通过无冷冻的干燥方法进行的稳定生物材料的制剂和方法

摘要

本发明涉及生产含生物活性和特别是治疗活性材料的干燥的部分无定形产物,所述产物是宏观均一物质混合物,所述物质混合物选自所述每组至少一种物质。(i)碳水化合物或有极性残基的两性离子及其衍生物,和(ii)有非极性残基的两性离子及其衍生物,其特征在于从生物或治疗活性材料和物质(i)和(ii)制备一种溶液,并且该溶液在高于该溶液冰点的产物温度被干燥。此外,本发明涉及通过所述方法获得的新物质混合物并涉及其在诊断或治疗方法方面的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及通过无冷冻的干燥方法的稳定生物材料的制剂和方法。专门选出的糖和氨基酸及其衍生物的混合物以及各种氨基酸和其衍生物的混合物被描述，在通过不用冷冻的干燥方法产生干燥的部分无定形(teilamorph)产物之后，它们可被用于达到肽，蛋白质，糖蛋白及类似物质之十分有利的稳定。

目前工艺水平

生产储存稳定的(特别是在室温)生物活性和治疗作用的物质制剂，如为诊断和治疗目的所用的肽，蛋白质，糖蛋白，核苷酸，质粒，细胞碎片，病毒等目前有着巨大的并不断增长的价值。

多种用于生产干燥的生物或治疗活性材料的方法和制剂已有描述。干燥材料被理解为含残留水分最大8％(g／g)，优选4％(g／g)，特别优选至少2％(g／g)。冷冻干燥法被广泛使用但有缺点(Frank，Cryo Lett．11，93-110，(1990)；M．J．Pikal，Biopharm．3(9)，26-30(1990)；M．Hora，Pharm．Research 8(3)，285-291(1992)；F．Franks，Jap．J．Freezing Drying 38，15-16，(1992)]。这些方法消耗大量能量，需要使用制冷剂(Frigene)，其中一些是有害的，并占用大量时间。对为数众多的物质来说，特别是蛋白质，冷冻干燥所必须的冷冻步骤具破坏作用，即去稳定作用。因此这种方法完全不能用于某些生物材料。

代替冷冻干燥产生干燥蛋白质制剂的另外方法是通过使用热和或真空来干燥所述材料的方法[F．Franks，R．M．H．Hatley；Stability and Stabilization of Enzymes；Eds．W．J．J．Vanden Teel，A．Harder，R．M．Butlaar，Elsevier Sci．Publ．1993，pp．45-54；B．Roser，Biopharm．4(9)，47-53(1991)；J．F．Carpenter，J．H．Crowe，Cryobiol．25，459-470(1988)]。这方面的实例是用或不用提高温度的真空干燥，包括结合使用真空和喷雾各种改进的喷雾干燥法以及鼓式干燥和其它薄层干燥法。

在J．F．Carpenter，J．H．Crowe，Biochemistry 28，3916-3922(1989)；K．Tanaka，T．Taladu，K．Miyajima，Chem．Pharm．Bull．39 (5)，1091-94(1991)，DE-C-3520228，EP-B-0229810，WO91／18091，EP-B-0383569，US 5，290，765中描述含糖或糖类物质制剂。在生产干燥的糖制剂时，已发现目前工艺水平所描述的方法中有些问题即：不使用大量的能量就不可能产生真正足够干燥的糖制剂。所述能量特别应用于最终容器中的制剂。用保温／加热来供能是可能的，但必须认为能量对生物材料的稳定性是极有批判性的。另一选择方案是，为用低的热输入达到足够干燥的目的，可大大增加处理时间或使用极薄的层厚度的办法。两个方法均达不到所述目的。长的处理时间经济上不划算，而且活性生物物质长时间存在于仅能缓慢失去水分的基质中是不稳定的因而也是极苛刻的。在许多情况下，薄的层厚度的干燥不产生经济上可行的产品产量，即每单位时间和／或干燥区域内仅得到最小量的产品。此外，在很大的开放干燥区加工生物材料难能在无菌条件下完成，而无菌条件常常是制药和诊断应用所必须的。在低于或稍高于室温的温度下通过真空进行干燥的方法是较适度的。然而，在许多情况，产生干燥的可储存的糖制剂从实践上几乎不可能。在糖溶液被干燥时形成越来越多的粘稠糊状物。保持在在这些材料中的水或残留水分的量不能在一个经济合理的时间内被除去，在许多情况下该干燥过程在不利于稳定的高水平上就进行不下去了。例如降解在储存材料的活性降低，凝集物的形成或通过低分子量降解物的出现而表现出来。适合于蛋白质等稳定的低残留水分可在物理参数的基础上得到鉴定。它按照上面引用的文献进行，适合稳定蛋白质等的制剂应具有玻璃样即一种无定形结构，其玻璃化的转变温度在所设想的储存温度之上。该玻璃化转变温度是无定形固体从玻璃状态转变为浓的粘稠状态和反向转变时的温度。粘度的急剧变化发生在所述过程中并伴随发生该蛋白质和其他分子的扩散系数和动力学迁移率的变化。物理参数如硬度和模量以及状态热力学函数：体积，焓和熵那样发生彻底的变化。例如一种含糖材料的玻璃化转变温度与其残留水分从物理上彼此以此种方式相联系即：增加残留水分的量导致玻璃化转变温度被降低并且反之亦然。因此，玻璃化转变温度的测量，例如通过差相扫描量热计(DSC)，可被用于推导一种制剂是否含适合稳定的残留水分，并如上所述，判定一种干燥方法是否成功。除用DSC测定玻璃化转变温度外，通过X射线衍射研究和光学以及电子显微镜观察也可证明无定形结构的存在。

因此期望为具有高于储存温度的玻璃化转变温度并含低残留水分之生物或制药活性材料提供稳定基质和为高效生产这类稳定基质提供方法。

发明描述

曾经意外发现向含碳水化合物的材料加入有非极性残基的两性离子能以一种正向方式改变其干燥性质即：先前干燥不良并相应没有足够稳定性质的材料现在能迅速被干燥，并产生所设计的生物活性和特别是治疗活性材料的卓越稳定性。

而且曾意外发现含特殊两性离子混合物的无碳水化合物制剂也能被迅速干燥并具有很好的稳定性质。在这种情况下，有极性残基的两性离子必须与非极性残基两性离子一同被使用。这类两性离子优选氨基羧酸及其衍生物并特别优选制药可接受的氨基酸。两性离子被理解为低分子化合物，其分子量低于10kDa并优选低于5kDa。方法被描述，该方法不用高温，即在室温时使本发明制剂以如此方式被干燥以至达到适合于稳定生物和特别是治疗活性物质之制剂的玻璃化转变温度。除治疗活性物质外，生物活性物质还有被用于生物技术加工如发酵中使用的物质。还有那些被用于例如植物保护中的物质即：如杀虫剂。例如这类生物活性并特别是治疗活性材料可选自蛋白质，肽，糖蛋白，脂蛋白，酶，辅酶，生物膜，抗体，抗体片段，病毒，病毒组分，疫苗，DNA，RNA，PNA，质粒，载体，外激素，生物治疗剂和诊断试剂及其衍生物。生物活性物质不被理解为食物以及食物类似物。

本文所述制剂和方法的特殊优点是：

·在干燥期间避免冷冻

·可能在化学-制药业已有的冷冻干燥设备进行干燥而无须任何改装

·特别有利于无菌生产的商用容器例如玻璃瓶的灌装可不加改变地保留

·加工时间具有与冷冻干燥方法同样的数量级并短得多

·可使用毒理学可接受的助剂

·全部必须的能量可被节省并可大大降低环境有害制冷剂的使用

·所得产品是显而易见的“块”，它可被再次溶解

·由于迅速达到部分无定形状态，该生物材料比目前工艺水平所描述的方法降解得少

应注意的是在此描述的，由特定的糖和氨基酸以及特别是至少两个氨基酸的混合物构成的制剂的特殊优点在它们被使用在无冷冻的其他干燥方法框架中仍有效。添加剂加速干燥的作用以及形成部分无定形体系的制剂性质同样出现于喷雾干燥，鼓式干燥等。

