天然抑芽剂的制备方法及其在烤烟腋芽抑制上的应用

摘要

本发明公开了用于烤烟腋芽抑制的天然抑芽剂,从植物中采集、分离、纯化培养,选拔生物活性强,产率高的株系,进行小麦抑芽快速检测,再反复比较筛选出高产菌株,再经培养、溶剂萃取、浓缩、干燥而得天然脱落酸(ABA)和Botcinolide两种抑芽剂。将其用于烤烟腋芽的抑制上,有效率达89～92%,整个加工过程安全无毒,不含有机合成成份,因而不污染环境、无残毒,生产成本低,价格便宜,也可用于花卉、蔬菜保鲜,调控作物生育,改善品质提高产量等。

说明书

本发明涉及天然抑芽剂的制备方法及其在烤烟腋芽抑制上的应用，属于生物技术领域。尤其是天然脱落酸S-(+)-ABA，简称ABA，5-(1-羟基-2，-6，6-三甲基-4-氧代-2-环己烯-1-基)-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸，及Botcinolide，即4-羟基-2-辛炔酸，两种产品均是Botrytis cinerea PersrCGMCC NO.0357-1、NO.0357-2真菌的代谢产物(保藏日为1998年9月3日)。

烟叶在我国许多省份种植面积大、经济效益明显。但每年田间管理中的封顶打杈，极其劳累费力，且摘除后不长时间，又会长出新的杈芽。为了提高烟叶产品产量、质量及减少劳力，国家先后从国外购入抑芽用的Flumetralin(抑芽敏)、Maleichydrazide(抑芽丹、芽敌)、除芽通等，这些药品用于田间管理，抑芽效果各有特色，但价格较高(13元/亩)，而且它们都是有机合成制剂，对烤烟品质的影响及残留毒性、环境污染等问题尚未得到解决。

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足及弊端，提供一种安全无毒、无副作用、不污染环境、无残毒顾虑、效高价廉的新型抑芽剂。

上述目的是这样实现的：从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强，产率高的株系(产率在0.8‰以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至1500倍仍然有效的菌株)，再反复比较筛选出高产菌株，产率0.9‰～1.5‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存备用。培养基为PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培养7天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先提取待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml分别移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强，产率高的菌株，培养所得粗品天然脱落酸(ABA)。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是264.3，分子式C₁₅H₂₀O₄，结构式为

为了避免原料浪费，将萃取后的剩余水溶液再作处理。方法是：萃取后的剩余水溶液调整PH为碱性，经EtOAC抽提分离出溶剂层和水层，再对水层调整PH值，经倍量溶剂抽提，再次分离出溶剂层和水层，弃去水层，将此次分离出来的溶剂收集，用水和饱和Nacl液洗后，无水Na₂So₄脱水，浓缩干燥，EtOAC可溶酸性馏份，得到天然脱落酸ABA。

天然脱落酸的分子量为264.3，分子式C₁₅H₂₀O₄。该物质结构具有5个特点：①主核具有环状结构；②环状结构上必须有双键：③主核具有一个侧链；④具有一个-COOH，羧基和主核间至少有一碳原子：⑤主核和侧链必须具立体结构。

另一种制备方法是：从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强产率高的株系(产率在0.8‰以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至1500倍仍然有效的菌株)，再反复比较选出高产菌株，产率0.9‰～1.5‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存备用。培养基为PDA，室温培养12天(如用谷糠23℃培养6天)然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得Botcinolide的粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先提取的待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强产率高的菌株来生产天然Botcinolide。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，分子量是338，分子式C₂₀H₃₄O₈，结构式为

将天然抑芽剂用于烤烟栽培过程的腋芽抑制上，采用涂抹或喷淋方式，达到了抑制烟芽疯长，收到了良好的效果。该抑芽剂也可用于其他植物的封顶打杈。花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。

天然抑芽剂由于是从植物中采集、分离、培养、萃取、过滤、干燥而得，整个加工过程安全无毒，不含有机合成成份，因而不污染环境、无残毒，生产成本低，价格便宜，每亩成本仅需8～9元，又能增进烤烟品质，抑芽效果平均在90％以上。该抑芽剂也可用于其他植物的封顶打杈。花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述

