定性和定量检测DNA变异及这些变异的配体的方法

摘要

本发明涉及一种检测DNA序列变异的方法,特征在于:a)将所述DNA序列在含有至少一种识别有关变异类型的化合物(称为配体)的物质存在下加入在允许识别的培养基中,b)用所述配体显示对变异的识别。本发明可通过测定环境对DNA样品造成的变异用于鉴定环境的基因毒性特性,及用于鉴定DNA修复系统的变异。

说明书

本发明的主题是定性和定量检测脱氧核糖核酸(DNA)的变异的方法，其中所说的变异可能是由于细胞代谢或内源性或外源性物理或化学因素造成的，本发明还涉及定性和定量检测识别变异DNA的配体的方法。

在诸多有争议的关于基因毒性的定义中，一种最令人满意的定义是，设想由于基因毒性剂或代谢产物的直接作用而出现的DNA的物理或化学损伤，及其生物学后果(Butterworth，1990，突变研究(Mutat.Res.)239，117-132；Ashby，1992，风险鉴定中的致癌机制(Mechanism of Carcinogenesis in risk identification)，VainioH.，Magee P.N.，McGregor D.B.& McMichael A.J.(编)IARC，Lyon，135-164)。在基因毒性剂中，许多分子或物理因子都可诱导突变的发生，而这些突变则可用各种细菌或真核系统来检测。B.N.Ames(Ames等，1973，美国国家科学院院报(Preoc.Natl.Acad.Sci.USA)，70，2281-2285)描述了最常使用的一些突变检测系统，另外还包括所谓的微粒试验(Mac Gregor等，1987，突变研究，189，103-112)。

因为在许多情况下突变的出现是因为存在损伤(特别是由于基因毒性剂的作用)，所以已建立了许多检测和定量分析这些类型的损伤的系统。检测DNA损伤涉及后标记(Randerath等，1981，美国国家科学院院报，78，6126-6129)、碱性或中性洗脱(Kohn等，1976，生物化学(Biochemistry)，15，4629-4637)等物理化学技术，免疫学技术(Philips D.H.，化学致癌和诱变(Chemical-Carcinogenesis andmutagenesis)，vol.I，503-546，Springer Verlag，Heidelberg，1990，Cooper和Grever(编))，或用来利这用些损伤修复过程的结果，如慧星检测法(Singh等，1998，实验细胞研究(Exp.Cell Res.)，175，184-191)。

某些检测法是利用了细胞的损伤修复能力，其机制包括重新合成DNA这样一个步骤。可使用放射标记的核苷酸来定量该DNA聚合步骤(Cleaver，1984，研究物理和化学诱变剂损伤的真核DNA切除修复的方法(Methods for studying excision-repair of eukaryotic DNAdamaged by physical and chemical mutagens)(Kilbey B.J.，NicholsW.& Ramel C.，编)33-69，Elsevier，Amsterdam)。这种检测法被称为UDS(计划外DNA合成)，并已被用于检测基因毒性剂或用于估计细胞的修复能力。已在不使用放射活性标记方面对该UDS试验作了改进(Selden等，1994，突变研究，315，147-167)，但这种改进只是相对的，因为使用流式细胞仪后使方法变得很麻烦。

DNA的修复主要是归因于损伤部位的切除，最近已用细胞提取物再现了该系统(Wood等，1988，细胞(Cell)，53，97-106；Sibghat-Ullah等，1989，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，17，4471-4484)。该检测法使用了在转录活性提取物存在下保温的、经处理和未处理的(对照)质粒(Manley等，1983，酶学方法(Meth.Enzymol.)，101，568-582)。修复反应要点在于切开-切除损伤，然后再合成DNA片段。这种方法的优点是在此步骤中掺入一种或多种放射标记的核苷酸。在恢复DNA损伤中包括两种主要机制：切除核苷酸(NER)和切掉碱基(BER)。下文具体描述这两种机制。

在体外进行这种试验时，只有大约7％的小比例的损伤是通过NER机制修复的。

由于下述各种原因，这些检测法并不适于大规模的产业研究应用：

(i)可同时处理的样品数太低(约几十个)；

(ii)分析所需的时间相对较长(约2天)；

(iii)由于使用放射标记的分子，而使这种试验只限于被批准的实验室使用；

(iv)试验中只限于使用高度纯化的质粒DNA(超螺旋DNA)。

考虑到这些限制，已建立了一种能够克服其他系统所存在缺点的新的体外修复-合成检测法，其可在5小时中同时分析100个以上的样品，而且是一种非放射活性检测系统。这种方法也允许使用不同类型的DNA，这种方法是1995年3月15日提交的法国专利申请No.9503230和1996年3月13日提交的PTC申请No.PCT/FR96/00391的主题。PCT申请的公开号为WO9628751(1996年9月19日)。

其他很相似的技术是直接检测受损伤的DNA，而不涉及检测与损伤的DNA相关的修复系统。例如，专利申请号WO9624688和WO9623895及下列一些文章中描述了掺入放射活性标记的核苷酸，以定量测DNA损伤的方法：Salles B.等人，体外真核DNA切除修复检测法(综述)，Biochimie，Vol.77，No.10，1995；Calson P.和Salles B.，经体外核苷酸切除修复检测损伤特异性DNA切割，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications)，Vol.202，No.2 1994年7月29日；Calsou P.和Salles B.，人无细胞提取物中经核苷酸切除修复进行损伤依赖性DNA切割的性质，核酸研究，Vol.22，No.23，1994；Salles B.和Calsou P.，细胞提取物中DNA修复合成的快速定量分析，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，Vol.215，304-306，1993。

专利申请号WO9624688特别涉及到使用抗修饰DNA的抗体，Salles B.等人的文章(检测基因毒性剂处理产生的DNA损伤的化学发光微板法，分析生物化学，vol.232，37-42，1995)则涉及掺入DIG-11-dUTP并使用抗DIG-11-dUTP抗体进行损伤检测。

在现有技术文献中，没有述及或提示如下文所限定的本发明的方法。发明的描述

因此，本发明的主题是鉴定DNA序列变异的方法，其中可借助一种相对简单的方法检测DNA的所有变异。

本发明提供一种鉴定DNA序列变异的方法，其特征在于：a)在允许识别的培养基中，使所说的DNA序列与至少含有一种称为配体的、识别这种类型变异的化合物的物质接触，b)揭示所说的配体对变异的识别。

