控制植物中水含量的方法

摘要

本发明提供了控制植物水含量以提供能耐受与水相关之应力的植物的方法。此方法的特征在于将编码植物水通道蛋白的基因有效地导入需要耐受与水相关之应力的植物中。

说明书

发明领域

本发明是1996年10月24日提交的USSN08/736,287的持续申请。

本发明涉及控制植物中水含量以提供能耐受与水相关的应力(stress)，如盐应力或干旱应力的植物。

现有技术

植物不断地处于应力之中，甚至在正常的生长条件下也是如此。这种应力是多种因素引起的，如盐，干旱，高温，低温，强光，空气污染等。从农业的角度看，盐和干旱应力导致最严重的问题，在土壤天然富含盐的地区和灌溉的农场都可以观察到盐应力。目前，10％以上的耕地遭受一定程度的盐应力。为了提高粮食生产，需要在以前被认为不可耕作的土地上载种作物。

干旱应力是由不合时宜的气候和所处的地理位置引起的。在美国，干旱每几年一次引起作物减产。

因此，重要的是发现能耐受与水相关之应力的植物。

在这点上，已知水通道蛋白(下文中有时简称为WCH蛋白)似乎在“植物中水的流动”中起作用。

这些植物WCH蛋白被分成两种，一种位于质膜上，一种位于液泡膜上。一些报道已经公开了这些蛋白的基因。

有关位于质膜上的WCH蛋白的基因，已报道了例如，衍生自豌豆的负责膨压的WCH蛋白cDNA的克隆(植物分子生物学，15,11-26(1990))；衍生自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的负责干燥作用的WCH蛋白cDNA的克隆(植物细胞生理学，33,217-224)；拟南芥的WCH基因(植物学杂志，6,187-199(1994))；番茄的WCH基因(植物分子生物学，24,539-543(1994))；将反义基因导入拟南芥中以证实其在水通道中的功能(植物学杂志，7,87-95(1995))；common ice植物(Mesembryanthemumcrystallinum(龙须海棠属的一种植物))的WCH基因(植物细胞，7,1129-1142(1995))等。另外，衍生自谷物，水稻，球茎甘蓝(Brassica oleracea)，大豆，大麦等的那些WCH蛋白基因也已在基因数据库中登记。

有关位于液泡膜上的WCH蛋白的基因，已报道了例如，衍生自烟草的一个基因(核酸研究，18,7449(1990))；衍生自菜豆的一个基因(植物细胞，2,525-532(1990))；衍生自拟南芥的一个基因(植物生理学，99,561-570(1992))等。另外，衍生自水稻，大麦，大豆，小萝卜(Raphanussativa)，白车轴草(Triforium repens)，苜蓿(Medicago sativa)等的那些WCH蛋白基因也已在基因数据库中登记。

如上所述，目前迫切需要提供能耐受与水相关之应力的植物。得到这种植物的一个方法涉及通过例如基因操作来控制植物的水含量。一般认为通过增加植物的水含量，即增强植物保持水的能力可得到能耐受与水相关之应力的植物。

为了以上述方式得到能耐受与水相关之应力的植物，WO96/00789和自然，379(22),683-684(1996)公开了通过控制植物的水含量得到能耐受与水相关之应力的植物的方法。此方法包括将海藻糖生物合成酶的基因导入植物，从而诱导海藻糖在植物中的合成和积累，通过海藻糖保持水的作用消除水含量的损失。这些文献所公开的内容通过参考文献并入本文。

然而，此方法存在多种问题，即此方法中消耗了通过光合作用所固定的一些碳，从能量消耗的角度看这是不利的。另外，还存在这样的风险，即海藻糖的积累可能会对产物的质量和植物的代谢系统产生不利的影响。

