莫拉氏菌属(MORAXELLA)运铁蛋白之受体蛋白

摘要

莫拉氏菌属菌株,尤其是粘膜炎莫拉氏菌的经分离和纯化的未变性运铁蛋白之受体蛋白,经SDS－PAGE测定其表观分子量约为80—90kDa。运铁蛋白之受体蛋白或其片断类似物可用于诊断应用和免疫原性组合物中,尤其是可体内施用于宿主以保护宿主抵抗由莫拉氏菌属引起的疾病。

说明书

                     发明领域

本发明涉及免疫学领域，具体地涉及莫拉氏菌属运铁蛋白之受体蛋白，其生产方法和用途。

                     发明背景

中耳炎是最常见的幼儿疾病，所有儿童中，大约80％在3岁前至少患过一次中耳炎(ref．1-在本申请上下文中，引用了诸多参考文献以更完整详尽地描述与本发明有关的现有技术，每次提到的文献资料全部列于说明书的结尾，即紧接权利要求书之前，这些公开发表的参考文献在此引入，作为本发明的参考)。慢性中耳炎可导致儿童听力，语言和认识能力的损害。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(约50％)，非典型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(约30％)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)(约20％)的感染可导致慢性中耳炎。仅在美国，每年通过抗生素和外科手术治疗中耳炎需花费10-20亿美元，上述外科手术如扁桃体切除术，增殖腺切除术和鼓膜切开导管插入术。由于中耳炎多发于语言技巧快速发展的年龄段，已证实在经常患有中耳炎的儿童中存在与学习和听觉特异性相关的发育残疾。

粘膜炎莫拉氏菌主要聚居于呼吸道，是一种主要的粘膜病原体。对通过鼓膜穿刺术得到的中耳液的培养物所作的研究表明：约20％的中耳炎病例是由粘膜炎莫拉氏菌引起的(ref．2)。

长期以来，粘膜炎布兰汉氏菌被认为是条件病原体，但现在认为局部或全身性(较少见)感染粘膜炎布兰汉氏菌的结果会导致多种潜在的使人衰弱的疾病。

粘膜炎莫拉氏菌是成人下呼吸道感染的重要病原体，尤其是在慢性支气管炎和肺气肿的发作中更是如此(ref．3，4，5，6，7，8和9)。粘膜炎莫拉氏菌也会导致儿童和成人患窦炎(ref．10，11，12，13和14)，偶尔会导致侵害性疾病(ref．15，16，17，18，19和20)。在医院的环境中，粘膜炎莫拉氏菌已被怀疑与院内感染的突然爆发有关(ref．21)。

由粘膜炎莫拉氏菌引起的中耳炎发病率正逐年增加，由于预防由肺炎球菌和非典型流感嗜血杆菌引起的中耳炎的方法比较完善，粘膜炎莫拉氏菌作为中耳炎病原体的相对重要性有望进一步提高。而且，粘膜炎莫拉氏菌临床分离物的抗药性也越来越常见(ref．22)。1970年以前未曾报道过能产生β-内酰胺酶的粘膜炎莫拉氏菌菌株，但从70年代中期开始，在分离物中能越来越经常地检测到表达β-内酰胺酶的菌株，最近的调查显示75％的临床分离物能产生β-内酰胺酶。

铁抑制是宿主抗微生物病原体的一般性防御机制，但却不能限制所有病原体的生长速率(ref．23)。包括脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(ref．24)，淋病奈瑟氏球菌(N．gonorrhoeae)(ref．25)和流感嗜血杆菌(ref．26)的大量细菌种类可表达两种能与人运铁蛋白特异性结合的外膜蛋白(ref．27，28)，这些蛋白的表达受生长环境中铁含量的调节。与其它细菌种类的受体不同，粘膜炎莫拉氏菌受体对载铁的(即铁-)运铁蛋白具有优先亲和性(ref．29)。粘膜炎莫拉氏菌的两种运铁蛋白受体(TfR)的分子量是115kDa(TfR1)和约80-90kDa(TfR2)(ref．27)。