由所说的配体识别变异是指检测配体对受损DNA的直接或间接附着。例如，当配体是复合物的一个部分时，此可以是一种间接附着。

变异首先是指对DNA的损伤。其可以是物理来源的(例如热，或电离或非电离幅射)或化学来源的。这些损伤DNA的因素可以是外源或内源的。对DNA产生的损伤大致可分为5种类型：·  加合(通常是形成共价复合物，但也可包括其他类型的化学结合，例如分子与DNA碱基的配位结合)，·  碱基的偶联(经提供能量实现的，一种了解最清楚的偶联见于在UVC或UVB幅射的作用下形成的嘧啶的二聚体中)，·  DNA的碱基与蛋白质复合(这种大多呈共价结合类型的复合也是提供能量后发生的)，·  引起DNA结构修饰的氧化损伤(呈碱基断裂或缺失，脱氧核糖断裂、磷酸二酯键断裂等形式)，·  电离幅射引起的断裂(如某些类型的放射活性幅射)。

除这些类型的损伤外，也可发生其他的DNA变异。在DNA复制期间，参予该过程的聚合酶必须按照A-T、G-C模式使新的碱基与模板链正确配对，以合成新的DNA链。如发生错配即造成DNA的变异。这种错配可能是天然的(由于聚合酶的统计学错误)，或者是由破坏酶活性的药物造成的。

按照本发明的方法，允许检测对“DNA的损伤”和“错配”。

尽管会发生上述这些变异，但所幸细胞具有一个可使DNA恢复其正常形式的酶促武器库。这些机制是按照“DNA损伤”的通用名称分类的。根据变异的类型，其包括5种基本机制：核苷酸的切除、碱基的切除、错配修复系统、DNA单链断裂的修复，以及DNA双链断裂的修复。

这些机制的共同点是，它们都包括一个首先识别变异的步骤。借助参予识别变异的、下文中称为“配体”的化合物特别是蛋白质的存在，得以建立本发明的方法。

因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，所显示的配体最好是一种DNA修复系统识别蛋白。

“修复系统”是指损伤DNA的修复系统和错配修复系统。最后，“识别蛋白”是指确保对变异进行基本识别的蛋白质和参予这种识别的蛋白质，特别是在形成复合物(例如XP-A，PRA或TEIIH)时。

在所涉及的蛋白质中，应该提到的有：·  NER系统的蛋白质，·  BER系统的蛋白质，·  错配修复蛋白质，·  检测双或单链DNA断裂系统的蛋白质。

核苷酸切除修复(NER)系统是可识别最宽范围的DNA损伤的机制，而这些损伤主要包括大的加合物。

NER损伤习惯上被分为四个阶段：损伤的识别(1)；损伤的切除(2)；被切除片段的重新合成(3)；新合成的链的连接(4)。

虽然有关经NER修复的损伤的识别机制尚不清楚，但已明确知道XP-A蛋白参予了头几个识别阶段之一(其与RPA蛋白，并可能与转录复合物TEIIH相结合)。

XP-A是着色性干皮病A类病人体内缺乏的蛋白质。缺乏NER修复蛋白将使这些病人对紫外光(UV)照射十分敏感，而紫外光幅射则依据其波长的不同对DNA造成将由NER修复的损伤，其中XP-A形式是最严重的形式。

XP-A蛋白是一种由273个氨基酸组成的，并由1.4Kb信息RNA翻译得到的(Tanaka K.等，1990，自然(Nature)，348，73-76)锌指蛋白(与DNA相互作用的常规蛋白质结构)。

XP-A识别(相对于未损伤的DNA约高出1000倍)由UVC产生的损伤(约75％的嘧啶二聚体呈环丁烷形式，25％的嘧啶二聚体呈光生产物形式(6-4))。该研究中(Robins P.等，1990，EMBO J.，10，3913-3921)只分析了这些类型的损伤。这些作者也制得了抗XP-A蛋白两种合成肽的多克隆抗体，并已确定XP-A蛋白的活性形式不需经过磷酸化。

Eker等人使用与单链DNA偶联的琼脂糖或与受UVC照射的DNA偶联的纤维素层析柱，或保温各种类型的DNA(单链或双链的，受UVC损伤的或未损伤的)进行的研究证明，从牛胸腺或HeLa细胞中提取的XP-A蛋白对单链DNA比对双链DNA有更高亲和性，但对UVC损伤的DNA则没有优先亲和性(Eler等，1992，突变研究，DNA，274，211-224)。这些作者也制得了抗重组XP-A蛋白的多克隆抗体。

Tanaka等人的研究结果是借助重组XP-A蛋白于1993年完成的。其进一步证实，XP-A确实可识别UVC造成的损伤(主要是光生产物(6-4))，以及由抗癌剂顺铂(顺式-二胺-二氯铂(II))引起的损伤。就XP-A来说，在对UVC损伤的DNA竞争中，单链DNA片段是双链DNA的四倍。另一方面，这些作者并未能证明XPA对含有衍生于光活化补骨脂素的加成物的DNA的亲和性(Jones C.J.& Wood R.D.，1993，生物化学(Biochemistry)，32，12096-12104)。

在了解因UVC及顺氯氨铂造成的损伤的基础上，Asahina等人又于1994年报导了关于四氯化锇对DNA损伤的研究(Asahina H.等，1994，突变研究，DNA修复(Mutation Res.，DNA Repair)，315，229-237)。

对鸡、非洲爪蟾和果蝇中XP-A基因(在其中被为Dxpa)克隆的研究表明，在生物进化过程中这些基因在真核细胞中是高度保守的(T.Shimamoto等，1995，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)，270，22452-22459)。

在XP细胞中切除碱基似乎是正常的(Cleaver J.E & Kraemer K.H.，1989，遗传病的代谢基础(The metabolic basis of inheriteddisease)，ed.Scriver C.R.，Beaudet A.L.，Sly W.S.& Valle D.(McGraw-Hill，New York)，第6版，2949-2971)，这使XP-A对识别经由NER修复的损伤更具敏感性。然而，Satoh等人使用经γ射线照射或使用过氧化氢分解而成的羟基游离基造成损伤的DNA损伤的研究中，经处理后的损伤不再被碱基切除修复系统识别，其表明XP-A(以及XP-B和XP-C，七个称为XP-A至XP-G的着色性干皮病的另两个亚组)参予了由氧化游离基诱发的某些类型损伤的修复(SatohM.S.等，1993，美国国家科学院院报90，6335-6339)。由于用来证明XP组的蛋白质参予这一修复过程的底物是完全人工合成的，所以应小心对待这些结果。