另一方面，据认为上述WCH蛋白可能参与植物中水的流动，然而，迄今为止没有人提出通过使用这些蛋白质可以控制植物中的水含量。

本发明简述

在上述环境中已完成的本发明提供了通过将植物的WCH蛋白基因导入植物中以控制植物中的水含量的方法。

本发明进一步地提供了通过上述方法产生，因此具有受控的水含量的植物。

本发明进一步地提供了由于水含量得到控制而对干旱应力和/或盐应力具有改善的耐受力的植物。

详细描述

现在将要更详细地描述本发明。

本发明的特征在于将植物的WCH蛋白基因导入植物中，从而控制由此转化的植物中的水含量。

本发明中所用的植物WCH蛋白包括位于质膜的WCH蛋白和位于液泡膜的WCH蛋白。尽管编码这两种类型蛋白质的基因都可以用于本发明，但优选使用位于质膜的WCH蛋白的基因。

如上所述，已知编码多种来源的位于质膜的WCH蛋白的基因，所述来源如豌豆，拟南芥，番茄，Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)，谷物，水稻，球茎甘蓝，大豆，大麦等，这些已知的基因可被用于本发明，然而，能用于本发明的WCH蛋白基因并不局限于此，只是优选位于质膜的WCH蛋白的基因。

至于得到位于质膜的WCH蛋白的基因的方法，下文实施例中将描述得到来自Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的基因的方法。另外，通过参考下列文献，可得到来自其它植物的基因。

(1)豌豆(Pisum sativum)(植物分子生物学，15,11-26(1990))。

(2)拟南芥(植物细胞生理学，33,217-224(1992)；植物分子生物学，23,1187-1198(1993)；植物学杂志，6,187-199(1994))。

(3)番茄(植物分子生物学，24,539-543(1994))。

可以以遗传密码在有义方向或反义方向都被翻译的方式将编码本发明所用的植物WCH蛋白的基因有效地(operatively)导入植物。为了增强植物在水应力下保持水的能力，本发明优选将基因以有义方向导入植物，然而，在某些情况下，预期植物中水流动的减少对植物是有利的，因此需要以反义的方向导入基因，这取决于应力的强度，计时或类型。

优选本发明中以有义方向导入植物中的，编码植物WCH蛋白的基因为衍生自能耐受盐应力或干旱应力的植物中的基因，也优选衍生自Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的基因。

另一方面，当基因以反义方向导入植物中时，优选被转化的植物的种尽可能地与从中得到基因的种接近。也优选基因与被转化的植物的种相同。当以反义方向导入基因时，并不总需要导入整个基因，即在一些情况下，通过使用基因的区段即可获得足够的效果，因此，当在本发明中以反义方向导入基因时，需要至少使用基因的一部分。

至于本发明中所用的表达启动子，可使用任何已知的启动子，例如，可使用那些具有强的转录功能并能在任何细胞中诱导基因表达的启动子(35S,19S,nos等)，那些对光敏感的(rbc等)，对温度敏感的(hsp等)，对激素敏感的启动子和那些在特异性组织中有活性的启动子。特别优选的是强启动子，如35S。

在本发明中，不需要使用任何特殊的方法以有义方向或反义方向将WCH蛋白基因导入欲被转化的植物，即可使用任何通常用于转化植物的方法。作为例子，本文将描述使用农杆菌属细菌的叶盘法(leaf disk)。

以有义方向或反义方向将WCH蛋白基因插入适当的植物表达载体中，然后将载体导入属于农杆菌属的细菌。将取自欲被转化之植物的无菌叶的叶盘浸入含有该细菌的培养基中，形成愈伤组织之后，选择发生了转化的愈伤组织，培养之以得到被转化的植物。例如，通过在培养基中加入适当的抗生素以形成愈伤组织，并选择能耐受抗生素的愈伤组织即可进行被转化植物的选择。使用农杆菌属细菌的转化方法不仅仅适用于双子叶植物也适用于单子叶植物，这一点公开于列入本文参考文献的WO94/00977中。

通过本发明转化的植物种，即其水含量被本发明控制的植物不受特别地限制。所述植物的例子包括大豆，谷物，马铃薯，番茄，烟草等，其中优选大豆和谷物。

通过多种方法可测定根据本发明转化的植物的改善的水含量。例如，在有应力的情况下，将生长至某一时期的植物置于例如气候室(climatechamber)中一段时间。然后收集植物的气生部分并称重，随后将植物置于60℃下干燥几天，测量干重。因此，水含量可被表示成鲜重对干重的比率。