外膜蛋白OMP B2(ref．30，31)的分子量与TfR2的近似，据报道OMP B2的表达受铁的调节(ref．32)。

Yu和Schryvers(ref．29)描述了通过使用变性剂盐酸胍从运铁蛋白-琼脂糖凝胶亲和柱上选择性地洗脱，以从粘膜炎莫拉氏菌中纯化运铁蛋白之受体蛋白TfR1和TfR2的方法。

在这种分离制备受体蛋白的方法中，通过加入EDTA至终浓度20mM，十二烷基肌氨酸钠至0．75％，使粗制的铁缺乏的粘膜炎莫拉氏菌膜悬浮液溶解，再于20，000×g下将混合物离心15分钟以除去碎片。在上清液中加入20ml Fe₂hTf-琼脂糖凝胶(即人运铁蛋白的铁饱和形式)，室温下搅拌温育45分钟。混合物上柱，除去结合溶液后，用含有250mM盐酸胍，50mM Tris-HCl，1M NaCl，20mM EDTA，0．75％十二烷基肌氨酸钠，pH8．0的缓冲液250ml洗树脂柱。使用含有1．5M盐酸胍的缓冲液(不含十二烷基肌氨酸钠)洗脱TfR2蛋白，随后通过使用含有4M盐酸胍的缓冲液来洗脱TfR1蛋白。洗脱组分在50mM Tris-HCl，pH8．0条件下透析24小时。

在此方法的进一步改进形式中，将apohTf-琼脂糖凝胶与溶解的膜制品混合以结合TfR1，然后将经处理的溶解的膜制品暴露于Fe₂hTf-琼脂糖凝胶中以结合剩余的TfR2。按上述方法洗涤亲和树脂洗脱受体蛋白。

粘膜炎莫拉氏菌感染可导致严重的疾病。下列作法可能是有利的：即提供得自粘膜炎莫拉氏菌的未变性运铁蛋白之受体蛋白以用作包括疫苗的免疫原性制品中的抗原，其它抗原和免疫原的载体和用于产生诊断试剂。

                     发明概述

本发明旨在提供粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)和其它莫拉氏菌属菌株经纯化和分离的的运铁蛋白之受体蛋白，所述蛋白的表观分子量约为80-90kDa。

根据本发明的一个方面，提供了莫拉氏菌属菌株分离纯化的，未变性运铁蛋白之受体蛋白，或其片断，或其类似物(TfR2)，所述蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，表观分子量约为80-90kDa。运铁蛋白之受体蛋白基本上保持其原有的构象(以基本上保持莫拉氏菌属菌株运铁蛋白之受体蛋白特有的免疫原性)，并可以从粘膜炎莫拉氏菌菌株中分离得到，所述菌株如粘膜炎莫拉氏菌4223，5191或135。这种经分离和纯化的表观分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白基本上不含莫拉氏菌属非80-90kDa蛋白质，尤其是莫拉氏菌属菌株的OMP B2蛋白和表观分子量约为105 kDa的运铁蛋白之受体蛋白，莫拉氏菌属的磷脂和脂多糖。约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白至少约为70wt％纯，优选至少约为90wt％纯，并可以其水溶液的形式存在。

本发明也提供了一种含有免疫有效剂量的活性成分的免疫原性组合物，所述有效成分可以是运铁蛋白之受体蛋白或其片断或其类似物，此处它与一种可作药用的载体一起提供。免疫原性组合物可被配制成疫苗以体内用于宿主，从而保护宿主抵抗由莫拉氏菌属菌株，尤其是粘膜炎莫拉氏菌引起的疾病。免疫原性组合物可被配制成微粒胶囊，ISCOM或脂质体制品。免疫原性组合物可与靶向分子联合使用以被输送到免疫系统的特异性细胞或粘膜表面。一些靶向分子包括如WO 92／17167(BiotechAustralia Pty．Ltd．)所述的品系B12和细菌毒素的片断，如美国专利5，194，254(Barber等人)所述的单克隆抗体。本发明的免疫原性组合物(包括疫苗)可进一步包括至少一种其它的免疫原性或免疫刺激物，免疫刺激物可以是至少一种佐剂。适宜用于本发明的佐剂包括(但不限于)磷酸铝，氢氧化铝，QS21，Quil A，其衍生物和组分，磷酸钙，氢氧化钙，氢氧化锌，糖脂类似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，聚磷腈(poly-phosphazene)和脂蛋白。佐剂的优化组合描述于1994年6月16日递交的共同未决的美国专利申请流水号08／261，194中，此申请已转让给受让人，其公开内容在此引入，作为参考。本发明进一步包括针对本文提供的运铁蛋白之受体蛋白的抗体，通过用本文提供的免疫原性组合物免疫宿主即可产生所述抗体。