最后，用双链杂交技术或常规免疫学技术所作研究已显示，XP-A蛋白(重组蛋白)可与RPA蛋白(复制蛋白A，也称为人单链DNA结合蛋白，HSSB)结合。但这些实验中并没有显示这种结合是否与核苷酸切除修复有关(Matsuda T.，1995，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)270，21800-21805)。

应考虑到HMG(高迁移组)蛋白的潜在作用。在因顺铂(一种化疗剂)引起的损伤期间，有这些蛋白质的参与(Hughes等，1992，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)267，13520-13527)。已鉴定了四种对顺铂造成的加成物特异的HeLaS3蛋白(Donahue等，1990，生物化学，29，587-588；Andrews和Jones，1991，癌症通讯(Cancer Comn.)3，1-10；Hughes等，1992，生物学化学杂志，267，13520-13527)。对其中两种蛋白质的N末端部分的序列分析显示，它们与HMG2和HMG1蛋白有着高度同源性。而且，铬盐与DNA的共价结合可诱导产生体内被HMG2和HMG1识别的加成物。就铬盐来说，HMG的亲和性是剂量依赖性的(Wang等，1997，癌症发生(Carcinogenesis)，18，371-375)。

然而，它们在DNA修复中的确切作用尚未确定(特别是不识别UV引起的损伤)。

在本发明的方法的实施中，优选使用XP-X蛋白或相关蛋白，以及可能的RPA、TFIIH和HMG蛋白或复合的其它蛋白质。

根据所检测的配体的性质，另外可能设想更好地限定所涉及到的基因毒性剂的类型。实际上XP-A可识别大体积加成物和相应的大量基因毒性剂，但并不识别不大的加成物和氧化键。

对碱基切除修复(BER)的了解比对核苷酸切除修复(NER)了解得少。主要原因是由于还没有鉴定出因BER缺乏所导致的疾病，以致缺少可用于研究参予该机制之基因的突变体。

碱基切除修复用于修复因内源性氧化反应性物质、电离性幅射及烷基化剂造成的DNA碱基损伤。简单地说，与识别大体积损伤的NER不同，BER则用于体积不大的损伤。

BER中的关键酶是糖基化酶，该酶裂解碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键并进而除去修饰的碱基。存在有识别不同类型损伤的不同糖基化酶。迄今，已在大肠杆菌、酿酒酵母及人中鉴定出了约十种这类酶(Seeberg等，1995，TIBS，20，391-397)。

除去了碱基后，分别用在Ap位点之5’或3’侧上切割DNA链的AP核酸内切酶或AP裂解酶切掉AP(无嘌呤或无嘧啶)位点。剩余的磷酸脱氧核糖则被磷酸二酯酶切掉，并由DNA聚合酶恢复DNA链的重新合成。然后由DNA连接酶恢复链的连续性。

长期以来一直认为β-聚合酶在BER中参予DNA链的重新合成。但最近对中国仓鼠(CHO)细胞提取物所作的研究则显示，可通过两种不同的机制修复由烷基化剂造成的小的加成物。一种机制涉及β-聚合酶，另一种机制则因其涉及PCNA(增殖细胞核抗原，一种参予NER的因子)(Frosina等，1994，生物学化学杂志，270，9573-9578)而表现与NER的某些相似性。由UVA造成的DNA损伤可能要经由BER来修复。从UVA照射(320-410nm)(其造成的损伤是氧化型的，并因此需经由BER修复)后的细胞存活性曲线来看，XP-D细胞系的细胞在行为上与野生型细胞系没有什么不同，而它们对UVB(307-312nm)和UVC(254nm)却很敏感(Stary等，1997，突变研究(Mutation Res.)，383-1-8)。

参予单链DNA断裂修复的聚(ADP-核糖)聚合酶(或简称PARP)也参予BFR修复过程中的最后连接步骤(Kubota等，1996，EMBO J.，15，6662-6670)。

复制、重组期间或DNA损伤之后，均可发生碱基错配。

大肠杆菌中的错配修复机制是已知的。因此已在体外重新构成了包括MutH、MutL、MutS和UvrD(或螺旋酶II)蛋白的MutHLS系统。该修复机制是由DNA聚合酶III、DNA连接酶和SSB(单链DNA结合蛋白)及单链特异性核酸外切酶(ExoI、ExoVII)或RecJ蛋白辅助完成的(Friedberg等，1995，DNA修复和诱变(DNA repair andMutagenesis)，ABM Press)。

MutS蛋白识别错配，而MutH是一种核酸内切酶。尚未证明MutL的活性，但已知它与MutS相互作用并且是活化MutH所必需的。

有几份研究报告似乎显示人体内存在MutHLS系统的同系物。特别纯化到了MutL(称为hMLH1)和MutS(称为hMSH2)。hMSH2识别单个碱基错配(如同MutS)，但也可识别因多碱基缺失/插入造成的更复杂的错配(Fishel等，1994，科学(Science)，266，1403-1405；Alani等，1995，Genes Dev.，9，234-247)。最近已进一步证明，hMSH2可与称为GTBP(G/T结合蛋白)的160KD蛋白质共纯化(Drummond等，1995，科学，268，1909-1912；Palombo等，1995，科学268，1912-1914)，但有关这些GTBP的作用目前尚未阐明。同样，hMLH1似乎与另一种蛋白质hPMS2结合，并形成称为hmutLα的杂二聚体(Li &Modrich，1995，美国国家科学院院报，92，1950-1954)。

这种错配修复机制的缺乏显然与肝癌，特别遗传性非息肉结肠癌(HNPCC)发生倾向有关。hMSH2(Fishel等，1993，细胞，75，1027-1038；Leach等，1993，细胞，75，1215-1225)或hMLH1(Bronner等，1994，自然，368，258-261；Papadopoulos等，1994，科学，263，1625-1629)突变时就是这种情况。

Mut蛋白质，特别是MutS或HMSH2，构成了完成本发明方法的可选择的靶。

研究这种类型的配体的重要性在于对细胞提取物的特征鉴定(活性组织检查或体内直接鉴定)。一般说来，缺乏HMSH2系统一般与肿瘤发生的危险升高有关。

烷基化剂或电离幅射可诱发单链断裂型DNA损伤。这些断裂在细胞内由聚(ADP-核糖)聚合酶(或称PARP)立即识别。

在真核细胞核中(除酵母外)存在大量的这种酶(上百万个分子)。

核苷酸序列研究显示该蛋白质具有两个区域，即包括2个锌指蛋白并与DNA结合的N末端区域，和具有催化功能的C末端区域(Cherney等，1990，美国国家科学院院报，87，2990-2994)。

