用于治疗变态反应疾病的基于肽的免疫治疗剂

摘要

本发明提供了通过将由不同过敏原分子诱导来的T细胞表位区相互连结所制备的单分子多表位肽。含有有效量的多表位肽的基于肽的免疫治疗试剂可以预防和治疗广泛范围的过敏疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多表位肽，该肽可用于对变态反应疾病的基于肽的免疫治疗方法。

背景技术

将变态反应疾病定义为Ⅰ型超敏感(IgE抗体传导的Ⅰ型免疫应答)引起的功能性紊乱或一种由该紊乱诱导的疾病。症状包括花粉病、支气管哮喘、过敏性鼻炎、变应性皮炎、过敏性休克。花粉病是代表性的变态反应疾病。在日本，约10％的人患有雪松花粉过敏，而且患者的人数还在增加。在美国，5到15％的人患有短豚草花粉过敏。花粉过敏在社会和经济上都是严重的问题，因为患者很多并且他们承受着不能忍受的症状如眼睛发痒，流涕，打喷嚏，鼻塞。而且，一旦患者得了花粉病，该病每年都要发生。因此，已有人认真地探索了花粉病的有效治疗方法。

为了理解和治疗过敏病病，重要的是理解Ⅰ型过敏应答是怎样发展而成的。目前的研究重点在阐明变应原特异性的免疫应答中的起始反应，特别是调节T-细胞介导的过敏反应的机制。引发对外源抗原的免疫应答包括在免疫系统中的依赖于抗原呈递细胞的变态反应原。抗原呈递细胞(即B细胞，巨噬细胞，和树突状细胞)接受进入，将它们断裂成抗原肽(T细胞表位肽)，把该片段放入含有主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子(人的Ⅱ类HLA)的α和β链的袋中，把片段暴露于细胞表面，从而把外源抗原呈递给特异于抗原特异性的CD 4阳性辅助T细胞(Th细胞)。一个HLAⅡ类分子由DR,DQ和DP分子组成。HLA-DRA基因编码DR分子的α(链，HLA-DRB1,-DRB3,DRB4或-DRB5基因编码其β链。HLA-DQA1基因编码DQ分子的α链，HLA-DQB1基因编码其β链。HLA-DPA1基因编码DP分子的α链，HLA-DPB1基因编码其β链。除了HLA-DRA，每个基因都含有许多等位基因。抗原肽所放置的袋是高度多态性的，而且相互的结构有轻微的区别。正因为如此，与袋结合并呈递给T细胞的抗原肽的种类限于那种结构。

一旦Th细胞通过T细胞受体(TCR)接受HLAⅡ类限制性抗原信息，它们被激活后可分泌各种细胞因子，由此它们发生自身增殖。同时，Th细胞诱导B细胞分化成等浆细胞以诱导抗体的产生。根据产生细胞因子的方式的差别，将抗原刺激激活的Th细胞分类成能产生干扰素2(IL-2)，干扰素γ(IFN-γ)和淋巴毒素(TNF-β)的Th1细胞；能产生IL-4,IL-5,IL-6,IL-10和IL-13的Th2细胞；和能产生两种细胞因子的Th0细胞。IL-4和IL-13促进引起变态反应的IgE抗体的产生，但受到IFN-γ的抑制。那就是，Th1细胞抑制IgE的产生，而Th2细胞促进IgE的产生。换句话说，即变态反应的致敏作用取决于在接触抗原是Th1细胞还是Th2细胞发生作用。通常我们知道Th2细胞优先在具有变态反应的患者中起作用。变态反应原特异性的IgE抗体附着于外周的嗜碱性细胞和组织肥大细胞。随后的变态反应原的接触导致IgE抗体通过变态反应原交叉连接到嗜碱细胞或肥大细胞上。这释放炎症淋巴因子包括组胺，前列腺素，白细胞三烯，从而引起直接变态反应。对这些炎症淋巴因子进行应答，淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞，和嗜酸性细胞将聚集于组织的炎症区并导致淋巴因子的释放，引起包括紊乱和后期反应的各种反应。

一个通过抗原特异性的抑制IgE抗体产生的治疗某种变态反应的方法是利用变态反应原蛋白分子的致敏作用治疗方法。致敏作用治疗方法可以提供化学治疗不能提供的长期效果，所以，它是唯一的接近于有效治疗的治疗方法。但是，致敏作用治疗方法并不常被作为治疗变态反应的一般方法，这可能是因为它的机制和可能的副作用(如局部肿胀或过敏性休克)仍然未知。

除致敏作用治疗方法之外，已经有人提出了利用含有T细胞表位的肽抗原的致敏作用机制。用于这一治疗方法的变态反应原分子上的携带T细胞表位的肽片段不含有B细胞表位，如果有也只是单价的以致肽不能交叉连接到与肥大细胞有高亲和性的IgE受体上。由于这些原因，用该肽片段给药的患者将不会产生副作用如过敏性休克。而且已知当体内给T细胞表位时，T细胞被抗原特异性地失活(变态反应)(La Salle J.M.等：J.Exp.Med.176:177-186,1992)。据报道，根据这样的理论基础，在实验用鼠模型中进行利用携带猫头皮屑变态反应原Feld1的主要T细胞表位的肽的致敏作用，在体外诱导了T细胞变态反应(Briner,T.J.等，美国自然科学学术进程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),90:7608-7612,1994)。利用该肽的致敏作用的临床试验正在进行(Norman,PS.等：Am.J.Respir.Crit.Care Med.154:1623-1628,1996；Simons,F.E.等：Int.Immunol.8:1937-1945,1996)。利用这种在变应原分子上携有主要T细胞表位的肽的致敏作用治疗方法称为“基于肽的免疫治疗”(或“基于肽的致敏作用治疗”)。

作为用于选择适用于基于肽的免疫治疗法的T细胞表位肽的标准，WO94/01560提出了一个阳性指数(出现频率乘以平均T细胞刺激指数)。另据报道，在肽设计中，应该覆盖患者群体中HLA单模式(haplotypic)的变异(Wallner,B.P.和Gefter ML：变态反应(Allergy),49:302-308,1994)。

本发明的公开

通常，对于互不相同的两个或更多的变态反应原分子中的每一个，变态反应患者都具有特异的IgE抗体。对于有效的变态反应治疗，开发有效地用于这些患者的基于肽的免疫治疗试剂是重要的。但是，还没有开发出这样一个免疫治疗试剂。甚至在上面的任何文献中仍没有公开有关这种试剂的想法。因此，本发明的一个目的是提供甚至对两个或更多不同变态反应原敏感的过敏性患者有效的基于肽的免疫治疗试剂。

雪松花粉含有两个主要的变态反应原，Cryj1(Yasueda,H.等：过敏性临床免疫反应杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)。71:77-86,1983)和Cryj2(Taniai,M.等：FEBS通信(FEBS Letter)239:329-322,1988；Sakaguchi,M等：变态反应(Allergy)45:309-312,1990)。超过90％的带有雪松花粉过敏的患者具有对Cryj1和Cryj2特异的IgE抗体；其余患者(稍少于10％)具有或对Cryj1或Cryj2的特异IgE抗体(Hashimoto,M.等：Clin.Exp.Allergy25:848-852,1995)。预期使用仅来自Cryj1和Cryj2中某一个的一个或多个T细胞表位效力更小，因为来自患者的IgE与Cryj1和Cryj2都反应。所以，应该选择同时来自Cryj1和Cryj2的T细胞表位以提高用于雪松花粉过敏的基于肽的免疫治疗法的效力。所以，本发明制备了在同一分子中同时含有Cryj1和Cryj2的T细胞表位的多表位肽。他们发现多表位肽在体外激活患花粉病的患者的T细胞，但不与患者的IgE抗体反应。他们也发现在鼠体内可诱导免疫应答。根据这些新发现，本发明人发现本发明的多表位肽能有效地作为用于雪松花粉病患者的基于肽的免疫治疗试剂。

