中国棉玲虫重组病毒

摘要

本发明是一种对野生型病毒进行遗传改良的中国棉铃虫重组病毒,其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因,在缺失egt基因的位点处,插入由中国棉铃虫病毒多角体蛋白基因启动子控制的昆虫特异性神经毒素AaIT基因和标记基因绿色荧光蛋白GFP基因。该重组病毒是利用基因工程方法经过二次重组而获得的。本发明具有比野生型病毒更快的杀虫速度和更好的田间应用效果等优点。

说明书

本发明涉及微生物领域，特别是一种能够防治农林害虫棉铃虫和烟青虫的中国棉铃虫重组病毒。

目前，杆状病毒已用于农林害虫的生物防治。和其它杆状病毒一样，中国棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera singlenucleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下简称野生型病毒或HaSNPV)由于存在杀虫速度慢的缺陷，致使其用于大面积控制棉铃虫危害的作用受到了限制。

基因工程遗传改良被认为是提高病毒杀虫性能的有效途径，为了提高棉铃虫病毒的杀虫速度，本申请人已经通过基因工程的方法构建了缺失蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(Ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，简称egt)基因的重组棉铃虫病毒--中国棉铃虫病毒基因工程株1号(以下简称工程病毒1号)，并申请了专利(申请号99116683.3；保藏号CGMCC0374)。病毒表达蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶可以介导葡萄糖基与蜕皮激素的结合，降低了宿主体内蜕皮激素的活性，延迟了宿主昆虫的蜕皮时间，增加宿主昆虫的体重，从而达到增殖更多子代病毒的目的。删除病毒的egt基因后，被感染幼虫的激素代谢将发生紊乱，死亡时间将缩短。室内和田间试验结果表明，和野生型棉铃虫病毒相比，尽管工程病毒1号的防治效果已明显改善，但随着近期研究的进展，我们认为先前的工作还可以进一步提高。

本发明的目的是在先前土作的基础上，利用基因工程的方法对野生型病毒进行了双重重组，提供一种新型工程病毒--中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419，该病毒具有更佳的杀虫效果，可用于棉花、烟草、辣椒等作物上棉铃虫及烟青虫的防治。

本发明的目的是按下述方案实现的：所提供的中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419，其基因组中缺失egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因位点处，插入由中国棉铃虫病毒多角体蛋白基因启动子控制的昆虫特异性神经毒素AaIT基因和标记基因绿色荧光蛋白GFP基因。该重组病毒是利用基因工程方法对野生型病毒通过二次重组而获得的。

和野生型病毒及工程病毒1号相比，本发明提供的中国棉铃虫重组病毒(简称新型工程病毒)优点突出，具有更快的杀虫速度和更好的田间应用效果。请见附表和图1、图2：生测结果表明，新型工程病毒对二龄棉铃虫幼虫的半致死时间(LT₅₀)比野生型病毒缩短27.6％，比工程病毒1号缩短12.2％。田间试验结果表明新型工程病毒比野生型病毒和工程病毒1号的杀虫速度明显提高。在处理后4天内，新型工程病毒处理的棉铃虫幼虫的累计取食量比野生型病毒处理的幼虫减少65％，比工程病毒1号处理的幼虫减少28.6％。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

图1是新型工程病毒、工程病毒1号及野生型病毒处理后田间棉铃虫的校正虫口减退率柱形示意图。

图2是新型工程病毒、工程病毒1号及野生型病毒处理后棉铃虫幼虫的累计取食量比较曲线示意图。

图3是新型工程病毒的构建过程示意图。

图4是图3中重组质粒pHaGFP⁺egt^-的构建过程示意图。

一、图1、图2说明：

1、图1说明：

(1)图例：为野生型病毒；为工程病毒1号；为新型工程病毒；R：校正虫口下降率(％)；T：时间(天)

(2)校正虫口减退率％＝(处理区虫口减退率-对照区虫口减退率)÷(1-对照区虫口减退率)×100

(3)每个处理3个重复，每个小区调查30个棉株，施药前每小区虫口基数均大于30头。统计分析按新复极差测验(SSR测验)：药后3天F＝2.42，药后5天F＝9.78，药后7天F＝10.92。F_0.05＝5.14。

2、图2说明：

A：无病毒处理。B：野生型病毒处理。C：工程病毒1号处理。D：新型工程病毒处理。M：累计取食叶面积(mm²)。T：时间(小时)。

二、实施例

1、本发明提供的中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419，其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄基转移酶基因，在缺失egt基因位点处，插入由中国棉铃虫病毒多角体蛋白基因启动子控制的昆虫特异性神经毒素AaIT基因和标记基因绿色荧光蛋白GFP基因。AaIT基因来源于非洲蝎子(Androctonus australis)，属于兴奋型昆虫毒素，它专一作用于昆虫传导过程的钠离子通道，诱发神经轴突重复性地发放，引起被感染昆虫收缩性麻痹。