当其结合到DNA单链断裂处时，PARP的催化活性即被激活。PAPP使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为底物，产生聚(ADP-核糖)。

聚(ADP-核糖)链的寿命期一般很短，只有几分钟。有可能在DNA-PARP相互作用阶段，借助NAD的结构类似物3-氨基苯甲酰胺抑制聚(ADP-核糖)合成而阻断该反应(Prigent等，1994，分子细胞生物学(Mol，Cel.Biol.)，14，310-317)。

PARP并不参予DNA修复，但可保护DNA免受核酸内切酶的破坏。特别是已显示，PARP在NER机制中并不起作用(Molinette等，1993，EMBO J.，12，2109-2117；Aboussekhra等，1995，细胞，80，859-868)。

虽然已明确了PARP在识别DNA单链断裂中的作用，但对其生理作用还了解不多。例如，有人提出它可能通过各种途径在引发凋亡中发挥作用，但这种作用特别是通过耗尽NAD的细胞储存实现的。PARP可避免断裂部位发生过于频繁的重组过程，从而保护细胞的基因组稳定性。它也可能通过对组蛋白的干扰而在染色质的区域开放中发挥作用(参见Lindahl等的综述，1995，TIBS，20，405-411)。

DNA双链断裂特别是因电离幅射造成的，但也可能是由于某些重组反应中的内源性因素产生的。

这些损伤修复不良或没有修复可能是十分有害的，因为这可能引起缺失或易位，而导致基因的失活。

在哺乳动物中，已鉴定了4组用于修复双链断裂的互补因子，确定了4个参予该过程的基因(参见Jackson & Jeggo，1995，TIBS，20，412-415)。在这4组(IR4-7；修复电离幅射损伤的IR)中，令我们特别感兴趣的是产物为XRCC5和XRCC7(X线修复交叉互补)的IR5及IR7组。

DNA-PK的组成中缺乏IR5和IR7组。DNA-PK(DNA依赖性蛋白激酶)是只有在与DNA结合时才有活性的丝氨酸/苏氨酸激酶(可见与PARP有一定的相似性)(Getts & Stamato，1994，生物学化学杂志，269，15981-15984；Rathmell & Chu，1994，美国国家科学院院报，91，7623-7627；Taccioli等，1994，科学，265，1442-1445)。DNA-PK是由催化亚基(DNA-PKcs)和称为Ku的与DNA相互作用的亚基组成的。

最初被鉴定为自身抗原的Ku是由70和80KD的2个多肽(Ku70和Ku80)组成的、并相当于XRCC5的异二聚体。它与DNA的末端结合，但不与细胞DNA结合(Gottlieb & Jackson，1993，细胞72，131-142)并因而激活DNA-PKcs亚基。

除DNA断裂附近RNA聚合酶I的磷酸化造成失活之外(Kuhn等，1995，Genes Dev.，9，193-203)，还没有明确界定DNA-PKcs(由XRCC7编码的)的底物，而且其在DNA修复中的作用还有待证明。

用于识别双链断裂的Ku配基可能更适用于鉴定电离幅射(例如核电站或医院)造成的损伤。

如上文所述，虽然还一直不详细了解DNA修复机制，但已知DNA的损伤首先须由很精确的配体或识别蛋白加以识别。该识别过程之后才是以适当形式再建DNA为目的的修复阶段。例如，值得提到的是，虽然由NER修复时只有7％的损伤受到体外修复，但绝大多数(如果不是全部)损伤均可被识别，这是因为它们都诱发DNA变形，并且可以说该修复步骤是限速的。

因此，本发明的方法是利用了这样一个观察结果，即主要变异在体外系统中即使没有被修复也会被识别，并且该识别步骤将可用于鉴定所说的变异。

因此本发明的方法是基于检测修复系统中用来识别DNA变异的一种或多种分子，特别是蛋白质。

本发明的方法首先是一种定性方法，即是说，它允许根据配体的类型精确检测DNA变异的存在及其性质。因此，鉴定XP-A与DNA的相互作用可显示出须经NER修复的变异；相反，MutS或HMSH2的相互作用则证明错配问题。特别是这种类型的试验能够限定环境的基因毒性及其对DNA作用的性质。

然而，如果可以定量分析结合的配体量，例如相对于标准品的量，则该方法也可作为一种定量方法。因此在后一种情况下，有可能估测变异的严重程度并监测其发展。在这种情况下例如特别可以对基因毒性剂进行分类(根据其基因毒性)，而且也可能监测变异在一定时间内的发展，例如用来“监测”治疗过程。

在上述试验中，所试验的产物是已受到基因毒性剂改变的DNA，而且希望评估其活性状态。还有可能使用本发明的方法，从“已知DNA的确定变异”开始，检测修复系统的活性。

具体地说，可以设想鉴定某些修复系统的缺陷。

为了确保识别条件，本发明的方法中除了配体外要使保证别的其他元件存在于介质中，特别是辅助因子；为此目的，一般使用可提供配体或否(在这种情况下将加入配体)的细胞提取物。

当期望试验某些细胞(例如生物学样品)修复系统的可能缺陷时，可以使用这些细胞的提取物直接对变异DNA进行试验，从而可以用预制备的标准品(例如用正常细胞提取物)估测变异识别活性。

因此，本发明还涉及允许鉴定样品中DNA修复系统的变异的方法，特征在于：

a)使样品与变异的DNA接触，

b)显示修复系统的配体对变异的识别，

c)相对于标准品，评价步骤(b)中所获得的结果。

可以看出，在该基本方法中实现的整体进步也可用于前述方法中。

标准品例如可以是在等同条件下处理的正常样品，或用其他方法特别是用校正曲线校正的标准品。

“修复系统的变异”是指相对于作为标准的对照系统，某修复系统在上述试验中反应的改变。总地说来，这种变异的特征是对变异DNA的识别缺陷，但也可能是相反。

因此，可使用本发明的方法鉴定是否存在例如与已确定病理过程相关的蛋白质。利用这种应用，通过检测错配修复中的缺陷(Eshlemen& Markowits，1995，Curr.Opin.Oncol.，7，83-89)可以评估对用于病人体内抗肿瘤治疗的某些烷基化剂的获得性抗性或对放射治疗的敏感性或抗性。