雪松花粉病的许多情况中显示了日本柏花粉的临床症状。从这一点和基于上述发明来看，本发明人制备了在同一分子中含有日本柏花粉过敏原Chao1的T细胞表位(日本专利申请号.Hei8-153527)和雪松花粉过敏原Cryj1的T细胞表位的多表位肽。多表位肽激活患雪松花粉病的患者和具有日本丝柏花粉病的患者的T细胞，尽管这些T细胞不与各个T细胞表位反应。所以，不仅对于起源于雪松和日本柏花粉过敏原，而且起源于其它过敏原的T细胞表位都可以设计多表位肽。

在一组患者(包括不同种族)中研究HLA单模式作为判据用于选择T细胞表位以便设计对广泛范围的患者有效的多表位。选择T细胞表位表明应该选择与其单模式经常在人群中出现和在不同的Ⅱ型HLA分子中出现的HLA结合的那些表位，而不是与相同的HLAⅡ型分子结合的那些。这样选定的多表位肽被确定可有效地用于广泛范围的患者。

本发明包括在各个权利要求中描述的发明。

下面将描述本发明所设计的对雪松花粉或日本柏花粉敏感的患者或对两种花粉都敏感的患者有效的多表位肽，但本发明也适用于对其它过敏原敏感的患者。本发明的技术原理也适用于植物花粉如短豚草(Amb a1,Amb a2,Amb a5,Ambt5,Amb p5)，鸭茅(Dac g2)，和Lolium perenne(Lol p1,Lol p2,Lolp3)；三种花粉如欧洲桤木(Alng1)，疣皮桦(Bet v1,Bet v2)，高山雪松(Juns1)，和圆柏树(Jun vl)；以及各种其它本文没有特别说明的过敏原。

本文所用的“多表位肽”指通过线性联合含有由不同过敏原分子(有时指抗原肽或少数情况下指肽)诱导的T细胞表位的肽制备的肽分子。在这一肽中，优选将体内切割的区域插入在含有T细胞表位的肽之间以便减少新识别的表位位点的出现。最后在切割位点将多表位肽断裂或各个抗原肽。当给药时，它能表现出相当于用这些各个抗原肽混合物给药时的效果。只要它在体内进行切割，切割位点可以采取任何结构。切割位点的例子包括作为组织蛋白酶B识别序列的精氨酸二聚体和赖氨酸二聚体，组织蛋白酶B是定位于溶酶体中的酶。

参考作为实施例的雪松花粉过敏原Cryj1和Cryj2将叙述根据本发明多表位肽的设计。

利用Cryj1或Cryj2刺激从患雪松花粉病的患者收集的外周淋巴细胞以便生产用于单个患者的T细胞系。用约由15个氨基酸组成的重叠肽刺激所诱导的T细胞系以鉴定在Cryj1或Cryj2序列中含有T细胞表位的抗原肽(图1和2)，该肽覆盖Cryj1(WO94/01560)或Cryj2的一级结构的全长(Komiyama,N.等人：(Biochem.Biophys.Res.Cammun)生化生理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)201:1201,1994)。

其次，把这些抗原肽结合的HLAⅡ类分子进行分类。

在人中，存在作为Ⅱ类HLA的基因产物的三个不同分子，DR,DQ和DP区。这表明抗原呈递分子DR,DQ，和DP将限制T细胞的分化。利用对每个患者建立的T细胞克隆确定究竟是通过哪个出现座位起源的抗原分子来呈递Cryj1或Cryj2的抗原肽。他们同时确定是否通过DR,DQ或DP分子接受抗原肽信息的T细胞趋向于分化成Th1细胞或Th2细胞。利用对于单个患者确立的T细胞克隆进行了这样的分类(图3和4)。

图3和4明确表明了HLA分子的特定表位或特定组合不限制由抗原肽刺激产生的T细胞分化成Th1或Th2还是Th0。在选择用于设计本发明的多表位肽的肽时，任何肽都可以作为抗原肽的候选物，因为任何含有T细胞表位的肽都可以刺激T细胞。

设计本发明的多表位肽的选肽原则如下：

(1)以阳性指数的顺序选择肽(WO94/01560)(应该选择阳性指数在100以上的肽)。

(2)选择在经常作为抗原呈递分子HLAⅡ类分子上呈递的肽。

(3)当阳性指数没有显著差异时，选择不同类型的限制分子呈递的肽以便增强效果。具体地说，在选择引起某些过敏疾病的过敏原的T细胞表位时，首先应检查在具有变态反应的患者的组中的HLA单模式，并选择HLA单模式限制的T细胞表位，该HLA单模式在患者组所属的人群中具高基因频率。即最好的选择在该患者群中才能达到最好效果。但是，在其他患者组中，这样选定的T细胞表位可能是完全无效的。

将HLA单模式DPB1^*0501作为一个例子，据信在具有某些过敏疾病的日本患者中经常观察到该HLA单模式，选择限制HLA单模式的T细胞表位。对于具有同样的变态反应的北美患者这样选定的肽几乎没有效果，因为HLA单模式的基因频率在日本患者中有39.0％之多，而在北美的白种美国人中少至1.3％，在非洲裔美国人中少至0.8％。对于北美患者，应该选择限制的HLA-DPT细胞表位DPB1^*0401(在北美，对于白种美国患者为30.2％，对于非洲裔美国患者为11.1％，日本患者为4.8％)。同时选择在座位水平有区别的抗原呈递分子象DR，DQ或DP呈递的肽也是重要的；即使座位是相同的，选择具有不同单模式的抗原呈递分子呈递的肽也是重要的。

在这种情况下，优选的表位位点不含有半胱氨酸残基。当表位位点含有半胱氨酸残基时，该残基可以非特异地与HLAⅡ类分子结合。当用含有半胱氨酸残基的抗原肽免疫时，原来并非抗原的位点可能被识别为新的表位。当这样的肽被识别为表位时，通过第二和第三次重复给药会使该肽识别含有半胱氨酸的表位，而这种给药可能引起副作用。

下面将叙述设计多表位的具体实施方案。根据图1和2显示的Cryj1和Cryj2的阳性指数，Cryj1的T细胞表位，具有位置211-225的氨基酸的表位NO.43(本文下面缩写为P211-225)(限制分子DPA1^*0101到DPB1^*0501)显示最高的阳性指数，肽NO.22,P106-120(限制分子DRB 5^*0101)显示次高的阳性指数。选这两个肽作为用于多表位肽的抗原肽。对于Cryj2,肽NO.14,P66-80(限制分子DRB5^*0101)和肽NO.38,P186-190(DRB4^*0101)显示最大的阳性指数。同样，这两个肽可选为抗原肽。定位在Cryj2中的肽NO.38之前的肽NO.37,P181-195具有高的阳性指数280，但它的限制分子是DPA1^*0101到DPB1^*0201，它区别于肽NO.38的限制分子，因为通过在NO.38前面加上来自NO.37的10残基，5残基，肽NO.38,P181-165与肽NO.38,P186-200可重叠。可以选择这样设计的肽作为HLA-DP限制肽。如上面选择的肽不限制DQ。Cryj1的肽NO.4,P16-30的限制分子是DQA 1^*0102到DQB1^*0602，但表位中心有半胱氨酸残基。所以，不能选择肽NO.4。在Cryj2中，对应于肽NOs.69-70的P341-360是出现在DQA1^*0102到DQB1^*0602上的肽。肽NO.70也含有半胱氨酸，而只有无半胱氨酸的肽NO.69能激活T细胞。所以，可以选择12个残基，P344-355(ISLKLTSGKIAS)。Cryj1肽NO.22,P106-120在位置107含有半胱氨酸。利用T细胞克隆确定T细N胞表位核心序列至少需要九个残基P106-117(FIKRVSNVI)。所以，如果除去Pro-Cys残基，可以使用余下的肽。