如DSC和／或X射线结构分析或其他适当方法所检测到的一个基本特征是存在大量的无定形物质，所述制剂不具完全的结晶特性。就敏感生物物质而言，结晶制剂不适合于达到足够的稳定性。完全的无定形制剂适合于稳定并因此原则上符合本发明，但部分无定形制剂是特别符合本发明的。

图解

图1a：各个麦芽糖-L-苯丙氨酸混合物的玻璃化转变温度

图1b：各个麦芽糖-L-苯丙氨酸混合物的残留水分

图2：真空干燥的粉末衍射图

(a)苯丙氨酸(水分1．2％／结晶)，

(b)麦芽糖(水分4．0％，Tg=50℃)并

(c)以本发明方式制备的苯丙氨酸和麦芽糖(水分0．7％，Tg=88℃)。

用常规仪器(Phillips 1730 X-ray)和配套软件记录衍射图。测定温度是25℃，角分辨率(2θ)0．05°。测定条件：1s／角，40kV管压和40mA电流强度。

图3：时程(time course)

(a)残留水分的

(b)本发明的麦芽糖／苯丙氨酸制剂之玻璃化转变温度的

发明详述

本发明通过13个实施例和10个比较实施例举例说明并解释于下。在此方法中发现通过真空干燥，所述制剂和方法大大促进和加速含糖材料的干燥并且适合于稳定相关的治疗和诊断生物材料。全新的组合物还显示出在保持最佳干燥特性时满足稳定之目的。

这些组合物优选含至少一个有非极性残基的两性离子(例如氨基酸，如苯丙氨酸)和糖，其中糖的玻璃化转变温度通过加入两性离子而被显著增加。各种专门挑选的氨基酸或其衍生物的可选混合物也可被使用。这些混合物包含有非极性残基的两性离子和有极性残基的两性离子。糖也可被加入这些混合物。

如一个作用机制假说，曾发现糖或极性两性离子物质(例如精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，瓜氨酸，赖氨酸)和非极性两性离子物质(例如苯丙氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，色氨酸，胱氨酸)或其衍生物产生本发明的期望结果。修改所述方法和延伸实施例中描述的物质列表是极有可能的。

特别优选的生物或治疗活性材料是抗体(单克隆或多克隆)，酶和人类蛋白质或人类肽例如重组人促红细胞生成素(rh-EPO)，重组人粒细胞集落刺激因子(rh-G-CSF)或重组纤溶酶原激活剂(rPA)，nGF，PTH，ularitides，质粒，病毒，GUP，BP-5。

无活性物质的制剂被用于确定加入的氨基酸以何种方式改变糖基质的干燥。实施例1表明加入苯丙氨酸和精氨酸到麦芽糖中促进麦芽糖的干燥性质，该性质取决于这些添加剂的加入量。在同样条件下专门加入这些助剂使玻璃化转变温度被提高65K以上并且相应的残留水分易于被减少到1％以下。实施例1显示在此情况下所使用的方法在48小时内导致所需要的结果而完全不用任何加热。根据本发明没有加入所述助剂的麦芽糖在上述条件下含7-8％的残留水分，玻璃化转变温度(Tg)在室温以下，因此所述体系不适合稳定蛋白质等。

生产包含蔗糖和选自符合本发明的适合产生稳定的，部分无定形产物的氨基酸之本发明制剂能避免用含蔗糖制剂的某些缺点，同时蔗糖固有的优点可充分发挥出来。与本文提到的其他糖比较，蔗糖在适当标准的水分时有相对低的玻璃化转变温度。因此，在生产含蔗糖的干燥制剂时特别难于得到远高于预期储存温度的高玻璃化转变温度。此外，难于通过蒸发干燥转变蔗糖成无定形形式，该糖易于结晶化并因此易于形成不利于稳定活性生物物质的结晶结构。此外，可观察到在储存期间无定形蔗糖块相对迅速的形成大量的结晶并在一定储存期之后可完全结晶化。在此方法中，这类制剂还失去其稳定性质。伴随蔗糖的使用的所有这些问题，风险和缺陷可通过按本发明加入适当的氨基酸来消除。在此方面，苯丙氨酸和精氨酸(实施例2)的使用是特别优选的。在比较实施例A中，表明纯糖块不能被有效干燥，甚至在使用较长的干燥期亦如此。氨基酸的促进干燥作用可用个别氨基酸以及用氨基酸混合物来达到。实施例3和4用麦芽糖和蔗糖体系产生相应于此目的之结果。还被发现不具有促进干燥的作用的氨基酸例如组氨酸(比较实施例B)。实施例5显示除氨基酸外，其结构相关的衍生物也可有促进干燥作用。在实施例6，特殊氨基酸的选择以详细但非限制性方式或完全说明性方式被描述。应注意的是迄今除仅有的特殊氨基酸外并非每个氨基酸都导致所期望的作用。所述作用的程度也各不相同以至可提到特别优选的组合物或制剂。它们是上述所有的苯丙氨酸，色氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。而且从实施例1和实施例6可推断有可能混合氨基酸而同时保留促进干燥作用。单独的精氨酸没有积极效果但在与苯丙氨酸混合后确有此效果。

在真空干燥期间氨基酸的性质被研究以确定在没有糖基质时是否也能通过高于室温的玻璃化转变温度的氨基酸得到制剂。意外的发现纯氨基酸本身仅形成结晶结构，而某些氨基酸盐和氨基酸混合物形成玻璃样基质(比较实施例C和实施例7)。为产生无定形结构，有必要专门挑选不同的氨基酸。意外的发现氨基酸可被分成有明显不同性质的两组。有必要从每组中选出至少一种氨基酸并产生相应的混合物并使之干燥。如在糖-氨基酸混合物的制剂中那样，在此情况下亦有必要给出某种混合比例以得到符合本发明的制剂(实施例7)。然后用适合稳定活性生物物质的无定形成分得到基质。

就稳定生物活性物质如例举的蛋白质来说，促进干燥的效率在实施例8-12和比较实施例D-J中被详尽证明。实施例8和9与比较实施例D-G一起描述rh-G-CSF的稳定，实施例10和红细胞生成素的比较实施例H以及实施例11和12及比较实施例I与J描述乳酸脱氢酶的稳定。与无助剂和其他制剂的真空干燥制剂相比本发明制剂的极大促进储存稳定作用在蛋白质(rh-G-CSF，实施例8和9以及比较实施例D，E和F，G)，糖蛋白(rh-EPO，实施例10和比较实施例H)和酶(LDH，实施例11，12和比较实施例I与J)的储存期的基础上被举例。在各种温度的储存条件下各种rh-G-CSF制剂的改变被显示在所述实施例中。只有本发明制剂如部分无定形玻璃样制剂在几度的Celsius(冰箱)到40℃(实施例8和9)的储存温度范围内经六个月后显示无明显降解。无助剂的相应真空干燥制剂显示在室温和增加的储存温度(40℃)下单体明显降低20％。无定形，但非浓的粘性制剂已显示在室温下5周后其单体明显降低(比较实施例D+E)。结晶制剂(比较实施例G和J)在一定的储存期后也有明显显示。与实施例8和比较实施例E比较可见加入氨基酸到麦芽糖作为稳定剂在增加的储存温度(40℃)下延长了储存期，在此温度不足10％的单体G-CSF聚集10倍以上。将比较实施例G与实施例9比较显示氨基酸的选择对大大延长储存期也起决定作用。糖蛋白EPO中的单体比例的比较(实施例10，比较实施例H)显示在室温和提高的储存温度下本发明制剂比无助剂的真空干燥EPO优越的多。5周储存的敏感酶LDH作为本发明制剂(实施例11和12)与无助剂的真空干燥LDH(比较实施例I)和结晶制剂(比较实施例J)比较显示只有本发明制剂能被储存在室温或较高储存温度(30℃)而无大幅度活性丧失。在此方面，通过本发明制剂在制备样品后立即提高了所述酶的稳定(与无助剂制剂的65％比较和与结晶制剂的10％比较，0周的活性大于80％)是值得注意的。本发明混合物的干燥方法的典型时程在实施例13中被举例说明。为产生至少两个氨基酸的本发明混合物以获得快速干燥玻璃样制剂必须从下面两组的每一组中选出至少一个氨基酸和其衍生物：