再者，本发明的方法可用来鉴定DNA配体识别调节剂(例如与修复因子相互作用的抗肿瘤剂)的变异。

在这种情况下，实际上将观察识别配体反应中的变化。

可按照不同的变化方案实现本发明方法的特定实施方案。

可按照不同变化方案来使用本发明的方法。

所试验的DNA可以是总细胞提取物，未纯化的细胞提取物或纯化的DNA；有关试验材料的选择将取决于所进行研究的类型。

识别介质可以是全合成的，或者可以是由细胞提取物组成的，特别是该介质也会带有配体，在这种情况下，将用与配体结合的标志物，例如标记的抗体来揭示。不管在什么情况下，识别基质均应含有识别变异所需的所有辅助因子。

就内源性配体或内源性DNA的存在来说，识别介质是由不同纯化程度的细胞提取物组成的。

可用任何适当的方法特别是已规定的方法，借助标记的配体或借助识别配体的抗体来检测配体和DNA的相互作用。

在所有情况下，标记可以是放射活性的或非放射性的。优选使用非放射活性标记，例如使用荧光标记或酶标记。

具体地说，可以设想步骤a)提供识别不同类型变异的化合物，并在步骤b)中可分别鉴定不同类型的识别。因此在使用荧光标记物时，可以使用不同的发光团。这样便有可能直接显现出变异的类型，甚至各种不同的变异。

更具体地说，本发明的方法包括以下步骤：·  在使用靶DNA时，试验因子(物理的或化学的)对该DNA的作用；就化学因子来说，化合物的作用可能需要该化合物活化剂混合物的共同作用(例如“S9”型肝提取物在所有必要辅助因子存在下的生物转化作用)；·  纯化那些想要弄清DNA变异程度的细胞或组织中的DNA(例如监视接触到危险环境的病人或正常人；将培养中的细胞与基因毒性待测的试剂一起保温；分析细胞DNA的变异状态与例如某些疾病的存在或素质之间关联)；·  使具有修复活性或至少是变异识别活性的细胞提取物作用于该DNA，或更简单地说是一种识别这些变异的蛋白或蛋白复合物或缺乏某种蛋白质(待加入)的提取物；·  借助抗体揭示蛋白或蛋白复合物的相互作用；更简单的是，就识别损伤的纯化蛋白质来说，可以直接在该蛋白质上接上一个例如直接显示的标记物(例如荧光类型的)，或间接显示的标记物(酶促类型的)，这些例子不是限制性的；·  在使用抗体的情况下，完成其直接或间接显示(直接标记的抗体)或用第二抗体(或配体)显示；·  用选择的敏感技术，如基于光发射(发光底物)或荧光、放射活性进行检测。

所有这些步骤均可在液相或半固相中使试剂之一与载体物(例如微量滴定板、膜或微球、凝胶或琼脂糖柱或亲和柱)结合来完成；在第一种情况下，最好是选择在不同的步骤之间不需要进行洗涤的系统，或者选择单一步骤的系统；在第二种情况下，不同的步骤是通过洗涤分开的。

如用固相或半固相进行检测时，所连接的试剂特别是配体或DNA的性质可取决于所进行的试验的类型(即损伤程度试验或识别试验)。

当在液相中进行检测时，应能够检测配体与DNA的结合；特别是可以设想使用对DNA和配体的两种不同的标记，并肉眼估测不同标记物的接近程度。也可能使用其中标记物之一只能以第二个标记物的接近加以展示的TRACE型系统。一般说来，试验包括在抗DAN抗体和对DNA变异特异的蛋白质存在下保温DNA(受损伤的或未受损伤的)。所说的蛋白可以直接偶联到荧光团上或用抗体来揭示。在使用抗DNA抗体和特异蛋白质的情况下，两种配体都可以偶联有荧光团，其发射波长有足够差异以按良好分辨率同时读数。在上面设想的两种情况下，也可以使用CIS bio International(Bagnols-sur-Seze，France)所述TRACE(Time-Resolved Amplified Cryptate Emission)检测系统。在这种情况下，可以将抗DNA抗体与“Cryptate”(三双吡啶二胺铕)结合，并将损伤识别蛋白或识别它的抗体结合到能量接受发光团，例如CIS BioInternational称为XL665的修饰的藻胆蛋白上(或相反)，或结合到只在变异的DNA附近才形成复合物的标记2蛋白上。可以通过将信号与DNA量关联而将读数标准化。可以借助同一系统，例如使用两种抗DNA抗体(其中一种偶联到Cryptate上，另一种偶联到接受能量的荧光团上)测得该DNA的量(相对量)。

TRACE系统的优点是其检测速度快(因为它不需要洗涤步骤)，但尤其是可在各种条件下进行DNA(以及损伤)的定量分析。此外，该系统是完全自动化的，另外已适用于HTS筛选。

如果没有用来检测变异的纯化配体，或者如果需要蛋白质或非蛋白质辅助因子参予相互作用步骤，则可使用细胞提取物，其纯化程度以存在这些辅助因子为准。在这种情况下，可借助抗该配体的抗体来检测配体与变异的相互作用。该抗体可偶联有可以检测它的系统，或者按照本领域技术人员已知的方法使用抗第一抗体的第二抗体，并将第二抗体偶联到检测系统上。

在固相检测法中，可以使受损伤的DNA附着到载体上并显示配体与该DNA之间的结合；也可使用由上述液相方法衍变的方法。

还可以使用“生物芯片”型检测系统，特别是由Affmetrix或CISBio International(Bagnols-sur-Seze，France)开发的技术。

可以使以下DNA附着在芯片上：·  含有错配的寡核苷酸或DNA，使得能够检测活体组织中或体内hMSH2的存在，并因而能够估计发生肿瘤的危险。为了将纯合子健康个体与hMSH2基因为杂合子、有发生肿瘤特别是结肠癌倾向的个体区分开，该方法应是定量的。·  含有用于化学治疗之基因毒性剂(烷基化剂、顺铂等)加成物的寡核苷酸或DNA，可用于监测XPA蛋白的水平及监测某些类型的抗性。

还有可能使蛋白质附着在芯片上：·  问题不再是使用蛋白质抗体而是蛋白质本身。理论上，可使用抗DNA抗体检测所有类型的损伤并用抗DNA抗体进行DNA定量分析，这可能将各型损伤所得到的信号与“DNA”信号关联。这一系统对于治疗监测似乎是相当优越的。