在溶酶体中将吸收于抗原呈递细胞中的抗原降解。吸收于出现抗原的分子中的外源蛋白质如何加工以及他们如何与HLAⅡ类分子结合仍然未知。但是，据报道，在这一复杂的机制中组织蛋白酶B参与了抗原的消化(Katsunuma,N:Nihon Men-Eki Gakkai(日本免疫协会)24:75,1995)。

关于几个Ⅱ类HLA类型，已经确定了抗原肽的结合HLA的氨基酸基序(motif)。HLAⅡ类分子的结合有特异性，但如果肽符合某些标准，许多抗原肽都可以与特定的HLAⅡ类分子结合(Rammensee,HG.等，免疫遗传学(Immunogenetics)41:178-228,1995)。由于这一原因，在结合抗原肽的位点可能会产生新识别的表位位点。为了避免这一点，应该设计多表位肽以便在抗原呈递细胞中切割成各个抗原肽。组织蛋白酶B识别的肽序列是Arg-Arg-疏水序列或Lys-Lys-疏水序列。所以，将Arg-Arg或Lys-Lys加到含有表位的肽的后半部分并且在下面的表位序列中，将疏水氨基酸序列放在Arg-Arg或Lys-Lys之后。

由于Arg-Arg是插入在抗原肽之间的，所以认为在这一实施方案中抗原肽的顺序是没有影响的。但当Arg与Cryj2的肽NO.14的后半部分连接时(图2)，位置73的Tyr变成第一个锚。加入的Arg残基变成在DRB 5^*0101肽基序中在第9位上的氨基酸残基并作为第二个锚。所以，Arg可以作为新的表位识别。因此，这一序列应该定位于多表位肽的末端。

SEQ NO:1显示了如此得到的多表位肽。这一多表位肽的限制分子是DRB4^*0101,DRB5^*0101,DPA1^*0101-DPB1^*0201,DPA1^*0101-DPB1^*0501，和DQA1^*0102-DQB1^*0602。在第11次国际组织相容性研讨会上，计算了日本人口中这些基因的频率(Tsuji,K.等人：HLA 1991，第1卷，1992,牛津大学出版社)并发现对于DRB4^*0101基因频率为0.291，对于DRB5^*0101为0.056(对于DRB5^*0102为0.070),DPB1^*0201为0.208，对于DPB1^*0501为0.399，和对于DQB1^*0602为0.053(对于DQB1^*0601为0.204)。根据这些数据，计算出抗原频率，对于DRB4^*0101抗原频率为0.50，对于DRB5^* 0101为0.11(对于DRB5^*0102为0.14)，对DPB1^*0201为0.37，对于DPB1^*0501为0.64(按照Hori等人为0.791)，以及对于DQB1^*0602为0.10)(对于DQB1^*0601为0.37)。因为由于连锁不平衡的出现，认为DRB5^*0101和DQB1^*0602是相同的，可以将DRB5^*0101的数据用于DQB1^*0602。计算得到日本人口中携带DPB1^*0201和DPB1^*0501或任何一个的可能性是0.85。同样，计算得到日本人群中携带DRB4^*0101和DRB5^*0101的可能性是0.56。从这些值来看，估计约90％的患者识别包含在SEQ NO:1中的多表位肽中一个以上的T细胞表位。但是，还不清楚是否具有这些HLA型的患者具有能够识别这些限制分子呈递的这些表位肽的T细胞贮藏物(repertory)。另外，引起T细胞增殖的表位的数目还是未知(将需要两个或更多的表位)。所以，多表位的效率可能会被降低。在实践中，根据来自17例患者的外周淋巴细胞的测试增殖反应的结果，将它假定为约77％是恰当的。

为了增大有效治疗的患者的范围，也可以将多表位肽设计成比上面叙述的表位肽携带更多的T细胞表位。这样的多表位肽的实施例包括通过组合Cryj1的P213-225和P108-120,Cryj2的P182-200和P79-98，Cryj1的P80-95，和Cryj1的P66-80以这一顺序(SEQ NO:2)所制备的一个，和通过联合Cryj1的P213-225和P108-120,Cryj2的P182-200和P79-98,Cryj1的P67-95，和Cryj2的P238-251及P66-80，以这一顺序(SEQ NO:3)所制备的一个。这些多表位肽作为基于肽的免疫治疗试剂是有效的，因为该肽刺激来自患雪松花粉病的21个测试患者的所有外周淋巴细胞样品但不与患者的IgE抗体反应。根据这一原理，通过用实施例13叙述的方法制备的含有不同种类的过敏原如日本柏花粉过敏原和雪松花粉过敏原的T细胞表位可以提高效率。

本发明还包括用于调节T细胞活性的多表位肽的抗原肽区域的修饰。用于本文的“修饰”指至少一个氨基酸残基的取代、缺失、和插入。通过已知方法可以检测在抗原肽中氨基酸以代所导致的T细胞特性的变化。例如，1)用类似氨基酸替代本发明的多表位肽的某些氨基酸，如，通过用Glu替代Asp,Gln替代Asn,Arg替代Lys,Tyr替代Phe,Leu替代Ile,Ala替代Gly,Ser替代Thr，以便产生类似肽，它可以与T细胞中的原始肽就增殖能力或淋巴因子生产能力进行比较。可选择地，2)用非类似氨基酸替代多表位肽的某些氨基酸，例如，通过用疏水氨基酸Ala替代极性氨基酸或亲水氨基酸，用亲水氨基酸Ser替代疏水氨基酸，并将修饰后的肽的特性与原始肽进行比较。本发明同时包括这样制备的多表位肽类似物，他们是阳性指数和T细胞活化能力意义上的本发明的多表位肽的免疫学等价物。

