蛋白质分离方法中糖的酶促降解

摘要

本发明涉及从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法。更具体地说,本发明提供了一种用于从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法,该方法包括以下步骤:使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用,由此获得包含蛋白质和水解的糖类的混合物;并且对步骤(i)的混合物进行分离处理,以使蛋白质与水解的糖类分离。

说明书

                    技术领域

本发明涉及从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法。更具体地说，本发明提供了一种用于从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用，由此获得包含蛋白质和水解的糖类的混合物；并且对步骤(ⅰ)的混合物进行分离处理，以使蛋白质与水解的糖类分离。

                        现有技术

蛋白质分离物是未水解的天然蛋白质的产物，其是从蛋白质源(通常是含蛋白质的植物源)分离蛋白质获得的。蛋白质分离物也被称作蛋白质浓缩物或者纯化的蛋白质产物。蛋白质分离物具有各种工业用途，主要在食物工业中，例如，用作人和动物营养品，尤其是用作人类婴儿和幼小动物的产品。

通过利用各种碳氢化合物特异性酶产生蛋白质分离物的方法已有描述。US4,478,856描述了一种用于产生纯化的植物蛋白质的方法，US3,958,015描述了一种用于浓缩大豆蛋白质的方法。

蛋白质分离物也可以通过结合采用水抽提和膜分离技术产生。这样的方法由例如Lawhon等[参见，例如Lawhon J T,Rhee KC＆LusasE W；美国油料化学家学会杂志，1981 58(3)377-384；和Lawhon JT,Manak L J,Rhee K C,Rhee K S＆Lusas E W；食物科学杂志，1981 46 (3)912-916+919]进行了描述。此外，US 4,420,425和US 5,086,166描述了加工油料种子的方法，该方法包括增溶蛋白质，并利用超滤膜分离蛋白质组分。

通过利用膜分离技术，蛋白质从伴随副产物(特别是多糖)得到回收。

通过组合糖降解酶的作用与分离技术产生蛋白质分离物的方法从来没有人描述过。

                      发明概要

按照本发明，现在已经发现，如果含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用，则通过分离技术分离植物蛋白质的过程会更有效，并且产生质量得到改善的产品。

因此，本发明提供了一种从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：

(ⅰ)使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用，由此获得包含蛋白质和水解的糖类的混合物；并且

(ⅱ)对步骤(ⅰ)的混合物进行分离处理，以使蛋白质与水解的糖类分离。

                        发明详述

本发明提供了从含蛋白质的植物材料分离蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用，由此获得包含蛋白质和水解的糖类的混合物；并且对所说的混合物进行分离处理，以使蛋白质与水解的糖类分离。

通过添加糖降解酶，伴随的多糖(其构成副产物的大多数)被水解成更小的片段，由此增加了主产物(蛋白质)和副产物之间的大小区别。因此，按照本发明的酶处理步骤增加了分离步骤的效率。在分离步骤中，具有更高干物质含量的溶液可以被处理，同时产品的质量得到改善，特别是就纯度和感官性质(即没有不受欢迎的味道、气味及颜色)而言。蛋白质分离物

本发明的方法的产物通常称作蛋白质分离物，蛋白质浓缩物或者纯化的蛋白质产物。蛋白质基本上是天然蛋白质，处理期间还没有被水解，它们也不是酶促修饰的蛋白质。

由本发明的方法获得的蛋白质分离物的干物质含量的80％以上(重量)由蛋白质构成，优选地，90％以上(重量)由蛋白质构成。

由本发明的方法分离的蛋白质对掺入进食物产品来说特别有用。含蛋白质的植物材料

用于本发明的方法的含蛋白质的植物材料可以是任何植物来源的包含蛋白质的材料，以及从它们产生的材料。含蛋白质的植物材料优选地是谷类，玉米，稻米，高粱，小麦，大豆，蚕豆，豇豆，木薯，芝麻，花生，豌豆，棉花，油料种子，以及薯蓣属植物。含蛋白质的植物材料可以来自植物源或者植物材料，例如通过磨碎，粉碎或研磨获得的，如面粉，脱脂大豆或豆瓣。