如开头所述，本发明的方法可特别用于通过检测样品DNA的变异来估计环境对所说样品造成的基因毒性。

“环境”是指化学、生物学及物理因素(例如幅射)。

本发明特别适用于对体外培养的、从活体外分离的或得自动物或植物组织的细胞DNA的损伤进行定性和定量估测，例如用于检测基因毒性异生素、对经受化学治疗的肿瘤病人进行治疗监测、用于监测与潜在基因毒性剂接触者发生肿瘤的危险。

还可将其用于定性和定量估测与亲核分子(DNA、脂质化合物等)反应的化合物如自由基(例如特别可用于化妆品领域)，以及用于定性和定量估测抑制氯化剂作用的化合物。

最后，该方法可利用缺少部分损伤修复系统的细胞提取物、或特异性蛋白质、或抗特异性蛋白质的抗体来确定细胞提取物识别损伤的能力，以及确定所诱发的DNA损伤的类型。

基于检测参予修复受损DNA之蛋白质的特异性相互作用的本发明方法具有许多优点：·  在使用固相载体的情况下，该试验是一种简单的ELISA试验，其可实现自动化并适于进行“高通量筛选”(HTS)，·  全液相中进行该试验时，它同样易实现自动化，·  特别与1995年3月15日的9503230号法国专利(公开号2,731,711，公开日1996年9月20日)，及1996年3月13日提交的PCT/FR96/00391号申请(公开号WO9628571，1996年9月19日)中所述的检测法相比，本方法的优点是：

·  只需要较少的提取物，或者

·  不需要细胞提取物，而只要一种纯化的蛋白质(或其组合)，甚至用基因工程方法生产的蛋白质即可，

·  不需要修饰的或标记的核苷酸，例如放射活性标记的核苷酸，

·  不必使DNA吸附到致敏载体上，而可以使靶DNA在一端附着(例如生物素化的DNA，即载体偶联到生物素配体如链霉抗生物素蛋白上)；·  试验更加迅速(因为它只参予损伤识别步骤，而不是识别-修复的整个过程)，其可使试验时间降到2-3小时；·  如果使用NER蛋白，即可在激活系统的存在下保温靶DNA；其中激活系统可使用各种来源的激活组分：

·  经诱导或未诱导的大鼠或豚鼠肝S9或微粒体部分，

·  用氢化可的松21-半琥珀酸酯和苯并蒽刺激或未刺激的人HepG2细胞的提取物，

·  人MCL5细胞系的细胞提取物(Gentest公司)，

·  表达P450的重组真核细胞的提取物，

·  用卟啉催化。

在使用单一识别蛋白(携带或不携带标志物)时，优选使用XP-A蛋白，因为该蛋白是识别DNA损伤的第一种蛋白质。此外，业已克隆了该蛋白质的互补DNA，可以在用来增殖其载体的微生物中表达并因而在发酵罐中大量生产之。

也可以将XP-A蛋白与RPA复合物共保温。

还可望按同样方式只使用XPA或RPA复合物。

还可望按同样方式使用HMG蛋白。

总地说来，按本发明最有意义的系统是NER和BER系统。

可参照附图进一步了解本说明书的剩余部分。

图1：Gene TEX(基因毒理学环境异生素)试验原理

GeneTEX试验包括6个步骤：

1-使靶DNA吸附到载体上，

2-与基因毒性剂保温以产生损伤，

3-用得自细胞提取物的蛋白质识别损伤，

4-用抗体揭示该蛋白质的附着，

5-用偶联有酶的抗抗体揭示第一抗体的附着，

6-加入酶的化学发光底物以产生光信号。

双螺旋代表DNA，黑园圈代表损伤，白卵园代表损伤识别蛋白，白色长方形代表与酶偶联的抗体。

图2：用细胞提取物中的XPA蛋白识别并用抗XPA单克隆抗体检测由UVC造成的损伤

该图显示渐增UVC剂量后得到的信号(信号/本底噪音比)。

图3：用细胞提取物中的Ku蛋白识别并用抗Ku单克隆抗体检测博来霉素诱发的双链断裂

该图显示渐增博来霉素浓度后所得到的信号(信号/本底噪音比)。

图4：由细胞提取物中的Ku蛋白检测并由抗Ku单克隆抗体确定放射诱导的双链断裂的持久性

+/+代表ATM基因未突变的细胞

+/-代表ATM基因杂合的突变细胞

-/-代表ATM基因纯合的突变细胞

12小时和24小时代表照射下保温后的时间

1Gy和3Gy(戈瑞)限定照射剂量

本发明的一个优选实施方案是基于称为GeneTEX的试验的原理：

整个试验最好在30℃下完成。各步骤间都有一个洗涤过程。

使靶DNA吸附到先前用聚赖氨酸包被的小孔上。使该DNA经受基因毒性剂或至少含有一种所说的基因毒性剂之组合物的作用，并持续预定的时间，最好是30分钟。

该步骤中，如果所试验的溶液含有一种(或多种)基因毒性剂，即可对DNA产生损伤。

将人来源的，最好是衍生于Hela细胞的细胞提取物加于DNA上保温。识别DNA损伤的蛋白质将附着在变异部位。

加入抗识别变异之蛋白质的抗体，最好是单克隆抗体，并用以识别附着在变异部位上的蛋白质。

加入偶联有酶特别是过氧化氢酶的、抗第一抗体(其优选识别由之衍生第一抗体的蛋白)的第二抗体，并借以识别第一抗体。

加入酶的发光底物并用光量计定量测定所发射的光信号。

图1中图解显示了geneTEX试验的一种模式。但该试验不限于这种模式，并可包括下列变化模式：

1)可以将抗识别蛋白的抗体直接偶联到检测系统上，因而不再需要第二抗体。该检测系统可是酶、荧光标记、时间分辨的荧光标记(铕络合物类型的)或电化学发光标记。

2)在基因毒性剂存在下将细胞保温一定时间，然后溶解细胞并使细胞DNA吸附到致敏小孔上。然后按正常方法完成整个试验。

3)可在液相中完成整个试验，而不必按照Cis Bio International(Bagnols-sur-Seze，France)建立的技术使用固相载体，其中所说的技术中利用了cryptate铕盐与能量接受体(特别是XL665分子)之间的能量转移。只有在例如由两种抗体携带两种分子足够近时才发射信号。试验中，例如将抗识别变异之蛋白质的抗体偶联到Cryptate上，并将抗DNA抗体偶联到XL665上(或相反)，或者是使用针对在受损伤DNA附近形成复合物的两种蛋白质的两种抗体。两种抗体足够接近，将有可能在受激发的Cryptate铕盐和XL665接受体间发生能量转移，而且所发射的荧光信号与附着于变异识别蛋白质上的抗体的量成正比。