大多数与起源于Cryj1和Cryj2的抗原肽反应的T细胞同时具有Th2和Th0的特性(图3和4)。BCG疫苗可以加强细胞的免疫活性以便防止的感染。为了加强细胞免疫，应该诱导Th1型的T细胞。据报道对用BCG接种的人T细胞克隆的特性的研究表明Th1T型细胞的水平有增加(MatsushitaSho，第45次日本变态反应协会，836,1995)。据Matsushita认为存在受HLA-DR 14(DRB1^*1405)限制并识别BCGa蛋白质的84-100氨基酸序列(EEYLILSARDVLAVVSK)的Th1克隆。如果选择60％的日本人口具有的限制HLA单模式DPA1-DPB1^*1510的T细胞表位(例如，图1显示的Cryj1的肽NO.43(P211-225)/KSMKVTVAFNQFGPN)，该肽与DRB1^*1405限制的tubercle bacillus BCGa蛋白质的第84-100 T细胞表位结合。如此制备的多表位肽EEYLILSARDVLAVVSKRRMK VTVAFNQFGPN对携带单模式DRB1^*1405的患雪松花粉病的患者很有可能是十分有效的。利用这样一个多表位肽将通过一个起源于BCGa抗原诱导产生Th1淋巴因子，特别是IL-12。已知在人和鼠的几种情况中，IL-12具有与IL-4的活性相反的活性并作用于T细胞并诱导Th细胞分化成Th1(Manetti,R.，等人：实验方法杂志(J.Exp.Med.),177,1199-1204,1993；Wu,C.，等人：免疫学杂志(J.Immunol.),151,1938-1949,1993；Hsieh,C.，等人：科学，260,547-549,1993)。特别是，Manetti等人得到的实验结果指出，一种螨过敏原的Der P1抗原特异性的T细胞克隆基本上诱导Th2而存在IL-12时诱导Th1或Th0。所以，利用通过组合具有Th1诱导活性的T细胞表位与过敏原反应的T细胞表位制备的多表位肽，会将本来诱导成Th2的T细胞诱导成Th1或Th0。

将含有至少一种Cryj1和/或Cryj2的T细胞表位的本发明的肽对鼠皮下给药时，然后将鼠与雪松花粉过敏原接触，T细胞发生无变应性(图13和14)与对照组比较，IL-2生产明显减少。据报道致敏作用治疗减少了人体中的IL-2(变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)76:188,1985)。另外，本发明的多表位肽可把各个肽组成的T细胞克隆活化成T细胞表位肽(图10)，但不与患者的IgE抗体反应(图8)。这些结果显示本发明的多表位肽可诱导对过敏原的免疫耐受并且作为基于肽的免疫治疗试剂对变态反应疾病是有效的。本发明的多表位肽可以与可药用的载体或稀释剂一起给药。根据患者的对雪松花粉过敏原的敏感性、年龄、性别和体重和其它因子如肽在患者中诱导免疫应答的能力，多表位肽的有效剂量可以变化。

利用包括注射(皮下或静脉内)、鼻内注射、口服给药、吸入、经皮给药等给药途径以简单的方式将多表位肽给药。

用于本说明书的氨基酸的单字母标志和序列表遵照ILUPAC，生化术语委员会规定的定义(参照生物化学词典(Biochemical Dictionary)，第二版，1468，表1.1)。

附图简要说明

图1表示起源于患雪松花粉病的患者的细胞系对Cryj1重叠肽的平均刺激指数、出现频率、和阳性指数(出现频率乘以平均刺激指数)。

图2表示起源于患雪松花粉病的患者的细胞系对Cryj2重叠肽的平均刺激指数、出现频率、和阳性指数(出现频率乘以平均刺激指数)。

图3显示识别Cryj1抗原肽和HLAⅡ类分子之间的复合物以及Th类型的HLAⅡ类分子的Th类型的T细胞克隆。

图4显示识别Cryj2抗原肽和HLAⅡ类分子之间的复合物以及Th类型的HLAⅡ类分子的Th类型的T细胞克隆。

图5显示鉴定能够与抗原肽在基因座水平结合的HLAⅡ类分子(DR,DQ和DP)的结果。

图6显示鉴定能够在各基因座的等位基因水平结合抗原肽的HLAⅡ类分子的结果。

图7显示用于多表位肽的氨基酸序列。在这一图中，肽a和b分别对应于Cryj1的肽NOS.43和22；肽c对应于Cryj2的NO.14；肽d和e分别对应于肽NOS.37-38(p181-200)和NOs.69-71(P346-365)。

图8显示命名为C.A.#1,C.A.#2,C.A.#3,C.A.#4,C.A.#5和CA.#6的多表位肽与人IgE的反应性。

图9显示T细胞克隆识别包含于多表位肽CA.#4中的T细胞表位的结果。

图10显示对用各种浓度的多表位肽(SEQ NO:1)刺激所诱导的患雪松花粉过敏病的患者和健康受试者的外周淋巴细胞的淋巴细胞增殖应答能力。

图11显示对用多表位肽SEQ NO:1刺激的诱导的两个健康受试者和17个患雪松花粉过敏病的患者的外周淋巴细胞的增殖应答能力。

图12显示将雪松花粉过敏原Cryj1对CBF1鼠给药诱导的免疫耐受性。

图13显示将Cryj2的肽NO.14(P66-80)对CBF1鼠给药诱导的免疫耐受性。

图14显示将Cryj2的肽NO.48(P236-250)对CBF1鼠给药诱导的免疫耐受性。

图15显示Cryj1的肽NO.22(P106-120)的核心氨基酸序列。

图16显示患雪松花粉过敏病的患者和日本扁柏(hinoki)花粉过敏病的患者的T细胞系与通过将雪松花粉特异性的T细胞表位肽与日本柏花粉特异性的T细胞表位肽结合制备的多表位肽的反应性。

图17显示T细胞克隆PJF9对Cryj1#22核心肽的氨基酸替代类似肽的增殖应答和随后产生的细胞因子的量。

图18显示T细胞克隆PB10-18对如上所述的类似肽的增殖应答和随后产生的细胞因子的量。

本发明的最佳实施方式

实施例1

利用T细胞系鉴定Cryj1和Cryj2的T细胞表位

用雪松花粉过敏原Cryj1和Cryj2刺激来自患雪松花粉过敏病的18个患者的淋巴细胞以便建立能够特异地识别相应过敏原的各个患者的T细胞系。

在用0.2毫升的15％的血清补充的RPMI-1640培养基在96孔培养平板上把用丝裂霉素C处理的自体B细胞系的5×10⁴细胞、2微摩尔重叠的肽、和2×10⁴个T细胞系的细胞的混合物温育两天。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸腺嘧啶后，继续温育18小时。在利用细胞收集器在玻璃过滤器上收集细胞后，利用液体闪烁计数器确定细胞中吸收的[³H]胸腺嘧啶的水平。如果刺激指数在2以上，我们认为可将加入的肽识别为抗原肽。刺激指数指用没有肽加入时细胞中吸收的[³H]胸腺嘧啶的水平去除加入肽时细胞中吸收的[³H]胸腺嘧啶的水平得到的值。

对于Cryj1，每个患者识别的Cryj1分子上的T细胞表位的数目平均为9.8，范围在4到15之间。对于Cryj2，T细胞表位的数目平均为8.7，范围为2到13。Cryj1含有353个氨基酸，并且Cryj2含有379个氨基酸。所以，估计每100个氨基酸残基出现2.3到2.8个T细胞表位。

据信每个患者中的HLAⅡ的类型是有变化的。所以推测根据HLAⅡ类型，所识别的T细胞表位将发生变化。由于这一原因，对单个患者所识别的抗原肽图谱定位。结果表明根据患者不同Cryj1和Cryj2分子上的表位有区别。在过敏原分子上，根据个体的不同，存在作为T细胞表位的两个区域，一个是容易识别的区域和几乎不能识别的区域。另外，由于根据T细胞表位的不同，T细胞的增殖速度有变化，单独的表位图谱难以确定应该选择用什么样的抗原肽来设计多表位肽。所以，对显示刺激指数为2以上的抗原肽进一步检测了十八个患者。计算出抗原肽的平均刺激指数并乘以病人携带抗原肽的频率(出现频率)以便计算显示各个表位优势顺序的“阳性指数”(参考WO94/01560)。

