(即开槽头、四方头、圆形封头)控制最终的孔形成剂溶液液滴大小。调整均化条件以产生所需的液滴大小。如果使用超声化而在聚合物液滴中产生液体孔形成剂溶液的液滴，则所使用的超声探头类型、超声时间(0.1-10分钟)、超声温度(4-40℃)、探头频率和超声功率均可影响液滴的大小。

III诊断应用

通常，微粒与可药用载体如磷酸盐缓冲液或盐水或甘露糖醇混合，然后按检测有效量经适当途径(通常途径为血管注射(i.v.)或口服)施予患者。含有被包封显像剂的微粒可用于血管成像，也可用于检测肝肾疾病、心脏病学的应用、检测肿瘤块和组织并描绘其特性和用来测量外周血流速。所述微粒也可与这样的配体相连：所述配体可减小组织粘附或者如前所述能使微粒在体内导向身体的特定区域。

通过下面的非限定性实施例可更进一步地理解上面所述的方法和组合物。实施例1：具有增强的回声的聚合物微粒的制备

3.2g PEG-PLGA(75∶25)(IV＝0.75dL/g)、6.4g PLGA(50∶50)(IV＝0.4dL/g)和384mg二花生四烯酸磷脂酰胆碱溶于480ml二氯甲烷中。向聚合物溶液中加入20ml 0.18g/ml的碳酸氢铵溶液，使用Virtis均化器以10,000 RPM的速度将聚合物/盐混合物均质化2分钟。用BucchiLab喷雾干燥器以20ml/min的流速抽吸溶液并喷雾干燥，入口温度为40℃，出口温度20-22℃。用库尔特粒度仪测量，微粒直径范围为1-10微米，平均2.0微米。扫描电子显微镜检查显示颗粒一般为球形，表面光滑，偶有表面皱缩。通过在LR白色树脂中包埋然后在UV线下聚合从而制成为透射式电子显微镜所用的微球。使用玻璃刀在LKB超薄切片机上切出薄的切片，并于60kv在zeiss EM-10 TEM上观测。微粒的壳厚度范围为200～240nm。