一种从天麻中提取的抗真菌蛋白及其制备方法

摘要

利用生物技术的方法,主要是液相色谱技术及蛋白质结构分析技术,天麻中分离纯化出一种抗真菌的蛋白质名为GAFP－1,其分子量为10kD,等电点为8.45。从氨基酸组成上看,它富含天门冬氨酸(酰胺)Asx(22.1%)、甘氨酸Gly(10.0%)、亮氨酸Leu(9.4%),只含一个Met，不含Pro。GAFP－1的N端氨基酸序列为SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI。根据这个序列可以合成DNA探针或引物,可克隆出GAFP－1基因,为获得转基因抗真菌农作物打下了物质基础。

说明书

一种从天麻中提取的抗真菌蛋白及其制备方法属于生物化学技术领域。

现有技术：

1．天麻(Gastrodia elata)是兰科名贵的中草药，已有两千年的使用历史，主要用于治疗麻痹、精神病、风湿、瘫痪、高血压和脑神经疼痛，是镇痛镇静药，无副作用。

2．从天麻块茎之中，云南植物研究所胡忠等人于1988年分离出的一种分子量为14kD蛋白(天麻抗真菌蛋白Gastrodia antifungal protein,GAFP或天麻素Gastrodianin)，除抗真菌活性之外，并未证明有其它生物活性。

3．在比利时Katholieke University Leuven的Peumans W.J.和Van DammeE.J.M等人在兰科的许多种植物中分离出一系列生物活性各异的凝集素，其中有的对真菌菌丝生长有抑制作用，有的对同翅目昆虫具杀伤作用，还有的能对人类逆转录病毒(HIV)等的侵染有相当的抑制作用。

发明的目的

1、分离和纯化植物体内特异的抗真菌类蛋白质，对它们进行生理生化特性以及结构和功能的研究分析，主要是拮抗机理的阐明，这在植物基因工程和植物病理学领域具有重要的理论和应用价值。

2、阐明蛋白质的结构与功能在很大程度上要依赖于蛋白质一级结构的分析，通过与已知蛋白质序列的比较可直接推断出未知蛋白的结构功能域，从而得知它的生物学特性；通过遗传密码反推出编码该蛋白质的基因的核苷酸序列，从而为克隆出该蛋白的基因、研究基因的表达与调控提供分子生物学基础，同时为获得转基因抗真菌农作物打下了物质基础。

实施例

1．抗真菌蛋白GAFP-1的分离纯化之一

取100g保存在-70℃冰箱中的天麻次生块茎，清水洗净后取表皮及皮层部组织50g，切成约为1cm的小块，加入4℃ 100ml磷酸缓冲液50mMpH6.5，含0.2MNaCl，在组织匀浆机中匀浆，每次匀浆30sec，停30sec，共20次。

用四层纱布将匀浆物滤过后，于40℃ 6000×g离心20分钟。上清液用45％饱和度的硫酸铵沉淀8小时，4℃。10000×g离心20分钟后取上清液，加入硫酸铵到80％饱和度，4℃过夜沉淀。沉淀被收集后，溶解于50mM,pH5.0的醋酸钠缓冲液之中。离心去除不溶物后，上清液上Sephadex G-25凝胶过滤柱(C26/40)，有活性的部分被收集后上DEAE-纤维素柱(36mm×20cm)，未被吸附的样品收集起来，用70ml超滤罐(Sigma)在PTGC膜(分子量截流值为10.0KD)上，于4℃进行超滤。

蛋白质浓缩液用Sephadex G-50凝胶过滤柱(C16/70)进行分离后，收集活性部分，上CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱，洗脱方式为用含0～0.3M氯化钠的醋酸钠缓冲液(50mM,pH5.0)线性洗脱。收集有活性部分，用4M硫酸铵溶液与它等体积混合，用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系统(Pharmacia)上以含2～0M硫酸铵的醋酸钠缓冲液(50mM,pH5.0)线性洗脱，有活性组分用PD-10 Sephadex G-25M柱进行脱盐。此法可得14mg GAFP-1。

2．抗真菌蛋白GAFP-1的分离纯化之二

按方法一，向经45％硫酸铵沉淀后的上清液加入1M醋酸钠缓冲液(pH5.0)使浓度为50mM，流经DEAE-Sepharose Fast Flow(C10/20)后，直接上Mannose-Sepharose 6B(甘露糖偶联的琼脂糖凝胶6B)(C10/20)，经过含2M硫酸铵的醋酸钠缓冲液(pH5.0,50mM)洗脱和含1.5M硫酸铵的醋酸钠缓冲液(pH5.0,50mM)洗脱，含有GAFP-1组分可用含0.2M硫酸铵的醋酸钠缓冲液(pH5.0,50mM)洗脱下来。此组分用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系统(Pharmacia)进一步纯化，同方法一。

3．抗真菌蛋白GAFP-1的分子特征

经SDS-PAGE电泳分析及Superose12凝胶过滤分析GAFP-1的分子量为10kD。经聚丙烯凝胶等电聚焦电泳分析，GAFP-1是一个等电点pI=8.45的碱性蛋白。

经BECKMAN 121MB Amino Acid Analyzer(氨基酸分析仪)测定GAFP-1的氨基酸组成为：

摩尔百分比氨基酸残基数天门冬氨酸(酰胺)，Asx苏氨酸，Thr丝氨酸，Ser谷氨酸(酰胺)，Glx脯氨酸，Pro甘氨酸，Gly丙氨酸，Ala缬氨酸，Val蛋氨酸，Met异亮氨酸，Ile亮氨酸，Leu酪氨酸，Tyr苯丙氨酸，Phe赖氨酸，Lys组氨酸，His精氨酸，Arg色氨酸，Trp半胱氨酸，Cys    22.1    4.4    7.4    6.0    0    10.0    7.5    4.7    1.3    5.2    9.4    4.5    1.9    1.7    7.4    5.5    1.08(4.0)    20    4    7    6    0    9    7    4    1    5    9    4    2    2    7    5    3^*    1(4)^**    99.99    96(99)

^*色氨酸残基数通过与酪氨酸比较消光值(A288,A280)而测得。

^**经巯基保护后测得半胱氨酸的残基数为4。

经Protein Sequencer(ABI491,USA)蛋白质测序仪测定GAFP-1的N端氨基酸序列为：

SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI

通过国际计算机联网系统，与美国的国家生物信息中心(NCBI)中的多肽序列库比较结果，GAFP-1与兰科的二叶兰(Listera ovata)中的一种甘露糖结合蛋白有75％的相同性，可以推测它们生理功能有很大的相似或相关性。