含蛋白质的植物材料优选地是基本上无纤维的。糖类降解酶

本发明的方法包括使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用。

在一个优选的实施方案中，用于所说的方法的一种或多种酶是糖苷酶(EC 3.2)。

在一个更优选的实施方案中，用于所说的方法的一种或多种酶是淀粉酶，特别是α-淀粉酶或β-淀粉酶、阿糖酶、呋喃阿糖苷酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶、果胶裂合酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶和/或葡糖醛酸糖苷酶。

为了获得天然蛋白质的分离物，酶制剂应该实质上没有蛋白水解酶，因为这些酶会降解所讨论的蛋白质，由此将其转变成修饰的蛋白质。微生物来源

本发明的糖苷酶可以从任何已知来源获得。糖苷酶优选地可以从微生物来源获得，所说的微生物特别是丝状真菌或者酵母，以及细菌。

具体地说，淀粉酶可以来自顶孢霉属的菌株，产碱菌属的菌株(特别是广泛产碱菌)，曲霉属的菌株(特别是Aspergillus kawachii和米曲霉)，芽孢杆菌属的菌株(特别是解淀粉芽孢杆菌，地衣型芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌以及嗜热脂肪芽孢杆菌)，硫还原球菌属的菌株(特别是粘硫还原球菌)，闪烁杆菌属的菌株，乳酸杆菌的菌株，微球菌属的菌株，假单胞菌属的菌株(特别是淀粉皮假单胞菌)，热球菌属的菌株(特别是激烈热球菌和沃氏热球菌)，热网菌属的菌株，硫化叶菌属的菌株，葡萄嗜热菌属的菌株，或者热球菌属的菌株。

阿聚糖酶可以来自棘孢曲霉的菌株。

半乳聚糖酶可以来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉)，腐质霉属的菌株(特别是Humicola insolens)，毁丝霉属的菌株(特别是Myceliophthora thermophila)，或者Meripilus的菌株(特别是Meripilus giganteuus)。

半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶)可以是细菌来源的，并且来自大肠杆菌的菌株，或芽孢杆菌属的菌株(特别是嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)，或者其可以是真菌来源的，并且来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉，无花果曲霉，黑曲霉和米曲霉)，克雷伯氏菌属的菌株(特别是植生克雷伯氏菌)，脉孢菌属的菌株，或根霉属的菌株，或者其可以来自酵母，优选地是酵母属的菌株(特别是酿酒酵母和油脂酵母)。

聚半乳糖醛酸酶可以来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉和黑曲霉)，或欧文氏菌属的菌株(特别是胡萝卜软腐欧文氏菌)。

果胶甲基酯酶可以来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉)。

鼠李糖半乳糖醛酸酶可以来自曲霉属的菌株，特别是棘孢曲霉，日本曲霉的菌株，以及耙菌属的菌株(特别是乳白耙菌)。

鼠李糖半乳糖醛酸乙酰基酯酶可以来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉)。

木聚糖酶可以是真菌来源的，并且可以来自曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉，泡盛曲霉，Aspergillus kawachii，构巢曲霉，黑曲霉以及塔宾曲霉)，短梗霉属的菌株，毛壳菌属的菌株(特别是细丽毛壳)，旋孢腔菌属的菌株(特别是Cochliobolus carbonum)，Disporotrichum的菌株(特别是Disporotrichumdimorphosporum)，腐质霉属的菌株(特别是Humicola insolens)，Neocallimastix的菌株(特别是Neocallimastix patriciarum)，Orpinomyces sp.的菌株，青霉属的菌株(特别是微紫青霉)，Thermomyces的菌株(特别是Thermomyces lanuginosus(别名Humicola lanuginosa))，或木霉属的菌株(特别是Trichodermalongibrachiatum和Trichoderma resii)，或者其是细菌来源的，并且可以来自芽孢杆菌属的菌株(特别是环状芽孢杆菌，短小芽胞杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，以及枯草芽孢杆菌)，纤维单胞菌属的菌株(特别是粪肥纤维单胞菌)，梭菌属的菌株(特别是热纤梭菌)，网球菌属的菌株(特别是嗜热网球菌)，小四孢菌属的菌株(特别是柔曲小四孢菌)，链霉菌属的菌株(特别是浅青紫链霉菌)，以及产橄榄色链霉菌，或高温单孢菌属的菌株，或者其可以是酵母来源的，并且可以来自短梗霉属的菌株。