组1：精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，瓜氨酸，赖氨酸，鸟氨酸

组2：苯丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸，色氨酸，乙酰苯丙氨酸乙酯，胱氨酸，肌氨酸。

仅使用只来自两组中之一组的一种或数种氨基酸不产生符合本发明的有利制剂。如所举例的，通过将各种数量的含非极性残基的两性离子例如苯丙氨酸或其衍生物与生物或治疗活性物质的稳定剂溶液混合可发现本发明的物质混合物。然后用DSC检查室温干燥的所述混合物是否具有已被两性离子添加剂提高了的玻璃化转变温度。在此方法中，该玻璃化转变温度与无本发明添加剂的制剂相比增加了10K，优选20K并特别优选40K。根据本发明，有利的制剂是部分无定形的，有4℃以上的玻璃化转变温度，优选20℃以上并特别优选40℃以上并含低于6％，优选低于4％的相应残留水分。它们对应于堆积密度的表观密度是至少10％，优选高于相应的冷冻干燥盐的50％。它们保持脆性，玻璃样，紧密，部分无定形结构至少两周，优选两个月并特别优选一年。此外，它们的干燥时间(即在此时间达到同样的残留水分)优选被减少25％，特别优选在与仅含一个碳水化合物或非极性残基两性离子的物质混合物相比所用时间的一半或甚至四分之一。这些物质混合物还可被研磨或被加工例如用于与普通助剂和载体结合的治疗剂或诊断试剂。治疗剂是除普通助剂和添加剂之外还含一个或数个治疗活性试剂的治疗制剂。它们可以片剂，胶囊或固体物质存在，通过加入液体(例如无菌水或缓冲液)从其制备治疗活性溶液(灌输液)。此外它们特别适合于作为固体物质通过各种方法给药，例如作为鼻喷雾剂，吸入或透皮粉末等。

实施例1

麦芽糖-L-精氨酸-L-苯丙氨酸混合物的真空干燥

以每毫升50毫克麦芽糖一水化物和0．1毫克多乙氧基醚80的含量制备溶液。按等比例(g／g)增量加入L-精氨酸和L-苯丙氨酸到该溶液中。按此方式制备的溶液被过滤除菌(0．22微米硝酸纤维素滤器)然后每一毫升溶液被装入2毫升瓶管中并盖上冷冻干燥瓶盖。按此方法制备的样品在减压下以同样方式在20℃被真空干燥48小时。干燥后，按照Karl-Fischerz法确定样品的水含量并且玻璃化转变温度通过差热分析(Perkin Elmer DSC7-样品加热速率=10K／分钟)被确定。检测结果显示一定量的氨基酸的加入改变了麦芽糖的干燥性质。每氨基酸7．5毫克以上，样品水含量明显降低并且玻璃化转变温度相应提高。L-精氨酸和L-苯丙氨酸每种10毫克即达所述值，进一步提高干燥产品中的氨基酸比例该值不被增加。增量氨基酸被加入到每毫升含50毫克麦芽糖一水化物和0．1毫克多乙氧基醚80的糖溶液中。干燥后得到的产物所具有的水分和玻璃化转变温度被描述在此。

表1：

L-精氨酸(毫克／毫升)L-苯丙氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)007．6812．86117．9512．472．52．57．7112．91557．7513．677．57．53．5552．0410100．5480．5712．512．50．7673．14

实施例2：

蔗糖-L-精氨酸-L-苯丙氨酸混合物的真空干燥

L-精氨酸和L-苯丙氨酸以等比例(克／克)增量被加入到每毫升含50毫克蔗糖和0．1毫克多乙氧基醚80溶液中。如实施例1对该样品进行制备，干燥和分析。用最高可达10毫克的每种氨基酸得到完全结晶的产物。在每毫升10毫克以上的L-精氨酸和10毫克以上的L-苯丙氨酸才能鉴定出有玻璃转变温度的部分非结晶产物。在此实施例中不仅溶液的干燥性质被加入氨基酸所促进而且该体系通过所述加入而被转变成部分非结晶状态。增量氨基酸被加入到每毫升含50毫克蔗糖和0．1毫克多乙氧基醚80的糖溶液中。干燥后得到的产物具有的水分和玻璃转变温度被描述于此。

表2：

L-精氨酸(毫克／毫升)L-苯丙氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)002．97结晶111．11结晶2．52．53．46结晶556．11结晶10103．4318．5615151．5353．7020201．6058．78

比较实施例A

纯糖溶液的真空干燥

制备浓度为50毫克／毫升的麦芽糖一水化物与蔗糖的溶液。然后按实施例1的描述过滤，灌装和分析这些糖溶液。可显示出甚至在减压下在50℃干燥72小时仍不可能干燥2毫升瓶管中的50毫克糖到满意的残留水分以至玻璃化转变在25℃以上。该麦芽糖产物具有粘性一致和6．4％的残留水分。玻璃化转变是在20℃。在蔗糖的情况，仍存在6．0％的残留水分，玻璃化转变在14℃。作为比较，纯糖溶液也在减压下在20℃干燥48小时。得到的产物甚至更湿并且因此玻璃化转变甚至低于样品干燥的50℃。此实验清楚表明通过用真空干燥的办法只有加入一定的氨基酸才可能干燥注射瓶或类似容器中的糖层到低的残留水分。因此，搞清了通过加入氨基酸促进干燥的性质。

表3：干燥   麦芽糖残留水分  玻璃化转变温度  蔗糖残留水分 玻璃化转变温度50℃72小时   6．4％        20．0℃        6．0％        14．0℃20℃48小时   8．9％         6．1℃        9．3％        -1．8℃

实施例3：

麦芽糖-L-苯丙氨酸和麦芽糖-L-异亮氨酸混合物的真空干燥

在此实验中，制备氨基酸和麦芽糖一水化物的双混合物。期望检测在此情况使用的氨基酸是否有促进干燥的作用并检测各个氨基酸的数量如何决定促进干燥的效果。增量L-苯丙氨酸或L-异亮氨酸被加入到含每毫升50毫克麦芽糖一水化物的溶液中。以此方式制备的溶液被过滤除菌(0．22微米硝酸纤维素滤器)然后每套1毫升的该溶液被灌装入2毫升瓶管中并盖上冷冻干燥瓶盖。以此方式制备的样品在减压下20℃真空干燥48小时。干燥后，按Karl-Fischer法以一式四份对每个样品的水分进行测定并通过差热分析(Perkin ElmerDSC7-样品加热速率=10K／分钟)测定每种混合物的两个样品的玻璃化转变温度。

a．麦芽糖-L-苯丙氨酸的结果

所测定的结果清楚显示L-苯丙氨酸对麦芽糖干燥性质的正影响。在约50℃恒定的干燥条件下，少量L苯丙氨酸已经足够提高糖玻璃的玻璃化转变温度(图1a和1b)。在10毫克／毫升L苯丙氨酸时促进的干燥效果达到最大。加入更大量的L-苯丙氨酸不能达到进一步促进。因此，与纯麦芽糖相比，加入L-苯丙氨酸使玻璃化转变温度提高约80℃。在此实验中清楚可见用大量的L-苯丙氨酸(10-20毫克／毫升)没有干燥性质的明显不同。然而，缩短干燥期改变这种状况。在此情况下，在10-20毫克／毫升范围内增量L-苯丙氨酸亦可见到玻璃化转变的增加。表4显示糖溶液中的L苯丙氨酸的量和导致的残留水分以及玻璃化转变温度Tg。