为了更详细地进一步阐明本发明，给出下列实施例，然而应理解本发明并不局限于此。

实施例1：从Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)中分离位于质膜上的WCH蛋白的基因

根据加以改动的Ostrem等人的方法(植物生理学，84,1270-1275(1987))，从Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的根组织样本中分离提取总RNA组分，所作的改动如下：

(1)从已经经受400mMNaCl的盐应力处理的植物中提取RNA。

(2)磨碎植物并与提取缓冲液和苯酚一起在冰上振荡1小时。

(3)离心后，将上清液与氯仿一起在冰上振荡1小时。

通过寡dT纤维素柱法纯化poly(A)+RNA，通过cDNA文库的示差筛选得到WCH蛋白的基因，通过根据厂商的说明，使用以上纯化的poly(A)⁺RNA和ZAP-cDNA合成试剂盒可制备所述cDNA文库。在示差筛选中，将两个不同的单链DNA用作探针，即一个由上述poly(A)⁺RNA合成，另一个由以相同方式从未受盐应力处理的植物中分离和纯化的poly(A)⁺RNA合成。由此得到的质粒含有位于质粒pBSK(购自STRATAGENE)的限制性酶切位点EcoRⅠ/XhoⅠ的Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的WCH蛋白基因McMipA。编码衍生自Mesembryanthemumcrystallinum(龙须海棠属的一种植物)的，位于质膜上的WCH蛋白的基因的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在SEQIDNO:1中，阅读框从位于第225-227位的起始密码子ATG延伸自位于第1068-1070位的终止密码子TGA。示差筛选的细节描述于植物细胞，7,1129-1142,1995，“编码水通道蛋白的转录体家族：在common ice植物中的组织特异性表达”，Shigehiro Yamada,MakiKatsuhara,WalterB.Kelly,CristineB.Michalowski和HansJ.Bohnert。

实施例2：构建转化烟草的基因(Nicotianatabacum)

用限制性酶XbaⅠ消化实施例1中所得的，携有位于质粒pBSK的限制性酶切位点EcoRⅠ/XhoⅠ的Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的WCH蛋白基因McMipA的质粒，以分离McMipA基因片断。以mRNA被启动子35S以正方向转录的方向将所述基因片断插入二元载体(binary vector)pBI121(购自Clontech)的XbaⅠ位点中，从而得到基因构建体pBI4C。用限制性酶SmaⅠ和SacⅠ除去pBI121中所含的β-葡糖醛酸酶基因。

实施例3：转化烟草

将在试管中无菌生长的烟草的绿叶切成碎片(1cm∶1cm)，将组织碎片浸入培养基(含有Gamborg氏维生素的Murashige和Skoog基本培养基；购自SIGMA)中，所述培养基中悬浮有根瘤农杆菌LBA4404，该菌携有实施例2中所得的基因构建体pBI4C。然后将碎片置于黑暗中被根瘤农杆菌感染2天，随后将组织碎片移植到琼脂培养基(含有0.8％琼脂的上述培养基)中从而得到再分化的植物，所述琼脂培养基中含有抗生素(100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢氨噻肟)和植物激素(0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤)。将每棵再分化植物的气生部分移植到含有抗生素(100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢氨噻肟)的上述琼脂培养基中，使根长到培养基中。将长出根的植株移植到密闭的温室中，从而得到转化植株自我-授粉的后代。

实施例4：测量在有应力的条件下水含量的变化

在含有100mg/L卡那霉素的上述琼脂培养基中使实施例3中得到的转化植株的种子萌发并生长，直至长出2片真正的叶子。然后将在此时间点不会变白的植物移植到密闭温室中的盆内。使植物生长至长出4片真正的叶子之后，将植物移植到等量的蛭石和水球(Hydroball)的混合物中，在此状态下培养2周，同时以50ml/天的用量浇以4倍稀释的Hoagland氏溶液(购自SIGMA)，然后将植物转移到气候室中(温度：23℃，湿度：70％，光照12小时/黑暗中12小时)。生长几天以适应气候之后，进行应力处理。用100ml(第1天)或50ml(第2天及以后)4倍稀释并含有250mMNaCl的Hoagland氏溶液(购自SIGMA)浇灌盐应力组中的植物。对于干旱应力组则终止浇灌。实验期结束后，收集每棵植物的气生部分并称重，然后将这些植物在60℃下干燥几天并称重。根据结果可测定暴露于应力中的每棵植物的水含量。

