心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白轻链Ⅰ诊断试剂

摘要

一种急性心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白轻链Ⅰ诊断试剂,主要包括人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ基因在大肠杆菌中的高表达产物作为阳性对照及该表达产物作为抗原制备的单抗和多抗。诊断方法为双抗体夹心法,即以固相化的单抗捕获检测血清中的抗原—心肌肌球蛋白轻链Ⅰ,用多抗作为检测抗体,根据酶与底物反应后所测得的ELISA读数值与本发明提供的临界值(cut off值)比例,大于cut off值的,判断为急性心肌梗塞发病期。

说明书

本发明涉及人心脏疾病的诊断试剂，尤其是关于人急性心肌梗塞、心肌炎的新的临床诊断试剂。

心血管疾病是我国主要的疾病之一，特别是随着我国居民老龄化程度的增加，急性心肌梗塞的死亡率逐年上升，心肌炎病例也大为增加。目前，虽然急性心肌梗塞的血液检测已有临床广泛使用的磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及谷草转氨酶(GOT)等方法，但其早期性、灵敏性和持久性均不能满足临床要求，只能在患者发病后二、三天内适用，致使患者发生猝死的现象时有发生。心肌梗塞在国内发病率很高，特别是我国北方地区大大高于南方，达十倍以上。目前，由于全球老龄化程度的增加带来了心血管疾病发生率的提高，这也为检测试剂的应用提供了广阔的市场。因此一种更加灵敏、专一，早期、持久的心肌梗塞检测试剂的研制，成为国内外心脏疾病防治和治疗的迫切需要。

肌球蛋白是肌肉中的一种主要的结构蛋白，在肌肉收缩中起重要作用，由一条重链及二条分子量分别为27KD和20KD的轻链(轻链Ⅰ和轻链Ⅱ)组成。研究发现，由于轻链在酸性环境中，易从重链上解离。八十年代初，日本科学家首先发现，当缺血，缺氧引起心肌损害时，心肌组织不断地长时间地向血液中游离出心肌肌球蛋白轻链，而且其时相性的变化可直接反映心肌的破坏过程，由于人心肌轻链Ⅰ在血中更稳定，因此可作为检测心脏疾病的一项新的和重要的生化指标(Yamada T.et al.,Am Heart J 1998 Feb；135(2 Pt 1):329-34；Hisatomi K.et al.,Thorac Cardiovasc Surg 1996 Dec；44(6):296-9；Ravkilde J.et al.,J Am Coll Cardiol 1995 Mar1；25(3):574-81；Ravkilde J.et al.,Cardiology 1994；84(2):135-44；Uchino T.et al.,J Cardiovasc Surg 1993,Dec；34(6):517-22)。

自上述理论建立以来，欧、美和日本的不少实验室尝试将人心肌肌球蛋白轻链的抗体结合放射免疫方法应用到人心肌梗塞病例的测定上，获得了满意的结果。然而，国外至今仅有实验室内小规模应用的报导，尚未见正式生产的诊断试剂盒，究其原因主要是：1)肌球蛋白具有相当特殊的性质，要从心肌中分离出足够量的肌球蛋白并进行轻、重链的拆分，必须具备扎实的肌肉蛋白研究的理论基础；2)作为临床诊断试剂盒，必须有人心肌肌球蛋白轻链作为抗原对照，其来源受到很大的限制。

为此，本发明的目的是提供一种心肌梗塞的血液心肌肌球蛋白轻链Ⅰ诊断试剂，该诊断试剂的应用在早期性、持续性和专一性方面均大大优于目前使用的检测方法。

本发明提供的心肌梗塞血液心肌肌球蛋白轻链Ⅰ(HCMLCⅠ)诊断试剂，主要包括人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ基因在大肠杆菌中的高表达产物作为阳性对照及该表达产物作为抗原制备的单抗和多抗。单抗的运用，大大提高了诊断试剂的专一性；以ELISA测定方法取代放射免疫法，使之既具有较高的灵敏度又不产生污染，检测手段方便易行。

本发明采用双抗体夹心ELISA法为诊断方法，以固相化的单抗捕获检测血清中的抗原--心肌肌球蛋白轻链Ⅰ，单抗制备所用的抗原为人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因工程表达产物，用辣根过氧化物酶标记的抗心肌肌球蛋白轻链Ⅰ作为检测抗体，根据酶与底物反应后颜色的变化测定血清中的抗原的含量，最终根据ELISA读数值与本发明提供的临界值(cut off值)比较，大于cut off值的，判断为急性心肌梗塞的发病期。下面以中国人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ为例分五部分详述本发明的内容。一．中国人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因克隆和序列测定1．人心肌总RNA的制备