本文提供的免疫原性组合物可被配制成含有至少一种另外的免疫原，该免疫原可含有或衍生自副粘病毒属，衣原体，脊髓灰质炎病毒，乙型肝炎病毒，白喉类毒素，破伤风类毒素，流感病毒，嗜血杆菌属，百日咳毒素，肺炎链球菌，分枝杆菌和甲型肝炎病毒。

本发明的另一方面提供了一种在宿主体内产生免疫应答的方法，包括给宿主施用免疫有效剂量的本文所提供的免疫原性组合物。免疫应答可以是体液或细胞-介导的免疫应答。被赋予抵抗疾病之保护作用的宿主包括灵长类动物，所述灵长类动物包括人。

本发明的另一方面提供了生产疫苗的方法，包括给试验宿主施用本文所提供的免疫原性组合物，以测定保护宿主抵抗由莫拉氏菌属菌株引起的疾病所需施用的运铁蛋白之受体蛋白的量和频率，根据所测定的施用量和频率，将运铁蛋白之受体蛋白配制成适于给被治疗的宿主施用的形式。被治疗的宿主可以是人。

本发明的另一方面提供了测定样品中存在的能与莫拉氏菌属菌株的分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白特异性反应的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将样品与本文提供的运铁蛋白之受体蛋白接触以产生复合物，该复合物含有运铁蛋白之受体蛋白和样品中存在的能与该蛋白特异性反应的任何所述抗体；和

(b)测定产生的复合物。

本发明的另一方面提供了测定样品中存在的莫拉氏菌属菌株的分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用本文提供的免疫原性组合物免疫受试者，以产生针对运铁蛋白之受体蛋白的特异性抗体；

(b)将样品与抗体接触以产生复合物，该复合物含有样品中存在的任何外膜蛋白和所述外膜蛋白的特异性抗体；和

(c)测定产生的复合物。运铁蛋白之受体蛋白可以是粘膜炎莫拉氏菌菌株的部分。

本发明的另一方面提供了测定样品中存在的能与莫拉氏菌属菌株的分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白特异性反应的抗体的诊断试剂盒，该试剂盒中包括：

(a)本文提供的运铁蛋白之受体蛋白；

(b)将运铁蛋白之受体蛋白与样品接触以产生含有运铁蛋白之受体蛋白和样品中存在的任何所述抗体的复合物的工具；和

(c)测定产生的复合物的工具。

本发明还提供了测定样品中存在的莫拉氏菌属菌株的分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白的诊断试剂盒，该试剂盒中包括：

(a)针对本文提供的约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白的特异性抗体；

(b)将抗体与样品接触以产生含有运铁蛋白之受体蛋白和运铁蛋白之受体蛋白-特异性抗体的复合物的工具；和

(c)测定产生的复合物的工具。

本发明的另一方面提供了生产疫苗的方法，所述方法包括给试验宿主施用本文所提供的免疫原性组合物，以测定保护宿主抵抗由莫拉氏菌属菌株引起的疾病所需施用的组合物的量和频率，所述莫拉氏菌属菌株可产生运铁蛋白之受体蛋白，经SDS-PAGE测定，该蛋白的表观分子量约为80-90kDa，或者也可产生能在试验宿主体内诱导能与运铁蛋白特异性反应的抗体的蛋白质；根据已测定的施用量和频率，将免疫原性组合物配制成适于给被治疗的宿主施用的形式，被治疗的宿主包括人宿主。

本发明的另一方面提供了生产单克隆抗体的方法，所述单克隆抗体特异针对莫拉氏菌属菌株的表观分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白，所述方法包括：