实施例1：由NER系统识别的DNA损伤的检测

在发射254nm光的灯下以50μW/cm²用UVC照射浓度为50μg/ml的DNA(质粒pUC18)，以造成DNA损伤。照射时间足以产生5至200J/m²的剂量。

以每孔50ng的比例将预先用UVC造成损伤的DNA吸附到用聚赖氨酸包被的孔上。作为对照，使用带有以BER系统修复的氧化损伤(在亚甲蓝存在下经光照而产生的损伤)的DNA。

保温30分钟之后，用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

之后再用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

然后于搅拌下，于30℃用加在PBS中的3％ BSA溶液饱和小孔1小时。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗一次。

然后将经过处理的DNA与Wood改良的(Wood等，1988，细胞，53，79-106)Manley型细胞提取物(Manley等，1980，美国国家科学院院报，77，3855-3859)在含有40mM Hopes、5mM MgCl₂、50mM KCl、0.5mM DTT、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml BSA、50μg/ml肌酸磷酸激酶、2mM EGTA的缓冲液(pH7.6)中30℃保温90分钟。

用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

搅拌下，将在加有0.1％BSA的PBS中稀释到900ng/ml的抗XPA单克隆抗体和Igepal CA-630(Sigma)于30℃保温2小时，以展现XPA蛋白的附着。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗3次。

然后用1/10,000稀释的(在与稀释第一抗体的同样缓冲液中)偶联有过氧化物酶的羊抗小鼠第二抗体保温30分钟，识别抗XPA的第一抗体。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗5次。

然后加入发光过氧化物酶底物(Specichrom，由法国Speci，SteFoy-les-Lyon出售)，并在搅拌下30℃保温15分钟。

用Victor(Wallac OY，Tarku，芬兰)检测所发射的光信号。

结果以具体信号对未处理的质粒信号的比例来表示，图2中给出了所获结果的实例。

因此在试验的这个阶段显示出UVC损伤的检测阈为30J/m²。

没有检测到由光照下亚甲蓝产生的损伤。

实施例2：DNA中双链断裂的检测

用Ku-DNA^PK复合物检测这种类型的、造成DNA片段及末端数目增加的断裂。Ku亚单位(Ku70-Ku80)可确保在末端上的附着。

在实践中，在铁离子存在下由拟放射分子博来霉素产生双链断裂：在这种情况下，产生如同用电离幅射治疗一样的双链断裂。

以每孔50ng的比例使DNA吸附到用聚赖氨酸包被的孔上。

保温30分钟后，用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗2次。

以递增剂量的博来霉素(0到200μM)在0.5μM FeCl₂存在下30℃及搅拌下与吸附的DNA保温30分钟。

然后用加入Tween-20(0.1％)的PBS溶液洗孔2次。

然后用溶于PBS的3％BSA溶液搅拌下将小孔30℃饱和1小时。

然后再用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗一次。

然后将经过处理的DNA与Wood改良的(Wood等，1988，细胞，53，79-106)Manley型细胞提取物(Manley等，1980，美国国家科学院院报，77，3855-3859)在含有40mM Hopes、5mM MgCl₂、50mM KCl、0.5mM DTT、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml BSA、50μg/ml肌酸磷酸激酶、2mM EGTA的缓冲液(pH7.6)中30℃保温90分钟。

用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

搅拌下，将在加有0.1％ BSA的PBS中稀释到400ng/ml的抗Ku单克隆抗体和Igepal CA-630(Sigma)于30℃保温2小时，以展现Ku复合物的附着。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗3次。

然后用1/10,000稀释的(在与稀释第一抗体的同样缓冲液中)偶联有过氧化物酶的羊抗小鼠第二抗体保温30分钟，识别抗Ku的第一抗体。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗5次。

然后加入发光过氧化物酶底物(Specichrom，由法国Speci，SteFoy-les-Lyon出售)，并在搅拌下30℃保温15分钟。

用Victor(Wallac OY，Tarku，芬兰)检测所发射的光信号。

结果以具体信号对未处理的质粒信号的比例来表示，图3中给出了所获结果的实例。

因此在试验展开的这个阶段显示，在0.5μM FeCl₂存在下由博来霉素造成的双链断裂的检测阈为0.032μM(32nM)。

实施例3：DNA碱基错配的检测

用蛋白复合物检测这种类型的DNA损伤。错配的识别是由hMSH2蛋白完成的。

实践中，合成一个37mer寡核苷酸，以便产生正确的配对或错配位点(划下线处为导入错配的碱基)。

合成下列序列(Fishel等，1994，科学，266，1403-1405)：

MIS-C     5′  ATGTGAATCAGTATGGTTCCTATCTGCTGAAGGAAAT 3′

MIS-T     5′  ATGTGAATCAGTATGGTTTCTATCTGCTGAAGGAAAT 3′

MIS-Grev  5′  AATTCCTTCAGCAGATAGGAACCATACTGATTCACAT 3′

将寡核苷酸按1mg∶ml溶解在TEIX中。

按各寡核苷酸400μg/ml的浓度，在1M NaCl存在下以200μl体积完成配对(杂交)。

在热循环仪中将试管于100℃加热10分钟，然后冷却3小时。

然后加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，再于4℃下以14,000rpm离心40分钟。在70％乙醇洗沉淀物并干燥后，将沉淀物重新溶解于1.5ml TEIX中(终浓度为100μg/ml)。

MIS-C+MIS-Grev杂交产生正常配对的双链DNA(C∶G)，而MIS-C+MIS-T杂交则产生包含错配的双链DNA(C∶T)。

使DNA以每孔200ng的比例吸附到用聚赖氨酸包被的小孔上。

保温30分钟后，用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将孔洗两次。

然后于30℃搅拌下，用溶于PBS中的3％BSA溶液饱和各孔。

再用添加有Tween-21(0.1％)的PBS溶液洗小孔一次。

然后将经过处理的DNA与Wood改良的(Wood等，1988，细胞，53，79-106)Manley型细胞提取物(Manley等，1980，美国国家科学院院报，77，3855-3859)在含有40mM Hopes、5mM MgCl₂、50mM KCl、0.5mM DTT、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml BSA、50μg/ml肌酸磷酸激酶、2mM EGTA的缓冲液(pH7.6)中30℃保温90分钟。

用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

搅拌下，将在加有0.1％ BSA的PBS中稀释到2μg/ml的抗hMSH2单克隆抗体和Igepal CA-630(Sigma)于30℃保温2小时，以展现hMSH2蛋白的附着。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗3次。

