生产帕瓦它丁前体ML－236B的新方法

摘要

本发明涉及生产ML－236B[帕瓦它丁(pravastatin)钠的前体]的新方法,特别是涉及通过使用从土壤分离的新微生物生产结构式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)中表示的ML－236B的内酯形式(Ⅰ)、游离酸形式(Ⅱ)、钠盐(Ⅲ)的方法。ML－236B从该微生物的培养液中得到并用来作为帕瓦它丁钠的底物,帕瓦它丁钠是治疗血胆固醇过多时使用的有效降胆固醇剂。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及生产ML-236B〔帕瓦它丁(pravastatin)钠的前体〕的新方法，特别是涉及通过使用从土壤分离的新微生物生产以下结构式中表示的ML-236B的内酯形式(Ⅰ)、游离酸形式(Ⅱ)、钠盐(Ⅲ)的方法。ML-236B从该微生物的培养液中得到并用来作为帕瓦它丁钠的底物，帕瓦它丁钠是治疗血胆固醇过多时使用的有效降胆固醇剂。

现有技术描述

已知心脏疾病如心肌梗死，动脉硬化主要由血脂过多，尤其是血胆固醇过多引起。由美国专利号3,983,140和英国专利号1,453,425报告已开发了真菌青霉属种类合成称为ML-236B的降胆固醇化合物。ML-236B通过土壤微生物或化学反应合成。已有报道短密青霉，Penicilmyces种类，Trichoderma longibraiatum,Trichodermapseudokoringi,Hyphomyies chrisopomus和Penicillium citrium合成ML-236B(David等，“丝状真菌的生物技术”，241页；日本公开号平成4-349034)。

特别地，日本Sankyo药物公司已开发了Penicillium citrium SANK18767菌株，该菌株是1971报告的Penicillium citrium NRRL-8082菌株的突变体。通过14年的持续菌株开发，他们已得到Penicillium citriumThom SANK 13380。ML-236B产量已从1.75mg/l提高到42.5mg/l。

然而，上述方法需太多的时间(约14年)来发展具高ML-236B产量的菌株。而且此方法也需要稍微长的培养时间(14天)，并且表现相对低的ML-236B产量。

发明概述

为克服上述现有技术中的问题，本发明做了大量努力来筛选具高ML-236B产量的新微生物，并开发具高产量和高纯度的ML-236B新的制备方法。

最终，他们分离到新微生物粘舌菌属菌种YJ-9515，该微生物表现出很高的ML-236B产量和较短的培养时间。因而，该菌株可直接用于ML-236B的工业生产。

附图描述

本发明将在附图中更详细地描述。

图1是从本发明得到的ML-236B的红外光谱。

图2是从本发明得到的ML-236B的¹³C-核磁共振图谱。

发明详述

本发明的特征在于使用新微生物粘舌菌属菌种YJ-9515(由国际保藏单位，韩国生物科学和生物技术研究院韩国典型培养物保藏中心给出保藏号：KCTC 0252BP)生产ML-236B。

下面是本发明更详细的描述。(A)新微生物的分离

用水稀释土壤样品10^-3-10^-6倍，并在土豆-葡萄糖琼脂(PDA)和Czapak琼脂平板上铺板，在25℃下培养7天。结果分离到4,000个菌株。为筛选合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的菌株，将每个菌株接种于含20ml PDA和Czapak培养基的125ml锥形烧瓶中培养。在过滤培养液之后，测试滤液和细菌团的HMG-CoA还原酶的抑制水平。(B)新微生物的鉴定

从上述方法得到的新微生物有以下特性。

(1)在PDA上25℃培养7天后，菌株的菌落大小是直径2.0cm，菌落的颜色是灰白色，并且表面覆盖有柔软，细毛状短气生菌丝体。克隆的基部是亮黄色并有细皱折。不产生可扩散的色素。

(2)在麦芽汁琼脂(MEA)上25℃培养7天后，菌株的菌落大小是直径1.5cm。菌落的表面是白色，并且柔软平滑。菌落的基部是亮褐色并有宽皱折。没有检测到可扩散的色素。

(3)分生孢子的表面是粗糙的，不分枝的，单轮生的并有突起。

(4)帚状枝的大小是2.0-3.5μm×1.5-3.1mm，并且其表面粗糙，看似长圆柱状。

(5)小梗或瓶梗的大小是5.0-7.0μm×2.0-3.0μm，并具瓶状外形。

(6)分生孢子的大小是2.0-2.5μm，分生孢子的形状是卵形。

分生孢子的表面非常粗糙并由不规则粘性团聚体构成。

在本发明中用于鉴定新微生物的方法基于玻片培养期间的孢子形成过程和形态学特征。通常使用这种方法鉴定真菌〔Dopsy等，“土壤真菌概要”，p859(1980)；Academy press。〕。

根据上述方法的结果，将分离的微生物分类为粘舌菌属种类。而且该菌株的分生孢子在长度和形态学上与其它粘舌菌属种类不同。因此认为该菌株为新的粘舌菌属种类，并由本发明人命名为粘舌菌属菌种YJ-9515。