(a)给至少一只小鼠施用本文提供的运铁蛋白之受体蛋白以产生至少一只经免疫的小鼠；

(b)从至少一只经免疫的小鼠体内移出B淋巴细胞；

(c)将得自至少一只经免疫的小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交瘤；

(d)克隆杂交瘤；

(e)选择可产生抗运铁蛋白之受体蛋白的抗体的克隆；

(f)培养可产生抗运铁蛋白之受体蛋白的抗体的克隆；然后

(g)从培养物中分离抗运铁蛋白之受体蛋白的抗体。

本发明的另一方面提供了生产莫拉氏菌属菌株如粘膜炎莫拉氏菌的经分离、纯化和未变性的运铁蛋白之受体蛋白的方法，所述蛋白的表观分子量约为80-90kDa，所述方法包括以下步骤：

(a)提供莫拉氏菌属菌株的细胞团块；

(b)从细胞团块中选择性地提取水溶性蛋白质以提供第一上清液和第一沉淀物；

(c)分离第一沉淀物和第一上清液；

(d)从第一沉淀物中选择性溶解至少一种分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白以提供第二上清液和第二沉淀物；

(e)分离第二沉淀物和第二上清液；

(f)从第二上清液中纯化分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白，基本上不含在选择性溶解的步骤中从第一沉淀物中溶解的其它莫拉氏菌属蛋白质。

通过将细胞团块与含有约50mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5的缓冲水溶液接触，超声处理细胞团块以破碎之，离心以形成第一沉淀物和第一上清液，即可从细胞团块中选择性地提取水溶性的蛋白质。选择性溶解可通过下列步骤实现：将第一沉淀物与含有去污剂和增溶剂的缓冲水溶液至少接触一次，所述缓冲液可以是约20mM-1M Tris-HCl，所述去污剂可以是约0．2-2wt％的TRITON X-100(非离子型去污剂的商标，为十八酚(乙二醇)10)，所述增溶剂可以是约2-20mM的EDTA，超声处理第一沉淀物以使其分散，离心以形成第二沉淀物和第二上清液。这种接触，超声处理和离心步骤可至少进行两次，然后收集每次的上清液以提供第二上清液。

通过多次层析柱操作进行纯化步骤，包括：

(a)在可以是DEAE-Sephacel柱的第一层析柱上进行第一次层析操作，通过使用例如含有约10mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5的缓冲液，可使运铁蛋白之受体蛋白选择性地流出，污染蛋白质结合于柱上，

(b)在含有阳离子交换基质，如SE-纤维素／D529的第二层析柱上进行第二次层析操作，通过使用例如含有约10mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5的缓冲液，可使运铁蛋白之受体蛋白选择性地流出，污染蛋白质结合于柱上，

(c)在如羟基磷灰石的第三层析柱上进行第三次层析操作，通过例如控制装柱pH约为7-8．5，可使柱优先选择性地与运铁蛋白之受体蛋白而不是与OMP B2蛋白结合，和

(d)通过例如使用pH约为7-8．5、含有约100-250mM KH₂PO₄的缓冲溶液，可从第三层析柱上洗脱运铁蛋白之受体蛋白。本文提供的制备方法能够分离出纯化形式和未变性形式的运铁蛋白之受体蛋白。

在本申请中，用术语“莫拉氏菌属菌株表观分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白(TfR2)”来限定粘膜炎莫拉氏菌的分子量约为80-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白家族，并包括其氨基酸序列有所变化的蛋白质，所述变化包括那些在莫拉氏菌属的多种菌株中自然产生的变化。在本申请中，如果第一个蛋白质与第二个蛋白质免疫学相关和／或具有相同的功能，则第一个蛋白质是第二个蛋白质的“功能类似物”，功能类似物可以是，例如，蛋白质的片断或其取代物，增加或缺失的突变体。