表4：

L-苯丙氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)08．916．153．2162．87．50．9577．7101．1286．0150．9985．2200．9988．2

此外，真空干燥苯丙氨酸，麦芽糖以及苯丙氨酸和麦芽糖的本发明混合物的粉末衍射图被记录下来(图2a．2b．2c)。纯苯丙氨酸显示结晶物质的典型衍射图(图2a)，而麦芽糖显示无定形物质衍射图(图2b)。只有在本发明混合物的情况形成部分无定形结构，所述结构作为分立的衍射畸峰在宽的背景信号上清晰可见(图2c)。

b．麦芽糖-L-异亮氨酸的结果

加入各种量的L-异亮氨酸到每毫升含50毫克的麦芽糖一水化物的储备液中并各自混合物在20℃干燥。用增量氨基酸促进的干燥效果是清晰可见的。加入20毫克／毫升的L-异亮氨酸(以重量百分比5∶2比例混合)使麦芽糖产物的玻璃化转变温度提高约20℃。表5显示糖溶液中的L-异亮氨酸的量和导致的残留水分以及玻璃化转变温度Tg。

表5：

异亮氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)08．916．157．8413．7107．5217．7156．7719．4205．3424．7

实施例4：

蔗糖-L-亮氨酸的真空干燥

在以下实验中制备含各种氨基酸的蔗糖双混合物。其目的是检测是否所使用的氨基酸有促进蔗糖干燥的作用。加入增量的L-亮氨酸到含每毫升50毫克的蔗糖溶液中。按实施例3中描述的方法处理该溶液。

蔗糖-L-亮氨酸的结果

用少量L-亮氨酸，蔗糖形成结晶产物。在实施例2中用L-精氨酸和L-苯丙氨酸也观察到这类结晶的形成。因此，当蔗糖与一定的氨基酸混合时形成结晶产物。纯蔗糖以及与高比例的L亮氨酸的混合物形成有玻璃化转变的体系。这意味着部分结晶结构的存在。这意味着仅浓度超过15毫克／毫升的L-亮氨酸促进纯蔗糖的干燥性质并意味着通过加入该氨基酸可使玻璃化转变温度提高约18℃。因此L-亮氨酸是有促进干燥作用的氨基酸。表6显示糖溶液中L-亮氨酸的量和导致的残留水分以及终产物的玻璃化转变温度Tg。

表6：

L-亮氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)09．34-1．856．23crystalline106．50crystalline155．8116．4205．0216．1

比较实施例B

蔗糖-L-组氨酸混合物的真空干燥

该实验按实施例4中的描述进行。用L-组氨酸代替L-亮氨酸。在真空干燥时，蔗糖-L-组氨酸混合物形成无定形产物，其中没有发现促进干燥作用。该结构干燥不好，不依赖于混合比例并且该混合物的残留水分和玻璃转换与纯蔗糖的结果等级相同。结果，L-组氨酸没有促进干燥作用。表7显示蔗糖中L-组氨酸的量和导致的残留水分以及该终产物的玻璃化转变温度Tg。

表7：

L-组氨酸(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)09．34-1．8511．23-1．4209．78-2．6

实施例5：

蔗糖-L-色氨酸和蔗糖-N-乙酰基-L-苯丙氨酸乙酯(APE)混合物的真空干燥

在本实验中制备每毫升含10毫克L-色氨酸的溶液和每毫升含3毫克APE的溶液(APE在水中只有有限的溶解度)。蔗糖以增量被加入到两溶液中。按实施例3中的描述处理并干燥用此方法得到的溶液。作为本实验的一个比较在同样干燥条件下干燥一蔗糖溶液(50毫克／毫升)。在终产物中有残留水分9．98％和玻璃化转变温度-6．25℃。

a．表8显示L-色氨酸中的蔗糖数量(10毫克／毫升)和导致的残留水分以及该终产物的玻璃化转变温度。表8：

蔗糖(毫克／毫升)残留水分( ％)玻璃化转变温度(℃)203．3937．30404．1922．51605．3714．44

b．表9显示在APE溶液中蔗糖的数量和导致的残留水分以及该终产物的玻璃化转变温度。表9：

L-蔗糖(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度(℃)106．1513．3408．331．4

该结果显示两种被检测物质，L-色氨酸和APE，表现出促进干燥作用。用L-色氨酸在恒定的干燥条件下无定形产物的玻璃化转变温度可被增加约45℃。用APE在恒定的干燥条件下，可提高玻璃化转变温度20℃。

实施例6：

其他糖-氨基酸混合物的真空干燥

在本实验中用一种L-氨基酸制备麦芽糖一水化物或蔗糖的双混合物。此时，以糖对氨基酸为5∶2到∶1的重量比例加入氨基酸到所述糖溶液中。目的是检测是否各自氨基酸与相应的糖一起显示促进干燥作用。按实施例4中的描述制备处理和干燥所述溶液。详细描述的是以下混合物：

a．含麦芽糖一水化物的混合物表10：

使用的氨基酸氨基酸的量(毫克/毫升)  糖的量  (毫克/毫升)  残留水分(％)  玻璃化转变温度  [℃]    -    -  50  8.91  6.1  L-精氨酸  10  50  8.10  10.3  L-精氨酸  20  50  8.63  7.1  L-亮氨酸  20  50  5.42  20.9  L-亮氨酸  20  20  1.87  56.05  L-组氨酸  20  50  9.78  5.3  L-异亮氨酸  20  20  3.12  37.9  L-甲硫氨酸  15  30  7.45  9.7  L-甲硫氨酸  20  20  2.70  34.4  L-缬氨酸  20  20  4.93  18.8

b．含蔗糖的混合物表11

使用的氨基酸氨基酸的量(毫克／毫升)糖的量(毫克／毫升)残留水分(％)玻璃化转变温度[℃]--509．34-1．8L-丙氨酸15305．042．8L-丙氨酸20204．4611．7L-甘氨酸20204．475．3L-苯丙氨酸20501．1262．7L-丝氨酸153011．77-15．1L-丝氨酸202010．61-14．4

所述干燥的结果显示L-组氨酸对糖的干燥性质没有正影响(表10)。L-丝氨酸甚至进一步阻碍糖的干燥(表11)。L-亮氨酸，L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸有促进干燥作用(表10)。当这些氨基酸的增量被加入到所述糖溶液中时其作用就变得明显了。L-缬氨酸和L-丙氨酸被发现只在产物中有大量氨基酸时才促进干燥；L-精氨酸和L-甘氨酸有弱的正影响。L-苯丙氨酸对所述干燥性能的极好的影响在有蔗糖的双混合物中也表现出来(表11)。该产物干燥得好并有很高的玻璃化转变。