粘舌菌属YJ-9515保存于国际保藏单位，韩国生物科学和生物技术研究院韩国典型培养物保藏中心，并于1996年6月24日收到保藏号KCTC 0252BP。

为了使用粘舌菌属YJ-9515生产ML-236B，该菌株在根据优化方法确定了碳源和氮源的培养基条件中培养。在本发明中使用的培养基含有最佳组合的下列成分。在培养基中所含的碳源是葡萄糖、甘油和麦芽糖，而氮源是玉米浆、蛋白胨、豆胨、豆粉酵母抽提物和NaNO₃，无机盐是MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄。

培养条件如下。

粘舌菌属YJ-9515在摇瓶或发酵器中需氧培养。粘舌菌属YJ-9515在10-36℃温度范围和pH4.0-8.0时生长良好。对于帕瓦它丁前体生产的最佳温度和pH范围分别是25℃,pH5.0-6.0。为了达到使用这种菌株生产ML-236B的最大产量，也需要一些培养基用于保存菌株，预培养和生产培养。

为纯化ML-236B，用乙酸乙酯或二氯甲烷从培养物滤液和细胞团中抽提ML-236B游离酸。并且抽提物在真空中浓缩并在30-70℃内酯化。内酯化的ML-236B在甲醇，乙醇或丁醇中沉淀。得到的ML-236B干燥后为白色晶体。

ML-236B的物理和化学性质与在日本公开号昭和56-12114等中报告的资料相同。

通过以下实施例详细说明本发明，这些实施例不仅是用来作为范例。实施例1

将从韩国南部收集的土壤样品用无菌水在试管中稀释10^-3-10^-6倍。样品在土豆-葡萄糖琼脂(PDA)和Czapak琼脂上铺板。在25℃培养5-10天。

大约4000个分离的克隆接种于含20ml Czapak培养基的125ml锥形瓶中，并于25℃培养7天。实施例2

将从实施例1得到的粘舌菌属菌种YJ-9515(KCTC 0252BP)接种入含50ml培养基的带档板的250ml三角瓶中，并在旋转式摇床上于180-220rpm,25-28℃培养1-2天，所用的培养基含有35g/l玉米浆，5g/l(NH₄)₂SO₄,5g/lMgSO₄,2g/l豆油。

将上述第一次预培养的接种物体积的10％接种入含200ml第二次预培养培养基的带档板的1,000ml三角瓶中，并在旋转式摇床上于180-220rpm,25-28℃培养1-3天，所用的培养基含有10g/l甘油，20g/l麦芽糖浆，30g/l豆胨，10g/l玉米浆，0.5g/l MgSO₄。

将第二次预培养物的10％接种入含400ml生产培养基的带档板的2,000ml三角瓶中并在与第一次预培养相同的条件下培养，生产培养基含有5g/l麦芽糖浆，35g/l蛋白胨，2g/l CaCO₃,5g/l(NH₄)₂SO₄,4.5g/l NaH₂PO₄。

4天后，加入10％(体积/体积)30％葡萄糖溶液，并再培养6天。生产培养期间的pH用1N氨溶液维持在5.0以上。

将10升培养液离心。用2NHCl调节所得上清至pH3.0-3.5，并将ML-236B转变成游离酸形式或内酯化。

如果需要，残留在细胞团中的ML-236B用丙酮或乙酸乙酯抽提。抽提液在真空中浓缩并加入上清中。ML-236B用10升乙酸乙酯重复抽提两次，从水溶液中抽提出来并浓缩。

残留物在氯甲烷中上样到硅胶(筛目大小200-300,200g)柱上。用1,000-1,500ml氯甲烷∶丙酮=8∶1从柱上洗脱ML-236B。于50℃真空中浓缩ML-236B组分至干燥。ML-236B在500ml甲醇中于-20℃沉淀24小时并过滤。通过重新沉淀，得到8,100mg ML-236B白色晶体。所得ML-236B通过加入0.2N NaOH溶液在丙酮中缓慢皂化大约2小时至pH7.0成为钠盐。实施例3

除了用半乳糖取代麦芽糖浆作为碳源，粘舌菌属YJ-9515在与实施例2相同的培养基中生长。与实施例2相比，减少了24小时培养时间，而每单位时间ML-236B的产量增加10-20％。

用0.2N NaOH将10升含ML-236B的培养液调节至pH7.0，并搅拌1-2小时。ML-236B内酯皂化成钠盐形式。将培养液离心，并将上清和细胞团分开。用有机溶剂抽提细胞团中的残留ML-236B并在真空中于40-60℃浓缩。将所得抽提液加入上清中。将ML-236B溶液上样到含1升高分子吸附树脂HP-20(Mitsubishi化学工业产品)的柱中，用2升丙酮洗脱ML-236B。ML-236B在真空中于50℃浓缩。

将残留物溶于20ml水中，上样到100g Sephadex LH-20(Sigma产品)柱上并用50％甲醇溶液洗脱。另一方法，将ML-236B吸附到C₁₈树脂(Yamazen公司产品，200g)柱上，并用50％丙酮溶液洗脱。ML-236B组分被调节至pH7.5并在真空中浓缩。