手术后的人心肌，去除其它组织，取心室肌为实验材料，加预冷的抽提缓冲液，用组织捣碎机匀浆，离心后所得上清用苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液抽提直至变性蛋白层消失。水相加无水乙醇后获得沉淀即为总RNA。2．人心肌总mRNA的制备

抽提的总RNA用高效0ligo(dT)纤维素充分混合(振荡)后置0℃冰箱保温3-4小时或过夜，取出后再轻微搅拌或振荡混合，离心后沉淀用含KCl的Tris洗脱后收集上清液，加无水乙醇后获得沉淀为人心肌总mRNA。3．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的cDNA构建

根据加拿大G.Jackowski 1988年发表的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因顺序(G.Jackowski,Nucleic Acid Research,1988)，设计合成与人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因3’端和5’端相应的两个引物(5’GGAATTCCTTAGCTGGACATGATGT 3’和5’GGAATTCCATGGCCCCCAAAAAGCC 3’)，并在引物合成的同时接上限制性内切酶EcoRI的接头。抽提的总mRNA经AMV逆转录酶反转录酚抽，乙醇沉淀得到cDNA。4．cDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增和克隆

cDNA的PCR扩增用上述两引物进行(参见分子克隆操作指南，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1989),PCR产物(图1)经限制性内切酶EcoRⅠ水解后，将其克隆进载体puc19的EcoRⅠ位点，以待测序。5．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因序列测定

用标准的“双脱氧法”测定顺序按T.Maniatis的分子克隆操作指南进行操作，其结果如图2所示，共含有588个碱基，从基因序列推出的HVMLCⅠ的氨基酸序列共含有195个氨基酸。但与加拿大G.Jackowski发表的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因顺序相比，有两处差异，一处是在第24位，由谷氨酸变成丙氨酸，另一处差异更大，即从98位起至101位氨基酸由-天冬酰胺-精氨酸-丝氨酸-赖氨酸变为-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-谷氨酰胺。(见图3)为了证明这两处差异并非由于多聚酶链式反应中合成误差所造成，本发明从总mRNA抽提开始共重复实验两次，并取用不同的心脏材料，结果完全重复。由此证明中国人HVMLC1的基因具有特征性的序列片段，两者的差异预计与人种的差异有关。二．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的表达和表达产物的纯化1．表达质粒的构建和克隆

用EcoRⅠ将其克隆进载体puc19的PCR产物水解下来，再克隆进表达载体pGEX-3X的EcoRⅠ位点构建成表达质粒。2．表达产物的诱导纯化

含表达质粒的单菌落在LB(+Amp)中连续培养后，加IPTG进行诱导，37℃培养过夜。离心收集菌体，沉淀悬浮MTPBS缓冲液，超声波破菌。破菌后离心以去除细胞碎片，上清加Triton X-100离心后再取上清上样于Glutathione Sepharose 4B柱，上样后先用PBS缓冲液洗10个柱体积，再用Glutathion洗脱，便得到纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(图4)。三．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的单克隆抗体制备1．动物免疫

取雌性小鼠，用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物加等体积的完全佐剂对小鼠进行腹腔初次免疫；三周后用同样量的抗原加等体积的非完全佐剂对小鼠进行腹腔第二次免疫；再过二周后用第二次免疫的量对小鼠进行腹腔第三次免疫。

融合前三天对已免疫的小鼠用抗原，不加任何佐剂，直接注入脾脏。2．融合

骨髓瘤细胞p3x63Ag8·653在完全培养液中培养，取对数生长期的细胞用于融合。无菌条件下取出免疫小鼠的脾脏，收集脾细胞计数。骨髓瘤细胞与脾细胞混合，离心十分钟，去上清，用非完全培养液洗细胞一次，同上法离心除尽上清，打散细胞凝集快，加聚乙二醇4000，按常规方法进行细胞融合。融合细胞加HAT选择培养液置于孔培养板培养。7天左右去1/2体积细胞培养液，换入1/2体积的新鲜HAT选择培养液，继续培养，待杂交瘤细胞长到10⁵个以上时，用间接ELISA法检测细胞培养液中是否含有抗体，该间接ELISA法如下所述：包被抗原为纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物，4℃过夜，洗涤后加入待测培养液，37℃孵育，洗涤后加入HRP-羊抗属IgG,37℃保温，洗涤后加底物H₂0₂及四甲基联苯胺(TMB)显色，450nm测定光吸度，OD0.5以上为阳性。3．克隆化