比较实施例C

氨基酸溶液或氨基酸盐溶液的真空干燥

制备各自氨基酸或各自氨基酸的盐的溶液并通过过滤(0．22微米硝酸纤维素滤器)除菌。将各溶液分装到2毫升瓶管中并用冷冻干燥瓶盖盖好。以此方式制备的样品在减压下20℃真空干燥48小时。干燥后按照Karl-Fischer法测定样品的水含量并通过差热分析(Perkin Elmer DSC7-样品加热速率=10K／分钟)测定玻璃化转变温度。以下溶液是被干燥并得到所描述的残留水分和DSC测定结果：

a．氨基酸表12：氨基酸           浓度            残留水分  DSC测定

     (摩尔／升)(毫克／毫升)    (％)    结果(℃)L-丙氨酸   0．24      21．38       0．81    结晶L-精氨酸   0．24      41．80       0．52    结晶L-瓜氨酸   0．24      42．05       4．9     结晶L-半胱氨酸 0．24      29．08       2．61    结晶甘氨酸     0．24      18．02       0．76    结晶L-组氨酸   0．12      18．62       0．77    结晶L-异亮氨酸 0．12      15．74       1．10    结晶L-亮氨酸   0．12      15．74       1．62    结晶L-赖氨酸   0．24      35．09       0．79    结晶L-甲硫氨酸 0．12      17．91       1．57    结晶L-苯丙氨酸 0．12    19．82    1．53    结晶L-脯氨酸   0．24    27．63   19．93    结晶L-丝氨酸   0．24    25．22    0．44    结晶L-苏氨酸   0．24    28．59    0．45    结晶L-缬氨酸   0．24    28．12    0．57    结晶

b．氨基酸盐表13：

氨基酸浓度pH值残留水分DSC测定结果(摩尔/升)(毫克/毫升)   [％] [℃]L-精氨酸盐酸 0.25 0.30 43.5  5 10.93 2.70 6.46  3.51 L-精氨酸磷酸 0.25 0.15 43.55 14.70 6.81 3.3  5.17 L-精氨酸硫酸 0.25 0.15 43.55 14.71 2.89 3.24  6.67 L-精氨酸  硝酸 0.25 0.30 43.55 18.90 2.58 2.66  结晶L-精氨酸醋酸 0.25 0.30 43.55 18.0 5.24 11.04  结晶L-天冬氨酸氢氧化钠 0.12 0.12 15.97 4.8 4.97 9.65  27.7 L-谷氨酸氢氧化钠 0.12 0.12 17.66 4.8 5.14 14.69  5.5 L-鸟氨酸盐酸 0.24 40.47 5.39 0.4  结晶

该结果显示真空干燥后，氨基酸以结晶形式存在。在其被干燥期间，只有硷性和酸性氨基酸的盐形成无定形结构，然而它们干燥得十分差并且在选择条件下它们的玻璃化转变温度在室温以下。

实施例7：

L-精氨酸-L-苯丙氨酸混合物和L-精氨酸-L-异亮氨酸混合物的真空干燥

在此实验中，按比较实施例C中的方法制备，处理，干燥和检测L-精氨酸和L-苯丙氨酸的各种混合物。特别是制备和干燥以下双混合物：表14：

克分子混合比例L-精氨酸(摩尔/升)(毫克/毫升)L-苯丙氨酸(摩尔/升)(毫克/毫升)残留水分(％)玻璃转变温度 [℃] 1∶1 0.12 20.90 0.12 19.82 2.27  59.5 2∶1 0.16 27.87 0.08 13.21 9.32  1.7 3∶1 0.18 31.35 0.06 9.91 9.40  2.8 4∶1 0.192 33.44 0.048 7.928 9.96  1.3 5∶1 0.20 34.83 0.04 6.61 10.73  0.0 6∶1 0.206 35.88 0.034 5.61 10.03  1.3 7∶1 0.21 36.58 0.03 4.96 11.38  1.0 1∶2 0.06 10.45 0.12 19.82 2.85  47.2 1∶3 0.04 6.97 0.12 19.82 3.43  46.2 1∶4 0.03 5.23 0.12 19.82 3.66  43.45

此实验显示通过混合若单独干燥则导致结晶产物的两个氨基酸，有可能产生部分结晶结构。在所选的混合比例中，它们干燥得很好以至产生有高玻璃化转变温度和低残留水分的部分结晶结构。

有趣的是存在最高玻璃化转变的一个最佳比例。在此实验中，制备进一步含0．15摩尔／升L-精氨酸和L-异亮氨酸的溶液。表15：

克分子混合比例  L-精氨酸  [摩尔/升][毫克/毫升]  L-异亮氨酸  [摩尔/升][毫克/毫升]  残留水分  [％]  玻璃化转  变温度  [℃]  1∶1  0.15     26.13  0.15    19.68  1.05  53.27

此时，产生的产物有53．27℃的玻璃化转变和1．5％的残留水分。通过混合两种氨基酸，有可能构成可易于被干燥的部分无定形结构；与矿酸的精氨酸盐比较(比较实施例C)，该玻璃化转变温度被提高约50℃。

实施例8：

在含L-精氨酸和L-苯丙氨酸的麦芽糖制剂中真空干燥rh-G-CSF

制备每毫升含50毫克麦芽糖，10毫克L-苯丙氨酸和10毫克L精氨酸的溶液。此外，该溶液含0．1毫克多乙氧基醚80和0．35毫克rh-G-CSF。该制剂的pH值被盐酸调到pH7．4。在无菌条件下制备该由蛋白质组成的溶液并通过(聚二氟乙烯滤器0．22微米)过滤除菌。然后在每套实验中，1毫升该溶液被分装到2毫升瓶管中。然后在减压下在20℃将有冷冻干燥瓶盖的分装好的瓶管等温干燥48小时。所得干燥产物有1．16％残留水分和75℃的玻璃化转变温度。用此方式制备的样品被储存在各种温度并且在各个时期评估所述蛋白质的稳定性。

在rh-G-CSF的实验中，生产产物中所形成的二聚体的比例是评估该蛋白质的稳定性的良好标准。因此，通过排阻层析法(每个条件下单独4次测定)所确定的单体和二聚体的量是对我们通过干燥法产生的制剂之稳定作用的一种测量。在排阻层析中，蛋白质分子按照其粒子大小被分开即高分子成分(二聚体)被与rh-G-CSF单体分开。该检测(HP-SEC)是在Shinadzu的HPLC系统上用一种可冷冻的自动取样器(Waters TM 717)进行的。TosoHaas公司的TSK凝胶G2000SW(7．5x300)柱被用做分离柱。214nm(Shinadzu photometer LC-GA)分光光度检测被分开的成分。0．1m的磷酸钠钾缓冲液，pH6．2，被用做流动溶剂，在室温下该溶剂以0．6毫升／分钟的流速被应用。以重新制备初始液(加入1毫升)的方式用水溶解要检测的样品。然后将这些被溶解的样品储存在冷冻到6℃的自动取样器中直到检测。注射样品的量是20微升(=7微克G-CSF)，样品流动时间是32分钟。用G-CSF工作标准评估结果。为另外定量评估该产物，另外进行银染色SDS凝胶电泳以用于每份定量测定。SDS凝胶电泳的结果被显示在实施例8b图9。在水溶液中，该蛋白质在45℃和47℃数小时内完全变性。用此制剂有可能稳定该蛋白质数周，甚至是在50℃的储存温度。

a．rh-G-CSF在含L精氨酸和L-苯丙氨酸的经真空干燥的麦芽糖制剂中的稳定性。

表16：HP-SEC中得到的单体成分以％表示

储存期(周)储存温度KS RT 30℃ 40℃ 50℃  0    -  99.83％   -     -     -  5  99.94％  99.93％  99.86％  99.89％  99.87％  13  99.83％  99.86％  99.88％  99.83％  99.83％  26  99.76％  99.75％  99.55％  99.36％  99.21％  39  99.68％  96.73％  96.40％  93.81％  89.27％  52  98.34％  94.81％  94.70％  91.27％  86.27％