将浓缩组分溶于40ml水中，并吸附在Diaion HP-20(100ml)中，用300ml 50％丙酮溶液洗脱。得到9,100mg ML-236B晶体。实施例4

第一次和第二次预培养已在前面实施例2中描述。

为了生产培养，用1N NaOH将含50g蛋白胨，12g(NH₄)₂SO₄,30g玉米浆和10g NaH₂PO₄的3,050ml培养基调节至pH6.0，并在121℃灭菌30分钟。将500ml水中的100g玉米浆和500ml水中的5g MgSO₄分别在121℃灭菌15分钟，加入上述培养基中。接种10％的第二次预培养物(40ml)并培养。

培养3-4天后，连续补充1升50％蔗糖溶液作为添加的碳源并且将培养液中葡萄糖的终浓度保持在0.05-0.2％。用1N氨溶液调节培养液的pH至大于5.0。

培养条件是150-600rpm振荡、大于20％的溶解氧和0.5-1.5vvm通气条件，培养时间为10天。ML-236B通过与实施例2相同的方法纯化，并得到4,500mg白色晶体。对照实施例：日本号平成4-349034

第一次和第二次接种培养的培养基含有30g/l甘油，20g/l葡萄糖，8g/l蛋白胨，2g/l NaNO₃,1g/l MgSO₄。将Penicillium citrium ThomSANK 13380接种于含50ml接种培养基的500ml圆底烧瓶中，并于24℃培养2天。

为了生产培养，5升含150g甘油和600g液体Sanmalt的饮用水在121℃灭菌30分钟。在10升水中的300g豆粉，150g蛋白胨，300gHonen,150g骨蛋白粉和15g MgSO₄在121℃灭菌30分钟。并且在30升发酵器中混合上述两种灭菌物质。

接种700ml第二次接种培养物。将10升含1,600g甘油，6,400gSanmalt S的自来水灭菌，并作为碳源连续补充。培养条件是25℃,7.5l/分钟通气条件，0.5kg/cm²内部压力，260-500rpm振荡，3-5ppm溶解氧。

在培养后3-6天，每天加入150ml Sannix PP 2,000培养基，共600ml；并且通过连续加入碳源培养基将培养液的pH保持在4.0。培养液中减少的糖浓度少于1.0％，并且培养持续14天。

用800ml 6N NaOH溶液将40升培养液的pH调节到12并过滤。向滤液中加入850ml 6N HCl溶液至pH5.0。用80升乙酸乙酯抽提ML-236B，并在真空中浓缩。得到50g ML-236B残留物。将残留物溶于500ml乙腈中，并上样到ODS反向柱(ODS reverse phase)上。用70％乙腈洗脱ML-236B。

收集ML-236B活性组分并在真空中浓缩。用1.5体积乙酸乙酸抽提残留物二次并在真空中浓缩。ML-236B在乙醇浓液中沉淀并得到17g白色晶体。实验性实施例

在表1中描述了从对照实施例和实施例2,3得到的ML-236B的物理特征，比如外观、熔点、分子量、元素分析、分子式、紫外光谱、红外光谱、溶解性和特异旋光性。

表1

    项目    实施例2,3    对照实施例外观白色晶体白色晶体熔点(℃)150～152150～152分子量计算值390.2635实验值390.2392实验值390.2392元素分析(％)计算值实验值C 70.74,H 8.77,O 20.49C 70.55,H 8.69C 70.85,H 8.02C70.74,O 20.49,H8.77分子式C₂₃H₃₄O₅ C₂₃H₃₄O₅紫外光谱(nm,MeOH)230,237,246230,237,246红外光谱(cm^-1,KBr)3509,2964,2938,2884,1744,1698,1445,1385,1236,1206,1182,1151,1077,10563509,2964,2938,2884,1744,1699,1445,1385,1236,1206,1182,1150,1076,1056溶解性可溶的不溶的甲醇，氯仿，乙醇，乙酸乙酯水甲醇，氯仿，乙醇，乙酸乙酯水特异旋光性〔α〕_D+283°+283°

在表2和图2中表示ML-236B的¹³C核磁共振数据。

表2

碳原子 序号    δc(ppm)碳原子 序号    δc(ppm)  实施例   对照  实施例  实施例  2.3    对照   实施例 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 171.50 39.31 63.18 36.88 77.22 33.75 24.83 37.66 38.31 68.45 27.06 21.74  170.67  38.44  62.12  35.84  76.26  32.82  23.78  36.67  37.40  67.51  26.30  20.74 C-13 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24  124.48  134.35  128.96  133.49  31.66  14.66    -  177.79  42.56  27.55  12.59  17.74  123.33  133.38  127.96  132.37  30.70  13.64    -  176.55  41.50  26.48  11.49  16.64

通过使用从本发明得到的新微生物，显著地提高帕瓦它丁前体的产量，并且可以在短时间内用简便的方法制备帕瓦它丁前体。

因此，本发明可以有效地用于帕瓦它丁前体的生产。