采用有限稀释法克隆阳性细胞，重复克隆，直至阳性率100％为止，经过筛选获得一株分泌抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的单克隆细胞株，命名为HCMLC1-8(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，1998年11月25日，保藏编号为CGMCC NO.0370)。四．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的多克隆抗体制备

取雄性大白兔，用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物加等体积的完全佐剂对大白兔进行腿部初次免疫；三周后用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物加等体积的非完全佐剂对大白兔进行腿部第二次免疫；每二周后用第二次免疫的量对大白兔进行免疫，共免疫4次，采血前对已免疫的大白兔进行追加免疫，免疫结束后的大白兔进行采血并纯化血清中的IgG。五．双抗体夹心ELISA法检测急性心肌梗塞发病期

用抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的单抗(HCMLC1-8,4000×)包被，放置过夜后用脱脂奶粉封闭；洗涤后，加入待测血清(纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物作为阳性对照)后保温；洗涤方法同上，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ多抗进行保温保温，洗涤后加入辣根过氧化物酶的底物H₂O₂及四甲基联苯胺进行显色，各孔的450nm吸光度在ELISA检测仪上读数。

所测读数与本发明诊断试剂中所提供的临界值(cut off值)进行比较，高于临界值的为阳性，低于临界值的为阴性。本发明优点与效果：

目前，临床上广泛使用心肌梗塞的血液检测的磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及谷草转氨酶(GOT)等方法，通常只能在患者发病后二、三天内适用，其早期性、灵敏性和持久性均不能满足临床要求，患者发生猝死的现象时有发生。而本发明所研制的诊断试剂与上述相比，在临床检测上具有明显的优势。首先是它检测的早期性，通常在病人发病的十二小时，就能检测血液中因心肌损伤而释放的心肌肌球蛋白轻链I；其次是它的灵敏性和持续性，亦优于目前使用的检测方法；尤其是可以对病人在二星期内不断进行监测，可很好地防治患者发生猝死，也可评估药物对心脏损害的保护及治疗作用，加上其高度的专一性，而且对其它心肌疾病，如心肌炎等，也同样适用。表1显示与磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及谷草转氨酶(GOT)等方法进行的比较。

表1急性心肌梗塞病人血清中HCMLC-Ⅰ(心肌肌球蛋白轻链Ⅰ)与其它临床生化指标的比较：

生化指标血清中最早出    现的时间    (小时)高峰值出现的    时间    (小时)血清中持续    时间    (天)CPK    4～6    16～24    4～5 CPK(MB)    3    18～36    2～4 GOT    ～12    12～48    ～7 LDH    6    30～96    7～10 HCMLC-I    4～6    30～144    7～16

从表中可见，心肌梗塞发病时，血清中心肌肌球蛋白轻链Ⅰ出现的时间与CPK和CPK(MB)相似，都比GOT和LDH要早，并持续出现高峰值长达16天，而其它一些指标往往出现7天左右就无法检测了。因而，用心肌肌球蛋白轻链Ⅰ作为诊断指标，它在早期性，灵敏性，持续性和专一性方面均大大优于目前所使用的检测方法，加上其检测过程非常简便，所用检测仪器在各大医院又早已运用，使得本发明提供的检测试剂具有广泛的市场和使用价值。

附图说明：一．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ基因的PCR扩增产物

1．λDNA HindⅢ标准分子量

2．PCR产物

二．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因序列

1．中国人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因序列

2．加拿大报导的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因序列(划线部分为相同

序列)三．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的蛋白质序列

1．中国人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的蛋白质序列

2．加拿大报导的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的蛋白质序列(划线部分为相同序列)四．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的大肠杆菌表达产物

1．标准分子量蛋白

2．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的大肠杆菌表达产物

实施例1．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因克隆和序列测定

1．人心肌总RNA的制备

手术后的人心肌，去除其它组织，取10克心室肌为实验材料，加预冷的6倍体积的抽提缓冲液(O.02M Tris-HCl pH8.9,0.5％SDS,0.04M NaCl,0.005M MgCl₂)，用组织捣碎机匀浆，每匀浆一次一分钟，停顿一分钟，重复三次，以12000rpm/分钟，离心10分钟，所得上清加2倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液，含0.2％SDS,0.01M EDTA振荡10分钟，10000rpm/分钟，离心10分钟，上清重复用此混合液抽提直至变性蛋白层消失。水相加2.5体积的无水乙醇，1/10体积3M NaAc,pH5.4,-70℃放置过夜。离心，15000rpm/分钟，离心20分钟，沉淀用70％冷乙醇洗两次，15000rpm/分钟，离心5分钟，沉淀即为总RNA，抽干待用。2．人心肌总mRNA的制备