纤维素酶可以来自Bacterioides的菌株，纤维单胞菌属的菌株(特别是粪肥纤维单胞菌)，梭菌属的菌株(特别是热纤梭菌)，欧文氏菌属的菌株(特别是Erwinia chrysanthermis)，镰孢菌属的菌株(特别是尖镰孢)，腐质霉属的菌株(特别是Humicola insolens和Humicola lanuginosa(别名Thermomyces lanuginosus)，小双孢菌属的菌株(特别是双孢小双孢菌)，毁丝霉属的菌株(特别是Myceliopthora thermophile),Neocallimastix的菌株(特别是Neocallimastix frontalis),Piromonas的菌株(特别是Piromonascommunis)，假单胞菌属的菌株，三毛孢属的菌株，瘤胃球菌属的菌株，Sphaeromonas的菌株(特别是Sphaeromonas communis)，木霉属的菌株(特别是绿色木霉，Trichoderma reesei和康宁木霉)，或Thermonospora的菌株。

在一个更优选的实施方案中，使用了一种包含多种酶活性的酶制剂，例如由Humicola insolens的菌株产生的多活性β-葡聚糖酶制剂。这样一种制剂以商品名Ultraflo^TM出售，其是由Humicolainsolens产生的多活性β-葡聚糖酶制剂，可以从丹麦的Novo NordiskA/S获得。

在另一个更优选的实施方案中，采用了一种含有宽范围的糖酶的多酶复合物，所说的糖酶包括从曲霉属获得的阿聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，半纤维素酶以及木聚糖酶。这样一种制剂以商品名Viscozyme^TM出售，可以从丹麦的Novo Nordisk A/S获得。

在另一个更优选的实施方案中，采用了一种由Trichodermareesei的深层发酵获得的酶制剂。这样一种制剂以商品名Celluclast^TM出售，可以从丹麦的Novo Nordisk A/S获得。工艺操作条件和设备

本发明的方法包括步骤(ⅰ)：使含蛋白质的植物材料受到一种或多种糖类降解酶的作用，由此获得包含蛋白质和水解的糖类的混合物；和步骤(ⅱ)：对步骤(ⅰ)的混合物进行分离处理，以使蛋白质与水解的糖类分离。

步骤(ⅰ)和步骤(ⅱ)可以作为两个连续的步骤进行，或它们可以同时完成。本发明的方法也可以作为批量处理或持续的过程实施。如果本发明的方法作为持续的过程实施，则步骤(ⅰ)和步骤(ⅱ)优选地是同时进行。

本发明的方法可以如本领域中所描述的[参见例如Olsen H S；通过抽提，离心，超滤和喷雾干燥连续中试生产大豆蛋白质；Lebensm.Wiss.u.Technol.1978 11 57-64；和Olsen H S＆Adler-NissenJ；在酶促修饰蛋白质的生产期间应用超滤和超过滤方法；美国化学会专题研讨系列，1981 154(10)133-169]。

分离处理可以利用任何方便的分离技术完成，特别是膜分离技术，如超滤，渗滤，微量过滤，毫微量过滤，超过滤等。

可以利用具有适于所讨论的蛋白质的截断值的膜完成膜分离。对于许多场合的使用而言，所说的膜可以具有约2,000到约200,000的理论分子量截断值，更优选的是约5,000到约150,000，最优选的是约70,000到约100,000。