图1和2显示了结果。在Cryj1中，肽NO.42(P211-225)显示最高的阳性指数679，接着是次高的肽NO.22，阳性指数为578和肽NO.4，阳性指数为373。在Cryj2中，肽NO.14显示最高的阳性指数(709)。然后接着肽NO.38阳性指数为680，肽NO.48阳性指数为370。可以选择一个具有高阳性指数的抗原肽并用于基于肽的免疫治疗法。但是，即使是对于最高的出现频率，理论上的期望效果只有患者的72％，而真正的效果将更低。为了增大效率，必须使用许多联合的T细胞表位。在这种情况下，选择高阳性指数的T细胞表位作为候选物。但是，如果呈递作为抗原的这些表位的HLAⅡ类分子是相同的，那么使用具有单独高阳性指数的表位不能增大效率。所以必须鉴定呈递T细胞表位肽的HLAⅡ类分子的类型。

实施例2

鉴定T细胞克隆识别的T细胞表位肽

从18个患雪松花粉过敏病的患者中选择两个患者，患者B(PB)和患者J(PJ)，他们识别Cryj1中显示高阳性指数的肽NOs.43和22和三个患者，PB，患者C(PC)，和患者R(PR)，他们识别Cryj2中显示高阳性指数的肽NOs.14,38,48和69。用Cryj1或Cryj2刺激来自这些患雪松花粉过敏病的外周淋巴细胞以便建立能识别Cryj1或Cryj2的T细胞克隆。下面展示了四个患者的HLAⅠ类和HLAⅡ类分子的类型。PB:A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1^*1501/0901-DRB4^*0101-DRB5^*0101,DQA1^*0102/0301-DQB1^*0602/0303-DPA1^*0101/0101-DPB1^*0505/0201；PJ:A24/--B61/51-Cw3/--DRB1^*1501/0802-DRB5^*0101,DQA1^*0102/0401-DQB1^*0602/0402-DPA1^*-/--DPB1^*0505/0402；PC:A-2/2-B54/51-Cw1/-DRB1^*0405/1501-DRB4^*0101-DRB5^*0101-DQA1^*0301/0102-DQB1^*0401/0602-DPA1^*0202/0202-DPB1^*0201/0501；PR:A -11/--B60/35-Cw7/w3-DRB1^*0901/1501-DRB4^*0101-DRB5^*0101-DQA1^*0301/0102-DQB1^*0303/0602-DPA1^*01/0202-DPB1^*0201/0201。

从起源于PB的外周淋巴细胞和14个来自PJ的同样的T细胞克隆建立特异地识别Cryj1的总共35个T细胞克隆。同样，从分别起源于PB,PC和PR的外周淋巴细胞建立特异地识别Cryj2的分别总共31个T细胞克隆，10个T细胞克隆，和17个T细胞克隆。由于这些T细胞克隆都是CD3⁺,CD4⁺,CD8^-,TCRαβ⁺和TCRγδ^-，所以发现限制分子都是HLAⅡ类分子。将前面用丝裂霉素C处理的自5×10⁴个自体B细胞系的细胞，2微摩尔重叠肽，和2×10⁴个T细胞克隆的细胞的混合物在用0.2毫升15％血清补充的RPMI-1640培养基和96孔微型培养平板上温育2天。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸腺嘧啶之后，继续温育18小时，在利用细胞收集器，在玻璃过滤器上收集细胞之后，利用液体闪烁计数器确定吸收于细胞中的[³H]胸腺嘧啶的水平。通过这一过程，鉴定了各个T细胞克隆识别的T细胞表位。

在识别Cryj1的T细胞克隆中，69％(34/49)显示了用肽刺激诱导的增殖应答，而且，作为结果，鉴定了该表位。同样，在识别Cryj2的T细胞克隆中的69％(40/58)可以鉴定抗原肽。能够特异地识别Cryj1的T细胞克隆能识别肽Nos.4,13,19,22,30,31,39,43,51和66，能特异地识别Cryj2的T细胞克隆能识别肽Nos.4,8,14,17,31,38,48,65,66,68,69和70。图3和4概括了这些结果。

实施例3

在基因座水平鉴定HLAⅡ类限制分子

通过在实施例2中建立的T细胞克隆的增殖应答系统中加入能与HLAⅡ类分子的DR,DQ或DP特异地反应的单克隆抗体从而抑制T细胞的增殖应答，以便在基因座水平鉴定HLAⅡ类限制分子。

在96孔微型培养平板上用0.2毫升15％的血清补充的RPMI-1640培养基中将前面用丝裂霉素C处理的自体B细胞系的2×10⁴个细胞；2微摩尔重叠肽；2微克/毫升抗-DR，-DQ或-DP单克隆抗体(Becton Dickinson公司制造)；和2×10⁴个T细胞克隆的细胞的混合物温育2天。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸腺嘧啶后，继续温育18小时。在利用细胞收集器，在玻璃过滤器上收集细胞之后，利用液体闪烁计数器确定细胞中吸收的[³H]胸腺嘧啶的水平。图5的显示的结果表明Cryj1 p106-120,Cryj2 p66-80和Cryj2 p186-200肽的分子是DR；Cryj2 p341-355肽的分子是DQ；和Cryj1 p211-225和Cryj2 p181-195的分子是DP。以同样的方式分析其他T细胞的限制分子(参考图3和4)。

实施例4

鉴定HLAⅡ类限制分子

利用T细胞克隆可以鉴定HLAⅡ类限制分子，该T细胞克隆的限制分子在HLAⅡ类基因座水平已得到鉴定，并且，作为抗原呈递细胞，利用各类DR和B细胞系转染的鼠L-细胞具有同样的DQ或DP单模式。

在96孔微型培养平板上，用0.2毫升15％的血清补充的RPMI-1640培养基中将前面用丝裂霉素C处理的5×10⁴个鼠L细胞或符合单模式的B^-细胞系；2微摩尔重叠肽；3微克/毫升抗-DR,-DQ或-DP单克隆抗体(Becton-Dickinson公司制)；和2×10⁴个T细胞克隆的细胞的混合物温育2天。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸腺嘧啶后，继续温育18小时。在利用细胞收集器，在玻璃过滤器上收集细胞后，利用液体闪烁计数器确定细胞中吸收的[³H]胸腺嘧啶的水平。

通过观察T细胞克隆的增殖应答可以鉴定限制分子。呈递Cryj1 P106-120肽的限制分子是DRB5^*0101，呈递Cryj1 P211-225肽的限制分子是DRB5^*0101,Cryj1 P211-225肽的限制分子是DPA1^*0101-DPB1^*0501，呈递Cryj2 P66-80肽的限制的分子是DRB5^*0101，呈递Cryj2 P181-195的限制分子是DPA1^*0101-PDB1^*0201，呈递Cryj2 P186-200肽限制分子是DRB4^*0101，和呈递Cryj2 P341-355肽的限制分子是DQA1^*0102-DQB1^*0602(图6)。图3和4显示了其他表位位点得到的结果。

实施例5

鉴定T细胞克隆的Th类型

据信Th2细胞参与了变态反应的形成。当前的研究水平还没有完全阐明在特定表位肽或在HLAⅡ类基因座水平上抗原刺激后，T细胞分化成Th1或Th2细胞是否受到限制。当在用肽刺激后优先诱导Th2细胞时，用该肽给药很有可能会使雪松花粉病加剧。用T细胞识别的表位肽刺激实施例2中制备的T细胞克隆。通过测量产生的IL-2,IL-4和IFN-γ的量确定该Th类型。