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

排阻层析结果清楚显示所述制剂能使蛋白质rh-G-CSF在一个较长时间内在这类真空干燥的制剂中稳定。该实验表明在真空干燥的，特别是含L-精氨酸和L-苯丙氨酸的部分无定形麦芽糖制剂中，在玻璃化转变温度以下稳定rh-G-CSF是可能的。

b．含活性物质rh-G-CSF的全部制剂的SDS凝胶电泳的结果综述。

首先制备含SDS的聚丙烯酰胺凝胶，含15％丙烯酰胺的分离胶和含3％丙烯酰胺的收集胶以及1％的十二烷基磺酸钠(SDS)。样品的制备是用3个注射瓶制备1个样品。然后，用含二巯基苏糖醇(DTT)和溴酚蓝的样品缓冲液稀释该样品溶液从而使rh-G-CSF终浓度为150微克／毫升。使该样品在95℃预加热的加热板上变性5分钟。用Boehringer Mannheimde层析分子量18000-300000用的Combithek校准蛋白作为校准蛋白质。它们如同rh-G-CSF样品一样被精确的制备和处理。此外，制备出用于比较的rh-G-CSF工作标准。用Midget凝胶电泳单元(Pharmacia-LKB 2050)和相配套的电压仪进行凝胶电泳。电泳缓冲液被装满后，加入20微升样品(即3微克rh-G-CSF)到每个凝胶槽中。在关闭凝胶电泳室并开启水冷却后使用80伏电压，在通过收集胶后该电压提升到130伏。在溴酚蓝快到达凝胶末端之前终止电泳。从电泳室中移出凝胶并用重蒸水简单冲洗。然后按照配套的指导用Daiichi 2D银染II试剂盒进行银染。染色完成后，眼估凝胶。

表17：凝胶电泳结果泳道    制剂                            观察结果1    校准蛋白质2    实施例8：含L-精氨酸和L-苯丙氨酸    只有单体

 的麦芽糖制剂3    比较实施例D：无助剂的干燥          单体和二聚体4    比较实施例E：纯麦芽糖制剂          单体，二聚体和三聚体5    校准蛋白质6    实施例9：含L-精氨酸和L-苯丙氨酸    只有单体

 的无糖制剂7    比较实施例F：含磷酸的L-精氨酸制剂  单体和二聚体8    比较实施例G：结晶L-缬氨酸-L-甘氨   单体，二聚体和

 酸制剂                             降解产物

在此研究中实施例8和9的制剂只显示单体。在比较实施例D和F中除单体外还有二聚体，而在实施例E中额外测到三聚体。在比较实施例G的结晶L-缬氨酸-L-甘氨酸中还见到分子量小于单体的两个降解产物和分子量在单体和二聚体之间的2条降解产物弱带。

此敏感方法能使以大于1％数量存在的单体降解产物和聚集产物被很清楚的观察到。

比较实施例D

无附加助剂之rh-G-CSF的真空干燥

在此实验中，制备稀释磷酸缓冲液(约0．01m)中仅含0．35毫克／毫升浓度蛋白质rh-G-CSF的溶液。如实施例8中的描述制备，处理和分析该蛋白质溶液。在该制剂中，因为技术原因，不可能测定终产物的残留水分和玻璃化转变温度。无助剂的真空干燥rh-G-CSF的稳定性资料。表18：在HP-SEC中得到的单体数量用％表示

储存期(周)储存温度KSRT40℃0-97．84％-594．90％94．53％93．96％1391．31％89．66％78．23％2680．06％73．60％52．22％

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

纯蛋白质的稳定性资料很清楚的显示了实施例8中描述的制剂的助剂之稳定作用。针对该制剂还在每个研究中用银染色进行了SDS凝胶电泳。结果见实施例8b。

比较实施例E

在纯麦芽糖制剂中真空干燥的rh-G-CSF

制备每毫升含50毫克麦芽糖一水化物，0．1毫克多乙氧基醚80和0．35毫克rh-G-CSF的溶液。用氢氧化钠溶液调节该制剂的pH值到7．4。如实施例8中的描述制备，处理和分析初始溶液和终产物。如实施例1中已经显示的没有加入氨基酸就难于在48小时之内干燥麦芽糖到低的残留水分。因此，形成的产物有10．43％的残留水分和-2℃玻璃化转变温度。在储存温度中即玻璃化转变温度以上，无脆性玻璃存在而代之以高粘性粘物质。在无氨基酸真空干燥的麦芽糖制剂中rh-G-CSF的稳定性。表19：在HP-SEC中得到的单体数量用％表示储存期(周)储存温度

储存期(周)储存温度KSRT30℃40℃50℃0-97．99％---598．26％96．82％93．91％67．45％42．63％1397．15％90．49％73．70 ％30．05％18．52％2697．05％88．23％71．32％22．30％15．27％

SDS凝胶电泳的结果见实施例8b。该结果显示在没有氨基酸的糖物主体中储存rh-G-CSF是不利的。该稳定性远小于在真空干燥的主体(比较实施例D)中和在最佳化的真空干燥制剂(实施例8)中。

本实验清楚显示了为获得有高玻璃化转变的产物，在真空干燥时加入氨基酸到糖中，然后通过辅助剂的无定形支持结构稳定其中的蛋白质的必要性。在玻璃化转变温度下储存该产物证明对活性物质的稳定是必要的。还应注意到在那些已经储存在40和50℃的样品中4周后麦芽糖就完全结晶。在储存期间的样品中的物理变化应可避免；这些变化加快了单体成分的降低。

实施例9：

真空干燥的无糖L-精氨酸-L-苯丙氨酸制剂中的rh-G-CSF

制备每毫升含20毫克L精氨酸和20毫克L-苯丙氨酸，0．1毫克多乙氧基醚80和0．35z毫克rh-G-CSF的溶液。在用盐酸调pH值到pH7．4后，按实施例8中的描述处理，干燥和分析该溶液。在干燥完成后，出现有玻璃化转变温度为77．0℃并残留水分为1．30％的均一产物。在真空干燥的精氨酸-苯丙氨酸制剂中rh-G-CSF的稳定性。表20：HP-SEC中获得的单体的数量被表示

储存期储存温度(周)KSRT30℃40℃60℃80℃0-99．57％----499．36％99．36％99．50％99．81％96．56％1．44％1399．17％99．31％99．40％99．64％--2698．64％98．62％96．52％91．06％--3999．64％94．18％88．99％79．05％--

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

稳定性检测的结果清楚显示若储存温度明显低于玻璃化转变温度(仍参见比较实施例C)，该制剂能使rh-G-CSF蛋白质在部分无定形真空干燥氨基酸制剂中长期被稳定。在80℃储存与在60℃储存比较显示所述现象与77℃时的玻璃化转变有关。

为另外评价该产品，进行银染色的定量SDS凝胶电泳以确定各产物含量。该SDS凝胶电泳结果被显示在实施例8b中。在各种温度下同样的制剂亦被储存一年。所述结果在表20a中被给出。

   水含量(％)   Tg(℃) 单体含量G-CSF(％)初始    0．77       82．1        99．8252周后：

KS1．2079．5298．34RT2．0869．4794．8130°2．2167．9194．7040°2．3267．3691．2750°2．4068．6386．26    KS=冰箱温度=4-6℃    RT=室温=20-22℃

实验显示在低于玻璃化转变温度的真空干的部分无定形L-精氨酸-L-苯丙氨酸制剂中稳定rh-G-CSF是可能的。

比较实施例F

真空干燥的含磷酸L-精氨酸制剂中的rh-G-CSF

制备每毫升含40毫克L-精氨酸，0．1毫克多乙氧基醚80和0．35毫克rh-G-CSF的溶液。用磷酸调pH值到pH7．4后，按实施例8中的描述处理，干燥和分析该溶液。所述最终干燥的产物含3．59％的残留水分和8．6℃的玻璃化转变温度。因此，在室温完成干燥后，所述产物作为一种高粘性粘塑块出现而非作为一种脆性无定形玻璃出现。真空干燥的L-精氨酸制剂rh-G-CSF的稳定性。表21：HP-SEC中获得的单体的数量以％表示