然后用1/10,000稀释的(在与稀释第一抗体的同样缓冲液中)偶联有过氧化物酶的羊抗小鼠第二抗体保温30分钟，识别抗hMSH2的第一抗体。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗5次。

然后加入发光过氧化物酶底物(Specichrom，Speci，Ste Foy-les-Lyon，法国)，并在搅拌下30℃保温15分钟。

用Victor(Wallac OY，Tarku，芬兰)检测所发射的光信号。

具体信号(带有错配的寡核苷酸；T∶G)与不带错配(C∶G)的寡核苷酸信号的比例为5。

实施例4：用于检测带有或不带有突变ATM基因的病人细胞中双链断裂修复能力的差异

以0、1和3Gy的剂量照射培养物中的来自ATM(安泰乐血管扩张；导致对电离幅射的高敏感性)基因杂合子或纯合子健康人的成淋巴样细胞。1和3Gy剂量可产生DNA双链断裂，并可借助实施例2中所述Ku-DNA^PK的识别作用进行检测。

然后在适当的培养基中将细胞培养12和24小时，然后洗细胞并置-80℃下冷冻。

然后溶解细胞，并按前述实施例的方法使基因组DNA吸附到小孔上。

保温30分钟后，用添加有Twenn-20(0.1％)的PBS溶液将孔洗两次。

搅拌下用溶于PBS的3％BSA溶液将小孔30℃饱和l小时。

然后用加有Tween-21(0.1％)的PBS溶液将小孔洗1次。

然后将经过处理的DNA与Wood改良的(Wood等，1988，细胞，53，79-106)Manley型细胞提取物(Manley等，1980，美国国家科学院院报，77，3855-3859)在含有40mM Hepes、5mM MgCl₂、50mM KCl、0.5mM DTT、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml BSA、50μg/ml肌酸磷酸激酶、2mM EGTA的缓冲液(pH7.6)中，30℃保温90分钟。

用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

搅拌下，将在加有0.1％ BSA的PBS中稀释到100ng/ml的抗Ku单克隆抗体和Igepal CA-630(Sigma)于30℃保温2小时，以展现Ku复合物的附着。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗3次。

然后用1/10,000稀释的(在与稀释第一抗体的同样缓冲液中)偶联有过氧化物酶的羊抗小鼠第二抗体保温30分钟，识别抗Ku第一抗体。

然后用加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗5次。

然后加入发光过氧化物酶底物(Specichrom，Speci，Ste Foy-les-Lyon，法国)，并在搅拌下30℃保温15分钟。

用Victor(Wallac OY，Tarku，芬兰)检测所发射的光信号。

结果以具体信号对未处理的质粒信号的比例来表示，图4中给出了所获结果的实例。

因此这些结果显示该试验特别适用于检测病人细胞的放射敏感性。依赖由电离幅射诱发的DNA断裂的修复动力学，可以将纯合子ATM病人、杂合子ATM病人和不携带该基因突变的病人区分开。

如由持续断裂的百分比所显示的，在使用3Gy剂量的下，ATM基因为杂合子的病人的修复较差。

按照同样原则，有可能检测对电离幅射的任何敏感性，而不管它是由于ATM基因还是其他基因的缺陷。

实施例5：用抗XPA抗体和DELFIA技术检测由NER系统识别的DNA损伤

按实施例1中所述，用UVC或顺铂预先造成DNA(质粒pUC18)损伤。

以每孔500ng的比例使预先用UVC或顺铂造成损伤的DNA吸附到用聚赖氨酸包被的小孔上。使用带有由BER系统修复的氧化损伤(在亚甲蓝存在下经光照产生的损伤)的DNA作为对照。

保温30分钟后，用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

再用添加有Tween-20(0.1％)的TBS(Tris缓冲盐水)溶液洗两次。

然后于30℃搅拌下，用溶于TBS的3％BSA溶液饱和小孔。

再用加有Tween-20(0.1％)的TBS溶液将小孔洗1次。

然后将经过处理的DNA与Wood改良的(Wood等，1988，细胞，53，79-106)Manley型细胞提取物(Manley等，1980，美国国家科学院院报，77，3855-3859)在含有40mM Hopes、5mM MgCl₂、50mM KCl、0.5mM DTT、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml BSA、50μg/ml肌酸磷酸激酶、2mM EGTA的缓冲液(pH7.6)中30℃保温90分钟。

用添加有Tween-20(0.1％)的PBS溶液将小孔洗两次。

搅拌下将在加有0.1％BSA的TBS中稀释到500ng/ml的抗XPA单克隆抗体与Igepal CA-630(Sigma)30℃保温2小时，以展现XPA蛋白的附着。按照Wallac方法预先用平均10铕(Eu³⁺)络合物标记该抗体。

然后用加有Tween-20(0.1％)的TBS溶液将小孔洗8次。

然后加入显现溶液(“增强溶液”，Wallac)(50μl/孔)并将平板强烈搅拌5分钟。按照适用于铕络合物的DELFIA方法，用Victor(Wallac oy，Turku，芬兰)检测所发射的荧光(“时间分辨荧光”)。

结果用特定信号对未处理的质粒信号的比例表示，并相似于图1中所示的结果。

因此显示，在该试验发展的这一阶段，UVC损伤的检测阈值也是30J/m²。

DELFIA技术已成功地适用于本发明的方法。

                        序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

    (A)名称：GENOLIFE

    (B)街道：BIOPOLE CLERMONT-LIMAGNE

    (C)城市：SAINT BEAUZIRE

    (E)国家：法国

    (F)邮编：63390

(ii)发明名称：定性和定量检测DNA变异及这些变异的配体的方法

(iii)序列数：3

(iv)计算机可读形式：

    (A)载体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本 #1.30(EPO)

(vi)在先申请的数据：

    (A)申请号：FR 9706102

    (B)申请日：1997年5月20日(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：37碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：单

    (D)构型：线性

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

    (A)名称/关链词：MIS-C

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1ATGTGAATCA GTATGGTTCC TATCTGCTGA AGGAAAT          37(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：37碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：单

    (D)构型：线性

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

    (A)名称/关链词：MIS-T

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2ATGTGAATCA GTATGGTTTC TATCTGCTGA AGGAAAT          37(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：37碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：单

    (D)构型：线性

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

    (A)名称/关链词：MIS-Grev

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3AATTCCTTCA GCAGATAGGA ACCATACTGA TTCACAT          37