在24孔微型培养平板上，在用1毫升10％人血清补充的RPMI-1640培养基中将前面用丝裂霉素C处理的1×10⁵个自体B细胞系的细胞，和5×10⁵个T细胞克隆的细胞温育24小时。通过离心沉淀以便得到培养上清液。利用各个ELISA商业可得试剂盒(IL-2试剂盒由R&D公司制造；IL-4试剂盒，由Medgenics公司制造；IFN-γ试剂盒由Otsuka测试研究实验室制造)确定上清液中的IL-2,IL-4和IFN-γ。

图3和4显示了各个T细胞克隆生产的IL-2,IL-4和IFN-γ的量。识别Cryj1的T细胞克隆是12个Th2，一个Th1，和16个Th0细胞，表明存在有比Th1克隆更多的Th2克隆。相反，识别Cryj2的T细胞克隆是10个Th2,8个Th1，和8个Th0细胞，表明Th2克隆的数目大致与Th1克隆数目相等。各个T细胞克隆、限制分子和Th类型的识别的T细胞表位的比较表明Th2、Th1或Th0类型根据各个T细胞克隆而变化。在几个识别同样表位和同样抗原呈递分子的T细胞克隆中同时发现了Th2细胞和Th1细胞。这些结果表明在用Cryj1和Cryj2刺激后，T细胞分化成Th2,Th1或Th0并非由特定的T细胞表位及特定的限制分子的组合所决定的。用另一句话说，所有携带T细胞表位位点的肽都可以是本发明的多表位肽的候选物。

实施例6

制备多表位肽

对Cryj1和Cryj2的IgE抗体表位位点的鉴定揭示了Cryj1缺乏能够识别初级结构的IgE表位并且至少有4个IgE抗体表位位点出现在Cryj2上。但是，这些IgE抗体表位位点与T细胞的表位位点是有区别的。根据这一发现，从Cryj1和Cryj2的T细胞表位中选定了图7所示的肽。

图7显示的肽a和b分别对应于图1显示的Cryj1的肽43和42，肽c对应于图2显示的Cryj2的No.14，和肽d和e分别含有图2显示的Cryj2的部分氨基酸37-38和69-71。

以串联的方式将这六个肽相互联结以便制备本发明的多表位肽。在这种情况下，先a后b的顺序将两个肽a和b联结起来；将余下的三个肽(肽c.d和e)任意联结。在肽中插入序列Arg-Arg。所以，产生了下面6个多表位肽：C.A.#1.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-c-Arg-Arg-d-Arg-Arg-eC.A.#2.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-c-Arg-Arg-e-Arg-Arg-dC.A.#3.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-d-Arg-Arg-c-Arg-Arg-eC.A.#4.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-d-Arg-Arg-e-Arg-Arg-cC.A.#5.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-e-Arg-Arg-c-Arg-Arg-dC.A.#6.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-e-Arg-Arg-d-Arg-Arg-c

实施例7

多表位肽与人IgE抗体的反应性

在0.2M乙酸缓冲液(pH4.5)中溶解实施例6中得到的6个多表位肽(CA.#1到C.A.#6)。在黑板(Dainihon药学有限公司制造)中，以0.1毫升/孔的量分配该溶液，然后4℃过夜。在除去抗原溶液后，用洗涤溶液在4℃洗涤孔3次并在分开的孔中各自加入来自29个患雪松花粉病的患者和健康个体的血清(4倍稀释)。然后在37℃使该系统反应4小时。在除去血清后先用洗涤溶液洗孔3次，然后与抗-人IgE抗体(Pharmacia公司制造)在室温过夜反应。在用洗涤溶液洗3次后，加入含有0.1毫摩尔4-甲基形基-β-D半乳糖基-吡喃糖苷/0.01摩尔磷酸缓冲液(pH7.0),0.1摩尔NaCl,1摩尔MgCl₂，0.1％NaN₃和0.1％BSA的底物溶液，并在37℃温育该溶液2小时。在孔中加入0.1M甘氨酸/NaOH(pH10.3)的溶液以终止反应。利用荧光光度计(Labsystems)测量荧光强度。作为每个多表位肽的阳性对照，用生物素标记的兔抗-d表位IgG和过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(Pierce公司制造)进行反应。

结果所有来自29个人体受试者的血清对所有6个多表位肽(C.A.#1到#6)(空白：3或4)的荧光强度为3到5。相反，当利用从雪松花粉提取和纯化的抗原Cryj1，在6个受试者中记录的荧光强度为1,000或更多，14个受试者中为100或更多，4个受试者中为10或更多，在5个受试者中9或更少。相反，对应于6个共有过敏原(空白：112；230到Cryj1过敏原)，兔抗-d表位肽IgG3,000或更多的荧光强度。这些结果表明多表位肽中各个表位位点连接的顺序不影响与人IgE抗体的反应性(图8)。

实施例8

识别多表位肽中的T细胞表位

检测实施例6中得到的构成多位肽C.A.#4的抗原肽以便确定抗原肽是否真正地起T细胞表位的作用。

在96孔微型培养平板上将前面用丝裂霉素C处理的5×10⁴个自体B细胞系的细胞和T细胞克隆的2×10⁴个细胞在0.2毫升15％的血清补充的RPMI 1640培养基中与作为抗原的50微克/毫升Cryj1和2微克/毫升Cryj2一起温育2天，多表位肽C.A.#4或10微克//毫升C.A.#4多表位肽的各个抗原肽由基因表达产生。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸苷后，继续温育16小时。在利用细胞收集器在玻璃过滤器上收集细胞后，利用液体闪烁计数器确定细胞中[³H]胸苷的吸收水平。结果如图9所示。

识别Cryj1 P106-120的T细胞克隆PB8-34，识别Cryj1 P211-225的T细胞克隆PB 8-34，识别Cryj2 P66-80的T细胞克隆PB4-22，识别Cryj2 P181-195的T细胞克隆PB14-5，和识别Cryj2 P186-200的T细胞克隆PB14-3都与抗原肽反应很好。当使用表位肽时，T细胞克隆增殖应答水平在各个肽之间是可比的。识别Cryj2 P341-355和T细胞克隆PB14-19对多表位肽刺激的增殖应答有些微弱。

这些结果表明包含在多表位肽中的抗原肽能很好地作为表位起作用并保留T细胞活化能力。

实施例9

多表位肽诱导的来自患雪松花粉过敏病的患者的外周淋巴细胞的增殖应答

由于多表位肽含有T细胞表位位点，有必要在应用基于肽的免疫治疗法时诱导对外周淋巴细胞的增殖应答。所以，本发明人检测通过用多表位肽刺激外周淋巴细胞是否能观察到增殖应答。

在用10％人血清补充的RPMI-1640培养基中悬浮来源于患雪松花粉病的患者或来源于健康受试者的外周淋巴细胞。以2.5×10⁵个细胞/200微升的浓度在带有圆底的96孔培养平板的每个孔中分配悬浮液。在每个孔中加入SEQ NO:1代表的多表位肽(Cryj1或Cryj2)到终浓度为0.001到20微克/毫升，Cryj1为50微克/毫升或Cryj2为2微克/毫升。将平板温育6天。在培养基中加入0.5微居里[³H]胸苷之后，继续温育16小时。在利用细胞收集器，在玻璃过滤器上收集细胞之后，利用液体闪烁计数器确定细胞中[³H]胸苷的吸收水平。