表1：盐应力处理

    干重/鲜重    比率^*    水含量(％)    对照    0.1505380    1.000      84.92    1号植株    0.1287313    0.854      87.12    2号植株    0.1215596    0.808      87.84

^*当对照植物的干重/鲜重的比率取为1时，计算出的每棵转化植株

干重/鲜重的相对比率。

表2：干旱应力处理

    干重/鲜重    比率^*    水含量(％)    对照    0.1602564    1.000     83.97    1号植株    0.1274725    0.795     87.25    2号植株    0.1349073    0.842     86.51

^*与表1中所述意义相同。

表1和2中的数据表明被WCH蛋白的基因转化的植物比对照植物的水含量更高。

保持水的能力较强或利用水的效率更强的植物对干旱更加耐受(例如，参考LincolnTaiz和EduardoZeiger，植物生理学，第14章，应力生理学，Benjamin/Cummings出版有限公司)。另外，已知保持水含量的能力是生活在干旱或高盐地区的一般生物的重要问题(例如，参考KentF.McCue等人，TIBTECH-December8,358-362)。以前，解决问题的尝试集中于这样一种方法，其中使植物在其体内积累渗透保护剂以增强其保持水的能力，从而使它们能耐受盐和干旱的应力(KentF.McCue等人，出处同上)。一个这种尝试包括将海藻糖合成酶基因导入植物。

与之相比，本发明的独特之处在于通过实际上不同的方法，即利用WCH蛋白基因改善植物保持水的能力。预期根据本发明方法获得改善的保持水的能力的植物对盐应力和干旱应力更加耐受。

实施例5：从烟草中分离位于质膜上的WCH蛋白的基因

根据加以改动的Ostrem等人的方法(植物生理学，84,1270-1275(1987))，从烟草的叶组织样本中提取总RNA组分，所作的改动如下：

(1)磨碎植物并与提取缓冲液和苯酚一起在冰上振荡1小时。

(2)离心后，将上清液与氯仿一起在冰上振荡1小时。

根据厂商的说明，使用QuickPrepmRNA纯化试剂盒(购自Pharmacia)纯化poly(A)⁺RNA。

为了分离编码WCH蛋白的cDNA，参照实施例1中所述的衍生自Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)的WCH蛋白cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，通过DNA合成仪(由Applied Biosystem)制备引物，引物序列如下：

引物1：GAAGA TCTAT GATCT TTGCC CTTGT TTACT GC(SEQ IDNO:4)

引物2：GTCAG ATCTA GCACG CGACT TGAAT GGAAT AGCC(SEQ ID NO:5)

通过StrataScript^TMRT-PCR+试剂盒(购自STRATAGENE)，通过根据厂商说明使用50ng提取和纯化自烟草的poly(A)⁺RNA和寡dT引物，可合成逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中所用的cDNA模板。

通过使用上述cDNA模板，20pmol上述引物1和2,200mmol

dATP,dGTP,dCTP和dTTP中的每一种，1×PCR缓冲液(购自Takara Shuzo有限公司)和2.5UAmpliTaqDNA聚合酶(购自Takara Shuzo有限公司)，在100ml的总反应体积中进行RT-PCR。反应被进行了32轮循环，循环由91℃1分钟，42℃1分钟和72℃2分钟组成。在1％琼脂糖凝胶中分离PCR产物并用溴化乙锭染色，因此在约550bp的位置处观察到产物。

从凝胶中回收PCR片断，并通过根据厂商说明使用TA克隆试剂盒(购自Invitrogen)，将所述片断亚克隆至质粒pCRⅡ中。

通过373A型DNA测序仪(AppliedBiosystems制造)鉴定所得PCR片断的核苷酸序列。通过根据厂商说明使用TaqDyeTerminatorCycle测序试剂盒(购自AppliedBiosystems)进行反应。在此实施例中，得到了具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的位于质膜上的WCH蛋白之基因的部分cDNA片断。