4mg总RNA在冰浴中溶解于2ml无菌重蒸水，加入0.5ml 2.5M KCl,0.05M Tris-HCl,pH7.5缓冲液。取0.1g高效Oligo(dT)纤维素(华美公司)置于烧杯中，用0.5M KCl 0.01M Tris-HCl pH7.5缓冲液浸泡过夜后尽量吸去缓冲液。将上述总RNA溶液加到Oligo(dT)纤维素缓冲液中，充分混合(振荡)后置0℃冰箱保温3-4小时或过夜。取出后再轻微搅拌或振荡混合，4℃离心，6000rpm/分钟，离心5分钟，沉淀用0.5M KCl,0.01M Tris-HCl洗涤至上清液A₂₆₀nm＜0.03，再改用0.01MTris-HCl,pH7.5于54℃中洗涤沉淀后离心，收集上清液，沉淀再用少许缓冲液在54℃中保温5分钟，离心，合并二次上清液，再加2.5倍预冷的2％NaCl 95％乙醇，置-20℃过夜离心，沉淀用冰冷2％NaCl,75％乙醇洗涤，沉淀物置真空抽干残液后，溶于少量无菌重蒸水得人心肌总mRNA。3．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的cDNA构建

根据加拿大G.Jackowski 1988年发表的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因顺序，设计合成了两个引物，并在引物合成的同时接上限制性内切酶EcoRⅠ的接头，其顺序为：引物Ⅰ:5’GGAATTCCTTAGCTGGACATGATGT 3’，它和人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因3’端17个核苷酸序列互补；引物Ⅱ:5’GGAATTCCATGGCCCCCAAAAAGCC 3’，它和人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因5’端17个核苷酸序列相同。

取10μl抽提的总mRNA(5μg/μl),2μl引物Ⅰ(1μg/μl)7μl 5x鸟类成髓细胞性白血病病毒(AMV)缓冲液，1μl RNasin(10unit/μl),8μl4×dNTP(各10mmol)4μl H₂O，再加3μl AMV逆转录酶，42℃,105分钟，加2.1μl 10N NaOH,37℃,30’,1.8μl 12N HCl中和，经Sephadex G-50分离，去除小分子模板和多余的dNTP，经酚抽，乙醇沉淀得cDNA。4．cDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增和克隆

cDNA的PCR扩增按T.Maniatis的分子克隆操作指南进行。

反应液中含有63μl ddH2O,10μl 10×Taq缓冲液，16μl dNTP(各2.5m mol),2μl引物Ⅰ(1μg/μl),2μl引物Ⅱ(1μg/μl),6μlcDNA单链(9.6ng),1μl Taq DNA聚合酶(5unit)混合后加100μl液体石腊油，按以下程序反应：

                  变性    退火    合成

                  94℃    55℃    72℃

循环Ⅰ             5’     2’    3’

循环2至循环24      1’     2’    3’

循环25             1’     2’    6’

反应后吸出石腊油后，取10μl用1.5％琼脂糖电泳鉴定(图1)，剩余样品经酚抽提后乙醇沉淀。

PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ水解后，按照T.Maniatis等的分子克隆实验指南将其克隆进载体puc19(华美公司)的EcoRⅠ位点，以待测序。5．人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因序列测定

用标准的“双脱氧法”测定顺序(参见T.Maniatis等的分子克隆操作指南)，其结果如图2所示，共含有588个碱基，从基因序列推出的HVMLCⅠ的氨基酸序列共含有195个氨基酸。但与加拿大G.Jackowski报导的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的基因顺序相比，有两处差异，一处是在第24位，由谷氨酸变成丙氨酸，另一处差异更大，即从98位起至101位氨基酸由-天冬酰胺-精氨酸-丝氨酸-赖氨酸变为-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-谷氨酰胺。(见图3)为了证明这两处差异并非由于多聚酶链式反应中合成误差所造成，本发明从总mRNA抽提开始共重复实验两次，并取用不同的心脏材料，结果完全重复。由此证明中国人HVMLC1的基因具有特征性的序列片段，两者的差异预计与人种的差异有关。实施例2：人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的表达和表达产物的纯化1．表达质粒的构建和克隆用EcoRⅠ将其克隆进载体puc19的PCR产物水解下来，再克隆进表达载体pGEX-3X(华美公司)的EcoRⅠ位点构建成表达质粒。2．表达产物的诱导纯化