图1为天然抑芽剂的制备方法工艺流程图

图2为天然脱落酸ABA剩余水溶液的抽提工艺流程图

图3为天然抑芽剂(抑1、抑2)与对照组在田间应用示意图

首先从自然界各种植物(果树、蔬菜、花卉、粮食、经济作物、野生林木……等)中采集Botrytis Cinere Persr的真菌病害标本，然后选择新鲜、症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，进行单孢分离、纯化培养，采用小麦抑芽试验法，筛选具有生物活性的菌株，再从有活性的菌株群中反复筛选比较，寻找活性物质产出率最高的菌株作为菌种保存。例如，我们从莴苣、葱、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分离到的7个菌株，按照前述方法分离培养、萃取、浓缩，即可得到粗产品，提供生测试验。培养基为PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培养7天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先配制好的标准及待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强产率高的天然脱落酸(ABA)。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析、分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是264.3，分子式C₁₅H₂₀O₄，结构式为

为了避免原料浪费，将萃取后的剩余水溶液再作处理。方法是：萃取后的剩余水溶液调整PH为碱性，经EtOAC抽提分离出溶剂层和水层，再对水层调整PH值，经倍量溶剂抽提，再次分离出溶剂层和水层，弃去水层，将此次分离出来的溶剂收集，用水和饱和Nacl液洗后，无水Na₂So₄脱水，浓缩干燥，EtOAC可溶酸性馏份，得到天然脱落酸ABA。

另一种制备方法是：将筛选出来产率高的菌种，用PDA培养基，室温培养12天，如果用谷糠作培养基，23℃培养6天，然后用倍量乙酸乙脂浸提24小时(注意振摇)，过滤、浓缩，再用苯浸提浓缩，即得到天然抑芽剂Botcinolide。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，分子量是338，分子式C₂₀H₃₄O₈，结构式为

用这两种方法制备出的天然抑芽剂用于烤烟腋芽的抑制上。采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选。方法是取精选小麦种子(汰除病损，空瘪)预浸1/1000多菌灵悬浮液内吸湿处理24小时。取灭菌烧杯(高6cm，径4.5cm)若干，杯底各放入小玻球40粒，其上垫一层灭菌圆形滤纸片，纸上再均布小麦种子10粒。分别将预先配制好的标准及待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml移入烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复4次，置26℃温箱中培养5～7天，观测幼根、幼芽生长有无抑制现象，而初步判断抽提粗品中是否含有活性成份。如前所述，产品先经室内生测鉴定，证明活性很高，再经室内盆栽烟株抑芽初试，效果明显，最后进行多点田间小区试验，98年6月下旬～7月下旬，在我省寻甸县、陆良县、弥勒县分别选择生长整齐，高矮一致，品种相同，管理一样的烟田，(最好选红花大金元或V-2系列品种)正常封顶打杈后，待腋芽刚露尖约1公分长，按田间布置图划分试验小区。试验药剂：ABA(抑1)、Botcinolide(抑2)、抑芽敏、除芽通、芽敌。按照试验设计，分别称取一定量的各供试药剂，加水充分搅拌均匀，调制成所需浓度，ABA(抑1)稀释成100、200、300倍；Botcinolide(抑2)稀释成100、200倍；抑芽敏(有效成分25.5％)300倍；除芽通(有效成分33％)100倍；芽敌(有效成分30.2％)50倍；清水对照。共九个处理，四次重复，总计36个小区，每小区0.03亩，同田随机区组排列。选择晴天无雨日期，于当天下午5时后，用杯淋法或涂抹法施药到各小区烟株腋芽上，处理后定点挂牌观察记载，抑芽效果90～92％，每亩成本仅需8～9元。而国内推广使用的有机合成抑芽敏、芽敌、除芽通等，每亩成本13元，抑芽效果虽都达到89～92％，但对环境污染及残毒尚未解决，就抑芽作用来说，天然抑芽剂作为新型抑芽剂是有竞争力的，采用涂抹每亩仅需10克，采用喷洒每亩20克，价钱也较便宜。该抑芽剂也可用于其他植物的封顶打杈。花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。