如果步骤(ⅰ)已经完成，则步骤(ⅱ)的pH值可以在从约4到约9的范围内，温度可以在约5到约65℃的范围内，优选地在约50到约65℃的范围内。如果步骤(ⅰ)和(ⅱ)同时进行，则pH和温度必须适合步骤(ⅰ)中使用的糖降解酶的需要。

本发明的方法可以采用常规用于降解糖类的剂量的糖降解酶完成。现在预期，在约0.1％到约10％w/w干物质组合物的酶蛋白质是合适的。工业实用性

由本发明的方法获得的蛋白质分离物可以具有各种工业实用性。所说的蛋白质分离物用作人和动物营养品，尤其是用作人类婴儿和幼小动物的产品特别有用。

因此，另一方面，本发明提供了包含由本发明的方法获得的蛋白质分离物的食物产品。

                         实施例

以下列实施例进一步说明本发明，这些实施例无意于以任何方式限制所要求的本发明的范围。

                         实施例1

                   制备大豆蛋白质分离物

在55℃下，将55kg具有高NSI(大于70)的脱脂大豆蛋白质(来源于Loders Crooklaan的Unisoy^TM 800)加入到305 kg水中。在20分钟期间用NaOH将pH值调节至8.5。

通过离心对混合物进行分离(沉淀物：上清液=60∶40)。向沉淀物中添加水至初始体积，并再次分离。

向两种上清液(420升，7.4 Brix)中加入2％Ultraflo^TM(来自丹麦的Novo Nordisk A/S)，基于Brix干物质=621g(Ultraflo^TM是一种多活性β-葡聚糖酶制剂，由一种选择的Humicola insolens的菌株产生，其中占优势的活性是纤维素酶，木聚糖酶，戊聚糖酶以及阿聚糖酶活性)。

对混合物进行超滤(包括渗滤)。所利用的设备是安装有FC 100膜(具有100,000的理论分子量截断值)的PCI Membrane Systems^TM。在12-13 Brix下进行浓缩和渗滤。

闪烁处理和喷雾干燥(Tin=200C,Tout=80C)。

终产物是大豆蛋白质分离物，具有超过90％w/w的干固体蛋白质，具有很高的溶解性和良好的感官性质。

                  实施例2

            制备大豆蛋白质分离物

在62-63℃的温度下，将在pH6.5下具有55％的PSI的非烘烤脱脂大豆粉与水混合至10％干物质含量。用4N NaOH将浆状物的pH值调节至8.5。

加入基于干物质的2％的Ultraflo^TM(Ultraflo^TM是一种多活性β-葡聚糖酶制剂，由一种选择的Humicola insolens的菌株产生，其中占优势的活性是纤维素酶，木聚糖酶，戊聚糖酶以及阿聚糖酶活性)。在保持30分钟后，通过两个离心步骤从浆状物提取可溶性蛋白质，由此得到约90％的提取效率。

在第一次离心之后，仍然在62-63℃下用去离子水再次稀释沉淀物，进行第二次离心步骤，此后弃去浆状物。

用加料槽收集两次离心的离心液至第一个超滤单元中。

优选的是，在混合、抽提和超滤1期间，处理液体的温度保持在60℃以上，以限制细菌生长，在混合和抽提期间温度也保持在64-65℃以下，以阻止蛋白质变性，颜色过深和感官性质下降。

超滤离心液，以从蛋白质抽提物中洗去糖类和盐。浓缩离心液至最多5.5％DS，添加去离子水渗透，直到

    ％DS(渗透物)/％DS(渗余物)=0.09

然后，浓缩渗余物至9-10％DS。弃去渗透物。

于125℃下用巴氏法灭菌渗余物3-4秒，以降低产物中的细菌计数。

浓缩液体，并于55℃在PCI Membrane Systems的AFC 30膜上经毫微量过滤脱盐。假如低渗透性是所需的，可以在最终浓缩前进行添加去离子水的渗滤。

由于低的通量，在30° Brix时，终止毫微量过滤。

喷雾-干燥蛋白质分离物，并且在Tin 200℃下聚结。喷雾-干燥过的粉末中的含水量最好是在6.5％以下，以达到粉末的满意的稳定性。