6个患者中的5个其外周淋巴细胞显示对多表位肽的增殖应答。来自一个患者和两个健康受试者的外周淋巴细胞没有显示增殖应答(图10)。

用0.1微克/毫升的多表位肽刺激和提高剂量依赖性，外周淋巴细胞开始发生增殖应答。根据结果，诱导体外T细胞增殖应答需要的多表位肽的浓度至少为10微克/毫升。

用10微克/毫升多表位肽刺激来自17个患雪松花粉病的患者和2个健康受试者的外周淋巴细胞以便提高T细胞应答。对于来自健康受试者的外周淋巴细胞没有观察到对T细胞增殖的应答。在17个患者中，观察到最大为9，652cpm的[³H]胸苷吸收。当将没有抗原刺激的外周淋巴细胞的[³H]胸苷吸收定为1，用刺激指数(SI)表示存在抗原时外周淋巴细胞对[³H]胸苷的吸收。结果如图11所示。在鉴定T细胞表位的基础上，SI＞2被认为是阳性的。同样将SI＞2判断为对肽有增殖应答。在这一原则下，发现17个患者中有13个(76.5％)有增殖应答，从这些结果来看，当在76.5％的雪松花粉患者给药时，基于肽的免疫治疗是有效的。

当利用本发明的多表位肽对患雪松花粉病的患者进行基于肽的免疫治疗时，可以先测试来自患者的外周淋巴细胞对多表位肽的增殖应答能力以选择有增殖应答的患者。这样的测试能确定是否可将利用多表位肽的基于肽的治疗用于单个患者。根据增殖应答的水平，也可以在一定程度上预测治疗效果。

实施例10

通过对鼠给药雪松花粉过敏原诱导免疫耐受性

通过用雪松花粉过敏原给药的致敏作用治疗的详细机理目前仍然未知。为了阐明这一机制，利用鼠进行试验。在5天的间隔中以300微克/鼠的剂量将雪松花粉过敏原Cryj1皮下对五个CBF1雌性鼠给药2次，对照使用同样剂量的PBS皮下对其它5只雌鼠给药。5天后，通过皮下注射100微克Cryj1与Alum佐剂使动物致敏。10天后，分离淋巴细胞并合并作为来自对照的淋巴细胞和作为来自Cryj1给药鼠的淋巴细胞。将Cryj1以0,50和150微克/毫升的剂量加到合并的淋巴细胞中。进行温育3天，收集培养上清液。用Endogen公司制造的设备测量包含在上清液中的IL-2结果。如图12所示。在对照(PBS-给药)鼠组中，随着Cryj1的浓度从0增加到50和150微克/毫升，IL-2产量提高。相反，在Cryj1给药的鼠小组中，与对照组相比，IL-2生产明显地减弱，表明通过雪松花粉过敏原的给药获得免疫耐受力。结果证实目前推行的利用雪松花粉过敏原的致敏作用治疗是有效的。

实施例11

鉴定CBF1鼠中的T细胞表位

用10微克的重组Cryj2(rCryj2)在两星期的间隔与佐剂(Imject Alum,PIerce公司制造)对8周龄的雄鼠加强给药三次。在最后加强给药一周后，从三个鼠中收集脾细胞并混合在一起。在96孔平板(Falcon公司制造)的每个孔中将脾细胞(5×10⁶个细胞)与0.2毫升RPMI培养基(用10％PCS,2毫摩尔/升L-谷氨酸，50单位/毫升青霉素和50微克/毫升链霉素)中的含有15个残基的74种Cryj2重叠肽(0.115微摩尔/升)一起培养。对于对照，也观察到了与PBS、50微克/毫升的Cryj1，和0.3微克/毫升的rCryj2的反应性。在三个孔中分配每种试剂并在5％的CO₂和37℃温育3天。在最后6小时，用0.5微居里/孔的[³H]胸苷进行脉冲标记。利用细胞收集器(Inoteck,Bertold日本有限公司)，在玻璃过滤器上收集细胞。干燥后，利用液体闪烁计数器(TR1-CARB 4530,Packard日本KK)确定细胞中[³H]胸苷的吸收水平。

用rCryj2免疫的CBF 1鼠显示出与其抗原rCryj2的强烈的反应性，但与另一个主要的雪松花粉过敏原Cryj1不反应。这证明该反应是抗原特异性的。如图2所示，在测试的74个重叠肽中，用rCryj2免疫的CBF 1鼠显示了显著的对肽Nos.14和48的应答。这些结果表明参与抗原呈递的肽Nos.14和48是CBF1鼠中主要的T细胞表位。已知肽NO.14和48也是人体中的主要T细胞表位肽。所以，CFB₁鼠作为动物模型可用于判断对雪松花粉的基于肽的免疫治疗法的肽的效力。

实施例12

抗原肽NO.14的体内免疫应答

将溶解于生理盐水的肽NO.14(3毫克)溶液皮下注射到各8周龄的雄性CBF1鼠(8个动物/组)中两次，头一次注射后5天间隔再注射一次。作为对照，以同样方式给对照组同等体积(100微升)生理盐水。在第二次将肽给药后5天，通过皮下注射50微克/鼠的rCryj2与Imject Alum使所有鼠致敏。在致敏后一星期，从每个鼠中收集脾细胞。将脾细胞(5×10⁶个细胞)与3微克/毫升rCryj2一起在0.2毫升RPMI培养基(用10％FCS.2毫摩尔L-谷氨酸，50单位/毫升青霉素和50微克/毫升链霉素补充)中，在96孔平板(Falcon公司制造)的每个孔中培养。在同样的没有rCryj2的条件作比较进行温育。利用[³H]胸苷，以同样于实施例1中的方法确定T细胞增殖。利用通过体外刺激三个给药肽的组10.3,1.3和10微克/毫升)和含有0.3微克/毫升的对照组得到的培养上清液确实细胞因子。

前面用NO.14在对CBF1鼠皮下给药时，与生理盐水组相比，T细胞对rCryj2的抗原刺激的免疫应答受到明显的抑制(P＜0.01)(图.13)。肽给药组与对照组的比较表明IL-2生产有明显的下降。这些结果揭示，在鼠模型系统中，在基于肽的免疫治疗法中肽NO.14表现出对雪松花粉病的预防效果。

实施例13

抗原肽NO.48的体内免疫应答

在5天的间隔分别将溶解于生理盐水中的NO.48(3毫克)的溶液对6周龄雄性CBF1鼠皮下注射各两次。作为对照，以同样方式给于等体积(200微升)的生理盐水。在肽给药组和对照组分别有8只动物。在第二次给药肽后5天，通过皮下注射50微克/鼠的rCryj2与佐剂(Imject Alum)的混合液使所有鼠致敏。在致敏作用后一周，从每个鼠中收集脾细胞。将脾细胞(5×10⁶个细胞)与3微克/毫升的rCryj2一起在0.2毫升RPMI培养基(用10％FCS，2毫摩尔/升L一谷氨酸，50单位/毫升青霉素，和50微克/毫升链霉素补充)中，在96孔平板(Falcon公司制造)的每个孔中培养。在没有rCryj2的同样条件下也进行温育作为比较。利用[³H]胸苷以与实施例1相同的方式确定T细胞增殖。

当先将肽NO.48对CBF1鼠皮下给药时，与生理盐水对照组比较，T细胞对随后的rCryj2抗原刺激的免疫应答受到抑制(P＜0.05)。这一结果表明在鼠模型系统中，在基于肽的免疫治疗中肽NO.48对雪松花粉病具有预防效果(图14)。