储存期(周)储存温度-20℃KSRT30℃40℃60℃80℃0--99．60％----499．57％99．60％99．37％99．34％99．20％89．46％31．81％1399．75％98．17％98．06％97．31％93．41％--3399．28％99．30％99．21％97．86％93．02％--

用干燥的部分无定形玻璃所得到的样品没有达到同样的稳定效果(实施例8和17)。这显示出细致混合助剂的重要性以便在真空干燥期间促进它们的干燥性质从而在室温得到部分无定形块。这在室温(30℃和40℃)时尤其明显。与真空干燥的无助剂的活性物质比较，在这种材料中该稳定性得到增加(见比较实施例D)。为另外评估该产物，用银染色进行定量SDS凝胶电泳以确定各产物含量。所述SDS凝胶电泳结果在实施例8b中给出。

比较实施例G

在结晶L-缬氨酸甘氨酸制剂中真空干燥的rh-G-CSF

加入每毫升0．35毫克rh-G-CSF到每毫升含20毫克L-缬氨酸和甘氨酸以及0．1毫克多乙氧基醚80的溶液中并用氢氧化钠溶液调所述溶液的pH值到pH7．4。按实施例8中的描述处理，干燥和分析所制备的溶液。干燥后的测定显示所制备的样品是一种含0．82％残留水分的结晶产物。在真空干燥的结晶L-缬氨酸-甘氨酸制剂中rh-G-CSF的稳定性。表22：HP-SEC中获得的单体的数量以％表示储存期  储存温度

储存期储存温度(周)KSRT30℃40℃60℃80℃0-94．36％----489．93％89．66％84．26％72．47％44．54％27．44％1374．14％73．91％64．90％43．82％--3373．75％70．04％54．93％40．40％--

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

所述结果清楚显示结晶氨基酸制剂甚至在低残留水分时亦不能稳定rh-G-CSF。当与无助剂的真空干燥rh-G-CSF相比时这类制剂的去稳定作用就清楚的被显示出来(见比较实施例D)。

为能评价该产物，用银染色进行SDS凝胶电泳以确定各产物含量。该SDS凝胶电泳的结果在实施例8b中给出。

实施例10：

在含L-精氨酸和L-苯丙氨酸的蔗糖制剂中红细胞生成素的真空干燥

制备每毫升含50毫克蔗糖，10毫克L-精氨酸和L-苯丙氨酸以及0．1毫克多乙氧基醚20的溶液。加入5000单位红细胞生成素(EPO)到该溶液中并用磷酸调pH值到pH7．2。按实施例8的描述处理和干燥该溶液。所产生的干燥的部分无定形产物含0．56％的残留水分并具有86．6℃的玻璃化转变温度。在EPO实验中，在所生产的产物中形成的二聚体比例是该产物稳定性评估的良好标准。因此，通过排阻层析法测定的单体和二聚体的量是对我们通过干燥制备的制剂之稳定作用的一种测量。

在排阻层析中，蛋白质分子以溶解状态在其颗粒大小的基础上被分开即高分子成分(二聚体)被与EPO单体分开。该检测(HP-SEC)是在Shinadzu的HPLC系统上用一种可冷冻的自动取样器(GilsonAbimed 231)进行的。TosoHaas公司的TSK凝胶G3000 SWXL(7．8x300mm)柱被用做分离柱。在280nm处(Merck荧光分光光度计820FP)分光光度检测被分开的成分。含氯化钠的0．41m的磷酸钠钾缓冲液，pH7．3，被用做流动溶剂，在室温下该溶剂以0．6毫升／分钟的流速被应用。以重新制备初始液(加入1毫升)的方式用水溶解要检测的样品。然后将这些被溶解的样品储存在冷冻到6℃的自动取样器中直到检测。注射样品的量是100微升(=2微克EPO)，样品流动时间是25分钟。用EPO工作标准评估结果。

在含L-精氨酸和苯丙氨酸的真空蔗糖制剂中EPO的稳定性。表23：HP-SEC中获得的单体的数量以％表示储存期(周)储存温度

储存期(周)储存温度KSRT40℃0-100％-4100％100％100％9100％100％100％13100％100％100％26100％100％99．9％

RT=室温=20-22℃

该结果显示用在此实验中选择的助剂制剂进行真空干燥可稳定EPO。为另外定量评估所述产物，用银染色进行SDS凝胶电泳以确定各产物含量。凝胶准备，电泳方法和染色均按实施例8b的描述进行。以从3份注射瓶准备一份混合样品的方式准备样品。随后用含溴酚蓝的样品缓冲液稀释所述样品溶液到EPO终浓度为20微克／毫升。在预热的加热板上使样品在95℃变性5分钟。用“Bio-Rad Standard Low”作为校准蛋白质。制备与处理完全与EPO样品相同。此外，准备一份用做比较的EPO工作标准。用Midget凝胶电泳单元(Pharmacia LKB2050)和配套的电压仪进行凝胶电泳。在该装置被充满电泳缓冲液后，将20微升样品(即400ngEPO)充填到每个凝胶孔中。染色完成后肉眼观察凝胶并给凝胶照相。使用此敏感方法，可使以大于1％量存在的降解和聚集产物清楚可见。

电泳结果

在本文所述制剂中，在9周后的全部样品中，只有相应于所述工作标准的单体带在凝胶中被检测到。这强调了所述样品中蛋白质的稳定性。

比较实施例H

真空干燥无加入助剂的红细胞生成素

在此实验中，制备的初始溶液在稀释磷酸缓冲液(约5mM)中仅含活性EPO(50000单位／毫升)。按实施例8的描述制备，处理和干燥该溶液。

在该试剂中，因为技术原因，确定终产物的残留水分和玻璃化转变温度是不可能的，因为存在于瓶管中的量太低(约0．2毫克)。用如实施例10中描述的排阻层析法评估该蛋白质的稳定性。

无助剂的真空干燥EPO的稳定性表24：HP-SEC中获得的单体的数量以％表示

储存期(周)储存温度KSRT40℃0-99．5％-498．6％94．4％88．0％996．0％89．0％75．0％1395．7％87．0％76．3％2694．7％88．2％66．6％KS=冰箱温度=4-6℃RT=室温=20-22℃

为每个含量的确定进行了SDS凝胶电泳银染色。凝胶制备，样品制备，电泳方法和凝胶染色均按实施例10中的描述进行。染色凝胶后，除对应于工作标准带的单体带外，可清楚检测到每个储存温度的全部样品中的二聚体带。所述实验清楚显示了实施例10中使用的助剂组合物的稳定作用。在所述样品中纯活性物质的稳定性与实施例10制剂中的活性物质的稳定性比较明显被降低；可以观察到二聚体的形成。储存温度越高，实验10中选择的助剂组合物的保护作用就越明显。

实施例11：

含麦芽糖-L-精氨酸和L-苯丙氨酸制剂中真空干燥的乳酸脱氢酶。

制备每毫升含50毫克麦芽糖一水化物，10毫克L-精氨酸和10毫克L-苯丙氨酸的溶液。加入乳酸脱氢酶(LDH)到所述溶液中从而得到165单位／毫升的蛋白质活性。用磷酸调该溶液的pH值到pH7．0。按实施例8中的描述制备，处理和干燥该溶液。干燥后，出现具有96℃玻璃化转变温度和0．82％残留水分的均一产物。终产物被储存在各种温度并在各种储存期后评估蛋白质活性。在LDH的实验中，酶活性被用作为蛋白质稳定性的一种测量。用分光光度法进行此项确定。在样品溶液中，通过LDH的催化反应丙酮酸和NADH被还原成乳酸和NAD。溶液中NADH含量的降低可从分光光度上被检测出(λ=365nm；ε=3．4平方厘米／微摩尔)。在一个塑料比色杯中检测100倍-200倍稀释的初始液中的活性(光径长度=1厘米)(Perkin Elmer552 UV／VIS分光光度计)。通过每时间单位的降低可计算LDH的蛋白质活性。在含L-精氨酸和L-苯丙氨酸的真空干燥麦芽糖中LDH的稳定性。初始溶液活性相当于100％值。表25：给出的是如试验中获得的以％表示的活性

