几丁质酶和抗菌肽基因双价抗病载体

摘要

一种几丁质酶和抗菌肽基因双价抗病载体pChima,由于把抗真菌的几丁质酶基因(Chi)与抗细菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)共同容纳在同一个植物表达载体上、让其同时表达,几丁酶分解真菌细胞壁,使真菌细胞膜暴露于阳离子抗菌肽的作用之下,两者协同作用,破坏病菌细胞壁和细胞质,因而大大提高了转基因植物的抗性和广谱性。该载体既可用于水稻、小麦、玉米、甘蔗等单子叶作物,也可用于棉花、油菜、大豆、花生等双子叶作物,还可用于蔬菜、园艺、林业等方面。

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种几丁质酶和抗菌肽基因双价抗病载体pChima。

作物病虫害是影响作物产量的主要因素之一，一般可使作物减产20-30％。作物病害主要有细菌、真菌和病毒性病害，其中所有的高等植物都受多种真菌的侵害。传统的病害防治方法主要有：1、通过有性杂交育种，选用作物本身的抗性基因选育抗病品种。但存在可利用的抗性品种资源少、选育时间长、抗病品种易出现抗性丧失等现象；2、施用化学杀菌剂。施用药剂污染环境、破坏生态平衡；3、采用栽培技术措施等。近年来随着生物工程技术的发展，外源基因转化已开始在作物遗传育种中得到广泛的应用。国内外科学家利用转基因技术，在作物抗病育种方面做了大量的工作，并获得了一些转基因抗病植株。到目前为止的现有技术中，主要有植物保卫基因和抗菌肽基因。几丁质酶是一种以几丁质——β-1，4-N-乙酰葡萄糖胺线性同聚物为底物的水解酶，几丁质酶具有降解病原真菌细胞壁的作用，从而对病原菌的侵染和扩展具有抑制作用。通过把几丁质酶基因转入水稻、烟草、番茄、油菜等植物的研究说明了其抗病性得到了提高。阳离子抗菌肽是80年代初发现的对细菌和部分真菌具有广谱抗性的一类短肽，具有很强的杀菌效果，致死浓度低：0.25-4μg/ml。阳离子抗菌肽的作用机理是通过抗菌肽两性分子的α螺旋或β折叠，改变靶细胞膜的通透性，使靶细胞因内容物泄露而死亡。但是在上述的转基因植株中，都只是单一的转几丁质酶基因或者是转抗菌肽基因或是其它抗性基因，几丁质酶主要是分解植物的细胞壁，抗菌肽主要破坏细胞质，两者各自的作用单一，因而存在抗性不高、抗菌谱窄等缺陷。

本发明的目的在于提供一种把抗真菌的几丁质酶基因(Chi)与抗细菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)容纳在同一个植物表达载体上，让其同时表达、协同作用，同时破坏病菌细胞壁和细胞质以提高转基因植物抗性和广谱性的转基因双价载体。

本发明的具体内容为如图1所示的双价载体，该载体由NoS启动子NoSpro、新酶素基因NPT II、NoS终止子NoSter、增强子序列EH、35S启动子CaMV35Spro、抗菌肽基因CEMA、NoS终止子NoSter、35S启动子CaMV35Spro、苦瓜几丁质酶基因Chi和NoS终止子NoSter依次连接而成，几丁质酶基因Chi和抗菌肽基因CEMA位于同一载体上。该载体依次通过以下步骤得到：图1为本发明示意图

1、苦瓜几丁质酶的克隆

提取苦瓜的mRNA，逆转录为cDNA并利用λgt11做载体，构建其cDNA文库。用来源于玉米的几丁质酶基因作探针，从所构建的cDNA文库中筛选阳性克隆，测序后得到苦瓜的几丁质酶基因，共1103bp。将得到的苦瓜几丁质酶基因做亚克隆，克隆到质粒载体pBluescript IIKS+的Ksp I位点间，命名为pKS-Chi。

2、苦瓜几丁质酶基因表达载体pBChi的构建

pKS-Chi经限制性内切酶Xba I和Sac I消化后，回收1Kb的片段。将pBI121用Xba I和Sac I消化后，回收其中的11.2Kb的载体片段。然后用连接酶将两个片段连接在一起，就得到苦瓜几丁质酶基因的表达载体pBChi。其中苦瓜几丁质酶基因处于CaMV35S启动子和NoS终止子的控制之下。

3、pChima双价载体的构建

将质粒pSUPC4用HindIII和EcoR I消化，回收其中的小片段。再将苦瓜几丁质酶基因的表达载体pBChi用限制性内切酶HindIII消化，然后加入回收的小片段和一个接头用连接酶连接后就得到了此双价载体pBChi。

步骤3中质粒pSUPC4为抗菌肽CEMA基因，是现有技术，来源于天蚕素基因(Cecropin A)和蜂毒素基因(Mellitin)的部分序列，共28个氨基酸。CEMA基因位于含有一个增强序列的CaMV 35S启动子和NoS终止子之间，并受它们的控制。

图1为pChima双价载体的图谱，其中各符号的意思如下：

LB：T-DNA区左边界  CaMV35Spro：35S启动子

RB：T-DNA区右边界  CEMA：抗菌肽基因

NoSpro：NoS启动子  Chi：苦瓜几丁质酶基因

NPTII：新酶素基因  HindIII、EcoR I：限制性

NoSter：NoS终止子  内切酶

EH：增强子序列

本发明的优点在于，由于把抗真菌的几丁质酶基因(Chi)与抗细菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)共同容纳在同一个植物表达载体上，pChima双价载体可使寄主植物同时产生几丁酶和抗菌肽，几丁酶分解真菌细胞壁，使真菌细胞膜暴露于阳离子抗菌肽的作用之下，两者协同作用，破坏病菌细胞壁和细胞质，因而大大提高了转基因植物的抗性和广谱性。该载体既可用于水稻、小麦、玉米、甘蔗等单子叶作物，也可用于棉花、油菜、大豆、花生等双子叶作物，还可用于蔬菜、园艺、林业等方面。

实施例：

1、提取苦瓜的mRNA，逆转录为cDNA并利用λgt11做载体，构建其cDNA文库。用来源于玉米的几丁质酶基因作探针，从所构建的cDNA文库中筛选阳性克隆，测序后得到苦瓜的几丁质酶基因，共1103bp。将得到的苦瓜几丁质酶基因做亚克隆，克隆到质粒载体pBluescript II KS+的Ksp1位点间，命名为pKS-Chi。

2、pKS-Chi经限制性内切酶Xba I和Sac I消化后，回收1Kb的片段。将pBI121用Xba I和Sac I消化后，回收其中的11.2Kb的载体片段。然后用连接酶将两个片段连接在一起，就得到苦瓜几丁质酶基因的表达载体pBChi。其中苦瓜几丁质酶基因处于CaMV35S启动子和NoS终止子的控制之下。

3、将抗菌肽CEMA基因质粒pSUPC4用HindIII和EcoRI消化，回收其中的小片段。再将苦瓜几丁酶基因的表达载体pBChi用限制性内切酶HindIII消化，然后加入回收的小片段和一个接头用连接酶连接后就得到了此双价载体pBChi。