上面叙述的实验结果表明利用雪松花粉提取物在人体中常规地进行的致敏作用的治疗是根据T细胞表位调节机制工作的。

实施例14

确定核心序列

为了确定T细胞系和T细胞克隆增殖应答所必需的Cryj1肽NO.22(P106-120)的最小氨基酸序列(核心)，如图15所示，利用肽合成仪(PSSM-8,Shimadzu Seisakusho有限公司制造)从该肽的N和C末端各删除一个氨基酸残基制备11个肽，即P107-120(P22-2),P108-120(P22-3),P109-120(P22-4),P110-120(P22-5),P111-120(P22-6),P106-109(P22-7),P106-118(P22-8),P106-117(P22-9),P106-116(P22-10)，和P106-115(P22-11)。以与实施例1和2相同的方式检测了从患雪松花粉病的三个患者衍生的并与Cryj1肽NO.22 P106-120反应的T细胞系(PJ,PR,PB)及来自患者之一的T细胞克隆(PB8-3,PB8-2,PB9-39)与这11个肽的反应性。两个T细胞系(PJ,PB)和两个T细胞克隆(PB8-2,PB9-39)识别P106-120(P22-1)增殖，但一个T细胞系和一个T细胞克隆不显示任何增殖应答(图.15)。结果表明P106-120核心序列含有九个残基“FIKRVSNVI”(这九个残基被命名为Cryj1#22核心)。

实施例15

含有雪松花粉和日本扁柏(hinoki)花粉过敏原诱导的T细胞表位的多表位肽

通过将肽NO.8(P71-90:IFSKNLNIKLNMPLYIAGNK)，日本扁柏(hinoki)花粉过敏原Chao1的T细胞表位(日本专利号Hei.8-153527)，或肽NO.32(P311-330:SSGKNEGTNIYNNNEAFKVE)与利用肽合成仪(PSSM-8,Shimadzu Seisakusho有限公司)在实施例14中得到的Cryj1#22核心序列“FIKRVSNVI”联合合成两个肽(Cha o1#8-Cryj1#22核心，Chao1#32-Cryj1#22核心)。将RR序列插入在Cha o1#8和Cryj1#22核心之间和Cha o1#32和Cryj1#22核心之间，即Cha o1#8-Cryj1#22核心(SEQ NO:4)Cha o1#32-Cryj1#22核心(SEQ NO:5)。

分别从患雪松花粉病和日本扁柏花粉病的患者制备Cryj1特异性细胞系和Cha o1特异性的T细胞系。Cryj1特异性的T细胞系和Cha o1特异性的T细胞系既不与tubercle bacillus抗原(PPD)也不与溶血性生链球菌细胞壁(SCW)抗原反应。Cryj1特异性的T细胞系与Cryj1#22和Cryj1#22核心反应，但不与Cha o1#8或与Cha o1#22反应。Cha o1特异性的T细胞系与Chao1#8和#32反应但与Cryj1#22或Cryj1#22核心不反应(图16)。但是这些T细胞系都与多表位肽SEQ NO:4和SEQ NO:5的多表位肽反应。这些结果表明通过联合由雪松花粉和日本扁柏花粉过敏原的诱导T细胞表位制备的多表位肽对基于肽的免疫治疗患雪松花粉病和具有日本扁柏花粉病的患者的治疗方法是有效的。

实施例16

由肽的加入导致的增殖应答和细胞因子的产生

利用了两个克隆，PJ7-9和PB10-18来看通过替代Cryj1#22核心的T细胞表位肽的氨基酸是否可以改变T细胞的活性。与Cryj1肽NO.22P106-120反应的T细胞克隆PJ7-9和PB10-12受到DRB5*0101的限制并识别Cryj1#22核心的九个残基。利用同源氨基酸和非同源氨基酸代替包括该九个残基的13个残基的肽P108-120(VFIKRVSIVVIIHG)中该九个氨基酸残基的每一个残基以便生产类似肽(图17和18)。根据[³H]胸苷的吸收检测T细胞克隆PJ7-9和PB10-18与这些类似肽的反应性。利用R&D系统制造的细胞因子测试试剂盒测定反应溶液中细胞因子的浓度。图17和18显示了结果。将上清液中IFN-γ,IL-4,IL-2和IL-5的产生和通过与没有氨基酸替代的13个残基的肽反应得到的[³H]胸苷的吸收认作100％。在PJ7-9克隆中，[³H]胸苷的吸收和细胞因子的生产都明显受到同源和非同源氨基酸或只有非同源氨基酸替代的Cryj1#22核心“FIKRVSNVI”中氨基酸3,4和6，即“K”,“R”,和“S”的替代的抑制(图17)。因此，对于通过肽形成HLA和T细胞受体分子的复合物，位于这些位置中的氨基酸被认为是重要的。即使用同源氨基酸Y替代第一个氨基酸(F)，不会观察到[³H]胸苷的吸收和IL-4和IL-5的产量的变化，但用非同源氨基酸“S”代替就会发生IFN-γ和IL-2产量的明显增加(即使[³H]胸苷的吸收没有变化)。对于PB 10-18克隆，[³H]胸苷的吸收受到Cryj1#22核心的氨基酸NO.1,2,3,4,6,7,8的替代的抑制。故认为位于这些位置的氨基酸对于通过肽形成HLA和T细胞受体分子的复合物是重要的。进一步观察到与IL-5生产比较，IL-2的生产受到氨基酸NO.6,7，或8的替代的抑制(图18)。这些结果表明通过在Cryj1#22核心中用S替代第一个氨基酸F得到的“SIKRVSNVI”会增加IFN-γ的生产因而是有效的过敏治疗试剂。

工业应用性

本发明的多表位肽含有起源于各不相同的过敏原分子的T细胞表位。它含有频繁出现在具有变态反应的患者人群中的基因编码的HLAⅡ类分子上所具有的肽。它进一步含有出现在不同基因座(DR,DQ,DP)上的HLAⅡ类分子上的几个肽。利用最小长度的多表位肽可以实现对广泛范围的患者的有效的基于肽的免疫治疗。

当利用本发明的多表位肽对具有变态反应的患者进行基于肽的免疫治疗时，在治疗之前可以测试来自患者的外周淋巴细胞对该肽的增殖应答，以便选择产生增殖应答的患者。这一测试能判断是否将使用多表位肽的基于肽的免疫治疗法用于该患者。根据增殖应答的水平也可以在一定程度上预测治疗效果。序列表SEQ ID NO:1序列长度：80序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述：MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RISLKLTSGK IASRRVDGII AAYQNPASWK 80SEQ ID NO:2序列长度：105序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述：MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RWKNNRIWLQ FAKLTGFTLM GRRLKMPMYI 80AGYKTFDGRR VDGIIAAYQN PASWK                 105SEQ ID NO:3序列长度：134序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述：MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RWKNNRIWLQ FAKLTGFTLM GRRPLWIIFS 80GNMNIKLKMP MYIAGYKTFD GRRAEVSYVH VNGAKFIRRV 120DGIIAAYQNP ASWK                             134SEQ ID NO:4序列长度：31序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述：IFSKNLNIKL NMPLYIAGNK RRFIKRVSNV I    31SEQ ID NO:5序列长度：31序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述：SSGKNEGTNT YNNNEAFKVE RRFTKRVSNV I    31