含表达质粒的单菌落在2ml LB(+Amp)中培养，37℃过夜。转1ml37℃上述过夜菌于50ml LB(+Amp)中培养，37℃过夜后，再转50ml37℃上述过夜菌于500ml LB(+Amp)中，37℃培养3小时，在培养液中加1.25ml IPTG(100m mol),37℃培养过夜。

离心6,000rpm,10分钟收集菌体，沉淀用MTPBS缓冲液(150mmolNaCl,16mmol Na₂HPO₄,4mmol NaH₂PO₄)洗一次后悬浮于40mlMTPBS缓冲液，超声波破菌。破菌后加MTPBS缓冲液至200ml，离心10,000rpm,20分钟以去除细胞碎片，上清加Triton X-100至终浓度为1％，离心10,000rpm,10分钟；取上清上样于2ml的GlutathioneSepharose 4B柱，上样后先用PBS缓冲液洗10个柱体积，再用10mmolGlutathion 50mmol Tris-HCl,pH8.0洗脱，便得到纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(图4)。实施例3：人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的单克隆抗体制备1．动物免疫

取雌性BalB/C小鼠(5-7周龄)，用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(50g/只)加等体积的完全佐剂对小鼠进行腹腔初次免疫；三周后用同样量的抗原加等体积的非完全佐剂对小鼠进行腹腔第二次免疫；再过二周后用第二次免疫的量对小鼠进行腹腔第三次免疫。

融合前三天对已免疫的BalB/C小鼠用50μg/只的抗原，不加任何佐剂，直接注入脾脏。2．融合

骨髓瘤细胞p3x63Ag8·653在完全培养液中培养，取对数生长期的细胞用于融合。无菌条件下取出免疫小鼠的脾脏，收集脾细胞计数。骨髓瘤细胞与脾细胞以1∶5比例混合，1000rpm离心十分钟，去上清，用非完全培养液洗细胞一次，同上法离心除尽上清，打散细胞凝集快，加50％聚乙二醇4000进行细胞融合。融合细胞加HAT选择培养液置于孔培养板(～10⁵个细胞/孔)培养。7天左右去1/2体积细胞培养液，换入1/2体积的新鲜HAT选择培养液，继续培养，待杂交瘤细胞长到10⁵个以上时，用间接ELISA法检测细胞培养液中是否含有抗体。该间接ELISA法如下所述：

包被抗原为纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(10μg/ml),96孔酶标板每孔加50μl,4℃过夜，洗涤后加入待测培养液，37℃孵育1小时，洗涤后加入HRP-羊抗属IgG,37℃保温30分钟，洗涤后加底物H202及TMB显色，450nm测定光吸度，0D0.5以上为阳性。3．克隆化

采用有限稀释法克隆阳性细胞，重复克隆，直至阳性率100％为止，经过筛选获得一株分泌抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的单克隆细胞株，命名HCMLC1-8。实施例4：人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的多克隆抗体制备

取雄性大白兔(5-7周龄)，用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(100μg/只)加等体积的完全佐剂对大白兔进行腿部初次免疫；三周后用纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ的GST融合表达产物(100μg/只)加等体积的非完全佐剂对大白兔进行腿部第二次免疫；每二周后用第二次免疫的量对大白兔进行免疫，共免疫4次，采血前对已免疫的大白兔用100μg/只的量进行追加免疫，免疫结束后的大白兔进行采血并纯化其血清中的IgG。实施例5：双抗体夹心ELISA法检测急性心肌梗塞发病期

用5μg/ml的抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物的单抗(HCMLC1-8,4000×)包被，4℃放置过夜后，用5％的脱脂奶粉37C封闭1小时；经洗涤液(20mmol Tris,45mmol HCl,0.27％Tween 20)洗三次，每次5分钟，加入待测血清(纯化的人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ表达产物作为阳性对照)，37℃保温1小时；洗涤方法同上，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人心肌肌球蛋白轻链Ⅰ多抗，37℃保温45分钟，用上述洗涤液洗五次，最后加入辣根过氧化物酶的底物H₂O₂及四甲基联苯胺进行显色，各孔的450nm吸光度在ELISA检测仪上读数。

所测读数与本发明诊断试剂中所提供的临界值(cut off值)进行比较，高于临界值的为阳性，低于临界值的为阴性。