实施例6：构建转化烟草的基因

通过使用实施例5中得到的基因片断，构建了被导入烟草中的反义基因。用限制性酶SacⅠ和XbaⅠ消化亚克隆至质粒pCRⅡ中的PCR片断，并纯化之。将此片断插入质粒pBI121中通过SacⅠ和XbaⅠ消化形成的位点，由此得到基因构建体pA121。

实施例7：转化烟草

通过与实施例3中所述的基本上相同的方法，用pA121转化烟草。

根据本发明，提供了通过将编码植物水通道蛋白的基因导入植物中以控制植物水含量的方法，因此植物的水含量得以控制，植物能耐受与水相关的应力，从能量的角度看，也不存在由于光合作用所固定的碳的消耗或由于糖类的积累带来的问题所致的任何不利之处，所述不利之处可对产物的质量和植物的代谢系统带来不可预测的影响。

                           序列表(2)SEQ ID NO:1的资料：(ⅰ)序列特征：(A)长度：1272个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅵ)来源：(A)生物体：Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)(ⅸ)特征：(D)其它资料：位于质膜上的WCH蛋白的cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：GAGAGAACTA GTCTCGAGTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTA TTCATAAGAG TTTAATGAAT    60AACATACAAC AACAACATAT TTCACAAATC GAAATTTACA GCAATGATGT AATTAACCTC    120AACTCAAACC ACCACAGTCT CACAGAGCAG CACCAAAAAG AGCATAGCTC ACTGCCTTTC    180TTTCTAGAGA GAGAAACAAG AGAGAGAGAG AAACAAGAGA AGCAATGGAG GGGAAGGAAG    240AGGATGTGAG ACTAGGAGCC AACAAGTTCT CGGAGAGGCA GCCGCTGGGG ACGGTGGCGC    300AGGACAGAGA CTACAGGGAG CCACCGCGCG GCCTCTTTGA GGCCGGCGAG CTGACGTCAT    360GGTCGTTCTA CAGAGCTGGG ATTGCTGAGT TCATTGCTAC CTTCTTGTTC CTCTACATCT    420CTATCTTGAC TGTTATGGGG GTTAATAGGA GTCCCTCAAA GTGTGCCAGT GTTGGAATTC    480AGGGTATTGC TTGGTCTTTT GGTGGCATGA TCTTTGCCCT TGTTTACTGC ACTGCTGGAA    540TTTCAGGAGG TCACATTAAC CCAGCAGTCA CATTTGGGCT ATTCTTGGCA AGGAAATTGT    600CCTTGACAAG GGCAGTCTTC TACATGGTCA TGCAATGCTT GGGTGCCATT TGTGGTGCTG    660GTGTTGTCAA GGGCTTCCAG CACCCCCTAC CAGCTCTTGG GCGGCGGGGC AACTCTGTGA     720ACCCCGGCTA CACCAAGGGA TCAGGCCTTG CGCTGAGATT ATCGGCACTT TTGTTCTTGT     780CTACACCGTC TTCTCCGCCA CTGACGCCAA GCGAACGTAG GGAGTCCCAT GTTCCTATCT     840TGGCTCCATT GCCAATTGGG TTCGCTGTGT TCTTGGTTCA CTTGGCCACC ATCCCCGTTA     900CTGGCACTGG CATCAACCCA GCCAGGAGTC TTGGTGCTGC TATCATTTAC AACAGGCCCC     960ATGCTTGGGC TGACCATTGG ATTTTCTGGG TGGGACCCTT CATCGGTGCA GCACTTGCAG    1020CCCTGTACCA TGTAGTAGTG ATAAGGGCAA TTCCATTCAA ATCCAAGTGA TGATAAGATT    1080TCGAGTGATG ATGAATGATC ATCGGACGGC CAAGATTAAT TGTCGAGGTC TCTAGATGAT    1140AAGATTGGAC CCCCACGTGT CATTTTCCCT AGTTATTTTT ATCTCTCCTT CTGTGTTTGT    1200CTTTTGTACT GTACTAGTTT GTAAAGTTAT GGTGTTTTGG GGTCTCAGAA GAACGTGGGA    1260TGTTTCATGT TT                                                        1272(2)SEQ ID NO:2的资料：(ⅰ)序列特征：(A)长度：284个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅵ)来源：(A)生物体：Mesembryanthemum crystallinum(龙须海棠属的一种植物)(ⅸ)特征：(D)其它资料：位于质膜上的WCH蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：Met Glu Gly Lys Glu Glu Asp Val Arg Leu Gly Ala Asn Lys Phe  1               5                  10                  15Ser Glu Arg Gln Pro Leu Gly Thr Val Ala Gln Asp Arg Asp Tyr