储存期(周)储存温度KSRT30℃40℃50℃0-85．3％---587．91％87．4581．15％80．42％64．42％1383．28％79．41％78．79％61．74％-

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

该实验清楚显示每个敏感蛋白质LDH制剂的稳定作用。

比较实施例I

无加入助剂的乳酸脱氢酶的真空干燥

在本实验中，在稀释磷酸缓冲液(8毫摩尔)中制备有136单位／毫升的纯活性物质乳酸脱氢酶(LDH)溶液。按实施例8中的描述制备，处理和干燥该溶液。在所述制剂中，由于技术原因，不可能确定终产品的残留水分和玻璃化转变温度，因为在瓶管中存在的量太低(约0．2毫克)。按实施例11中的描述评估蛋白质稳定性。无助剂的真空干燥LDH的稳定性。初始溶液的活性相当于100％值。表26：给出的是如试验中获得的以％表示的活性

储存期(周)储存温度KSRT40℃0-64．52％-566．54％23．03％1．57％1350．63％6．81％0％

KS=冰箱温度=4-6℃

RT=室温=20-22℃

所述实验清楚显示实施例11中使用的助剂组合物的稳定作用。在所述样品中纯活性物质的稳定性远低于实施例11的组合物中的活性物质的稳定性。储存温度越高，实施例11中所选择的组合物的保护作用就越明显。纯蛋白质与助剂中的干燥蛋白质稳定性的差别在LDH是最显著的。

实施例12：

无糖的真空干燥L-精氨酸-L-苯丙氨酸制剂中的乳酸脱氢酶

制备每毫升含20毫克L精氨酸-L-苯丙氨酸的储备液。用硫酸调pH值到pH7．0后，加入乳酸脱氢酶(LDH)到所述溶液中从而得到蛋白质活性为168单位／毫升的初始溶液。按实施例8中的描述制备，处理和干燥该溶液。干燥后出现有103．9℃玻璃化转变温度和1．18％残留水分的均一产物。最终样品被储存在各种温度并在各储存时期评估所述蛋白质活性。蛋白质分析按实施例11中的描述进行。真空干燥的无糖L-精氨酸-L-苯丙氨酸-丙氨酸制剂中LDH的稳定性。干燥前初始液活性相当于100％值。表27：给出的是如试验中获得的以％表示的活性

储存期(周)储存温度KSRT30℃40℃60℃0-80．36％---479．70％82．08％79．34％77．62％70．54％1382．25％76．11％75．21％73．06％-

该实验清楚显示含盖整个研究的温度范围期间所述氨基酸的稳定作用。与干燥纯活性物质比较LDH稳定性明显提高(比较实施例I)。

比较实施例J：

结晶真空干燥的L-缬氨酸-甘氨酸制剂中的乳酸脱氢酶

制备每毫升含20毫克L缬氨酸和20毫克甘氨酸的储备液。用氢氧化钠溶液调pH值到pH7．0后加入乳酸脱氢酶(LDH)到所述储备液中以使初始溶液合147单位／毫升的蛋白质活性。按实施例8中的描述制备，处理和干燥该溶液。干燥后，出现一含1．12％残留水分的均一完全结晶的产物。最终样品被储存在各种温度并在各储存期后按实施例11中的描述评估所述蛋白质活性。真空干燥的完全结晶L-缬氨酸-甘氨酸制剂中LDH的稳定性。干燥前初始溶液活性对应于100％值。表28：给出的是如试验中获得的以％表示的活性。

储存期(周)储存温度

表28(续)

KSRT30℃40℃60℃0-9．26％---53．69％2．11％1．09％0．80％0．0％130．08％0．01％0％0％0％

该实验清楚显示结晶氨基酸制剂在真空干燥期间对所述酶有很强的负影响。甚至在意味着结晶构架(kristallin Gerüst)形成的干燥期间已丧失90％的活性。甚至在各种温度下储存时仍存在的活性都无法保留。5周后，所述样品的初始值进一步恶化。因此，完全结晶的氨基酸制剂根本不适合稳定LDH。

实施例13：

在本实验中，一种纯麦芽糖溶液(50毫克毫升)和一种含麦芽糖和苯丙氨酸(40毫克／毫升麦芽糖和10毫克／毫升苯丙氨酸)的溶液被真空干燥。与其平行制备类似制剂，向其中加入10微克／毫升rh-ngf或100微克／毫升PTH(1-37)或500微克／毫升Ularitide。在制备之后，所述溶液被无菌过滤并分装入2毫升瓶管。所述样品在20℃真空干燥并在预设时间间隔后从两种制剂取样。确定这些样品中的残留充填物量，根据Karl-Fischer确定的水含量和Tg。在整个干燥期间保持20℃平版温度。室中压力逐步降低到约10^-3mbar。在两种制剂中，瓶管的充填物重量在7小时内降低到初始值的6％，所述溶液浓缩得十分迅速。在纯麦芽糖制剂中，开始形成过饱和溶液，然后变成橡胶样状态。与纯糖溶液相比，在进一步干燥过程中含苯丙氨酸制剂大量减少时可见到少许优点。当麦芽糖样品的干燥被完成时约5．5％的原始充填物重量仍存在于瓶管中，而用麦芽糖-苯丙氨酸混合物约4．9％的充填物量仍存在于瓶管中。

当观察样品中水含量的变化而不是充填物重量的变化时，所述结果甚至变得更明显。在干燥过程的初期所述溶液包含95．08％的水即：每瓶管中含约965毫克。所述目的是达到含1-2％残留水分的干产物。就50毫克固体来说，1-2％相当于每瓶0．5-1毫克水。相应的，为得到干产物，在干燥期间必须从样品升华出约99．95％的水。在干燥过程的早期阶段，样品的水含量根据Karl Fischer法确定。对含苯丙氨酸的样品，通过直接将样品引入甲醇溶液中进行所述方法。十分浓的糖不能直接转移到甲醇溶液。首先将其溶于无水DMF。然后确定该溶液的水含量。图3a显示按此方法进行的残留水确定的结果。含氨基酸制剂的优点显而易见。仅17小时的干燥后所述残留水分就已降低到2．7％，而在麦芽糖制剂中仍是13．59％。该结果显示出含苯丙氨酸溶液的优点。在这些加工条件下不可能在48小时内干燥麦芽糖。所述干燥完成后，含可观残留水分的“橡胶”在室温下仍存在。所述各个样品的玻璃化转变温度由DSC法确定，残留水分除外。由于玻璃化转变温度直接对应于样品的水含量，含麦芽糖-苯丙氨酸的混合物呈现出明显增加的值。该结果显示约10小时后，氨基酸-糖混合物的Tg已在平板温度范围内。相应的测量值在图3b中给出。由于在此阶段在干燥加工中仍有极少的水蒸发，产物温度也在平板温度范围内。因此，干燥加工10小时后，在室温下玻璃已出现在瓶管中。就用这类制剂稳定蛋白质来说意味着10小时后该蛋白质已镶嵌在一块稳定的玻璃中。因此，蛋白质出现在浓缩的溶液或“橡胶”形式中的时间很短，这对活性物质稳定性来说有很大好处。相反，在室温下干燥完成后，纯糖仍作为“橡胶”存在并因此对含蛋白质产物来说对活性物质没有稳定作用。

在其他物理参数上，各种含蛋白质制剂与没有活性的基本制剂的参数没有差别。