上述昆虫特异性神经毒素AaIT基因还可以由其它有相同毒性效果的毒素如蝎毒LqhIT2、螨类的神经毒素TxP-I等替换。特异性毒素的插入位点可以在egt位点，也可在病毒基因组中的其他位点。标记基因还可以用半乳糖苷酶LacZ基因等替换，也可以在重组病毒构建好后删除标记基因。

2、本发明病毒的构建方法，包括以下步骤：

先进行第一次重组，构建重组质粒pHaGFP⁺egt^-，即

(1)将野生型病毒egt基因的5’端及上游序列、3’端及下游序列这两个片段分别克隆到通用载体pBluescriptIIKS^-(简称pKSPS^-)(见Short，J.M.，1988，Nucleic Acid Research，16：7583)，

(2)在这两个片段之间，即利用分子生物技术在已删除了的原egt基因编码区的位点处，插入苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus，简称AcMNPV)的多角体蛋白基因启动子AcPph控制的绿色荧光蛋白GFP基因(见Boxer，S.G.，1996，Nature，383：484)，获得重组质粒pHaGFP⁺egt^-，

再进行第二次重组，即

(3)在重组质粒pHaGFP⁺egt^-的GFP基因与egt基因3’端下游序列之间，插入HaSNPV的多角体蛋白基因启动子HaPph(见陈新文等，1997，中国病毒学，12：346)控制的昆虫特异性神经毒素AaIT基因，得到重组转移载体pHaGFP⁺egt^-AaIT⁺。

(4)将pHaGFP⁺egt^-AaIT⁺与HaSNPV DNA共转染宿主昆虫细胞，通过等位基因交换，转移载体上位于egt基因5’端部分序列及3’端部分序列之间的AaIT及GFP基因被重组到野生性病毒的egt位点，获得重组病毒体，该重组病毒中已删除大部分egt基因的编码序列，其位置被AaIT及GFP基因取代。

(5)经过多轮空斑纯化，得到纯的双重重组病毒即中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419。

图3显示了本发明病毒的构建过程。其中pAcRH1为含蝎子昆虫特异性神经毒素基因AaIT的质粒(见Martens，J.W.M.等，1995，Journal ofInvertebrate Pathology，66：249)。AaIT为蝎子昆虫特异性神经毒素基因。pKSPS^-为通用载体pBluescriptIIKS^-。p1、p2为中间载体。HaPph为HaSNPV多角体蛋白基因的启动子。GFP为绿色荧光蛋白基因。AcPph为AcMNPV多角体蛋白基因的启动子。HaSNPV为中国棉铃虫单核衣壳核多角体病毒基因组DNA。egt为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因。egt 5’为egt基因5’端及上游序列。egt 3’为egt基因3’端及下游序列。pHaGFP⁺egt^-AaIT⁺为重组转移载体。HaNPVGFP⁺egt^-AaIT⁺为中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419。

图4显示了图3中重组质粒pHaGFP⁺egt^-构建过程。其中HaSNPV为中国棉铃虫单核衣壳核多角体病毒基因组DNA。egt为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因。egt 5’为egt基因5’端及上游序列。egt 3’为egt基因3’端及下游序列。p3、p4、p5为中间载体。pKSPS^-为通用载体pBluescriptIIKS^-。PGFP为含绿色荧光蛋白基因的质粒。GFP为绿色荧光蛋白基因。AcPph为AcMNPV多角体蛋白基因的启动子。

本发明提供的中国棉铃虫重组病毒，已于1999年10月9日提供保藏，保藏单位是位于北京中关村中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC NO.0419，保藏名称是“中国棉铃虫病毒基因工程株2号”，分类命名是“中国棉铃虫核型多角体病毒基因工程株2号”(Genetically modified Helicoverpa armigeranucleopolyhedrovirus No.2，请见存活性报告书)。所提供的病毒培养物为昆虫病毒多角体，只能采用活体增殖。增殖方法：以1×10⁶个多角体/ml的浓度感染3龄的中国棉铃虫幼虫，然后置26-28℃培养5-7天，收集病死虫。检测存活亦要求生物测定，即病毒感染棉铃虫的活性。

三、其它：

1、中国棉铃虫重组病毒CGMCC0419的鉴定：

(1)利用限制性内切酶初步鉴定重组病毒的正确性；

(2)设计合适的引物，利用聚合酶链反应(PCR)的方法进一步确定重组病毒中egt基因的大部分编码序列已被删除，外源基因(AaIT和GFP基因)已正确插入；

(3)分析重组病毒的蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶活性，确定egt基因已经失活。

(4)室内生物活性测定以及田间药效试验，确定重组病毒的效果。

2、重组病毒可以通过虫体或细胞培养的方法大批量增殖，配制成可湿性粉剂或乳悬剂等剂型，用于棉花、烟草、辣椒等作物上棉铃虫及烟青虫的防治。该重组病毒杀虫剂保留了野生型棉铃虫病毒杀虫剂不伤害天敌、对环境的安全以及害虫不易产生抗药性等优点。附表  新型工程病毒、工程病毒1号及野生型病毒杀虫效果比较