             20                  25                  30Arg Glu Pro Pro Arg Gly Leu Phe Glu Ala Gly Glu Leu Thr Ser

             35                  40                  45Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ile Ala Thr Phe

             50                  55                  60Leu Phe Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Thr Val Met Gly Val Asn Arg

             65                  70                  75Ser Pro Ser Lys Cys Ala Ser Val Gly Ile Gln Gly Ile Ala Trp

             80                  85                  90Ser Phe Gly Gly Met Ile Phe Ala Leu Val Tyr Cys Thr Ala Gly

             95                 100                 105Ile Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Leu Phe

            110                 115                 120Leu Ala Arg Lys Leu Ser Leu Thr Arg Ala Val Phe Tyr Met Val

            125                 130                 135Met Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys Gly Ala Gly Val Val Lys Gly

            140                 145                 150Phe Gln His Pro Leu Pro Ala Leu Gly Arg Arg Gly Asn Ser Val

            155                 160                 165Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Gly Ser Gly Leu Ala Leu Arg Leu Ser

            170                 175                 180Ala Leu Leu Phe Leu Ser Thr Pro Ser Ser Pro Pro Leu Thr Pro

            185                 190                 195Ser Glu Arg Arg Glu Ser His Val Pro Ile Leu Ala Pro Leu Pro

            200                 205                 210Ile Gly Phe Ala Val Phe Leu Val His Leu Ala Thr Ile Pro Val

            215                 220                 225Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser Leu Gly Ala Ala Ile

            230                 235                 240Ile Tyr Asn Arg Pro His Ala Trp Ala Asp His Trp Ile Phe Trp

            245                 250                 255Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Tyr His Val

            260                 265                 270Val Val Ile Arg Ala Ile Pro Phe Lys Ser Lys

            275                 280(2)SEQ ID NO:3的资料：(ⅰ)序列特征：(A)长度：587个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅵ)来源：(A)生物体：烟草(Nicotiana tabacum)(ⅸ)特征：(D)其它资料：位于质膜上的WCH蛋白的cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：GAAGATCTAT GATCTTTGCC CTTGTTTACT GCACTGCTGG TATCTCAGGA GGACACATTA     60ACCCAGCAGT GACATTTGGT CTGTTTTTGG CAAGAAAGTT GTCCTTAACA AGGGCTCTGT    120TCTACATGGT GATGCAGTGC CTTGGTGCAA TCTGTGGTGC TGGTGTGGTT AAAGGTTTCA    180TGGTGGGTCC ATACCAGAGA CTTGGTGGTG GGGCCAACAT GGTTCAACCT GGCTACACAA    240AAGGTGATGG ACTTGGTGCT GAGATTATTG GGACCTTTGT CCTAGTTTAC ACTGTTTTCT    300CTGCCACTGA TGCCAAGAGA AATGCTAGAG ATTCTCATGT CCCTATTTTG GCACCTCTTC    360CTATTGGATT CGCGGTGTTC TTGGTTCATT TGGCCACCAT CCCAATCACC GGAACCGGTA    420TCAACCCCGC CAGGAGCCTT GGAGCTGCTA TCATCTTCAA CCAAGACCAG GCATGGGATG    480ATCACTGGAT CTTCTGGGTT GGACCATTCA TTGGAGCTGC ACTTGCTGCA GTTTACCACC    540AGATAATCAT CAGGGCTATT CCATTCAAGT CGCGTGCTAG ATCTGAC                  587(2)SEQ ID NO:4的资料：(ⅰ)序列特征：(A)长度：32个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4：GAAGATCTAT GATCTTTGCC CTTGTTTACT GC(2)SEQ ID NO:5的资料：(ⅰ)序列特征：(A)长度：34个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：GTCAGATCTA GCACGCGACT TGAATGGAAT AGCC