本发明的优点包括：

-从产生运铁蛋白之受体蛋白的莫拉氏菌属菌株，包括粘膜炎莫拉氏菌中分离表观分子量约为80-90kDa的经纯化的运铁蛋白之受体蛋白的方法；

-可从莫拉氏菌属菌株中分离得到表观分子量约为80-90kDa的经分离和纯化的未变性运铁蛋白之受体蛋白；和

-特异性鉴定莫拉氏菌属和感染该菌的宿主的诊断试剂盒和免疫学试剂。

                     附图简述

参照附图从下列描述中可进一步地理解本发明，其中：

图1是根据本发明的一个实施方案，从粘膜炎莫拉氏菌中纯化运铁蛋白之受体蛋白的方法的流程图；

图2显示了通过SDS-PAGE对表观分子量约为80-90kDa的经分离和纯化的运铁蛋白之受体蛋白进行的分析；

图3显示了经纯化的运铁蛋白之受体对人运铁蛋白的结合能力；

图4(a)，4(b)和4(c)显示了经纯化的运铁蛋白之受体蛋白的免疫印迹分析；和

图5(a)和5(b)是免疫印迹，它们阐明了豚鼠抗TfR抗血清特异性地区分粘膜炎莫拉氏菌和能导致中耳炎的其它细菌病原体的能力，所述抗血清是通过用经分离和纯化的运铁蛋白之受体蛋白免疫接种产生的。

发明通述

本发明提供了可用于由粘膜炎莫拉氏菌制备经纯化的运铁蛋白之受体蛋白TfR1的新技术。任何能产生TfR2的粘膜炎莫拉氏菌菌株均可便利地用来提供如本文所提供的经分离和纯化的TfR2。这些菌株一般可从临床和细菌培养物保藏中心得到。粘膜炎莫拉氏菌的适当菌株包括粘膜炎莫拉氏菌5191，135和4223。

参照图1，图解说明了根据本发明的一个实施方案，从粘膜炎莫拉氏菌中纯化运铁蛋白之受体蛋白的方法的流程图，经SDS-PAGE测定，所述蛋白的表观分子量约为80-90kDa。下述的多种操作一般可在约为4℃-30℃的室温下进行。将整个细胞与可含有约10mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5的缓冲水溶液介质接触，超声处理破碎细胞后，离心以产生第一上清液(S1)和第一沉淀物(PPT1)。上清液(S1)中含有细胞团块中的大部分可溶性蛋白质，弃去此上清液。选择性地用去污剂提取留下的沉淀物(PPT1)以除去任何残留的可溶性蛋白质，并从沉淀物中溶解包括TfR2的膜蛋白。可以用任何便利的方法进行这种选择性的提取。这种方法其中之一包括对沉淀物进行多次去污剂提取。具体地说，第一次去污剂提取可以使用Triton X-100和EDTA，然后离心以形成第二沉淀物(PPT2)和被保留的第二上清液(S2)。分离出第二上清液(S2)后，应用Triton X-100和EDTA对残留的沉淀物PPT2再次进行去污剂提取，然后离心。分离第三上清液(S3)和残留的第三沉淀物(PPT3)，第三沉淀物弃去，第三上清液与第一次提取得到的第二上清液(S2)合并，即可提供合并的上清液(TfR2-1)。在Tris浓度约为10mM-1M，pH约为7-8．5的缓冲条件下，使用浓度约为0．2-2wt％的Triton X-100和2-20mM EDTA即可进行这种Triton X-100提取。

合并的上清液(TfR2-1)中含有TfR2蛋白以及污染的粘膜炎莫拉氏菌蛋白，所述污染蛋白包括与TfR2蛋白具有大致相同分子量的OMB B2蛋白(见泳道3和5，图2)。在一系列柱层析操作中对合并的上清液(TfR2-1)进行处理以除去这些杂质。

在第一次这种柱层析操作中，可对合并的上清液(TfR2-1)使用经适当缓冲的DEAE-Sephacel柱或其它适宜的柱以允许TfR2蛋白流出，而杂质结合于柱上，前述缓冲液可为例如约10mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5。在进一步处理流出液之前可洗涤DEAE-Sephacel柱。

然后对来自DEAE-Sephacel柱的流出液和洗涤液(TfR2-2)使用经适当缓冲的阳离子交换柱，如SE-纤维素／D529或S-琼脂糖凝胶以允许TfR2蛋白流出，而杂质结合于柱上，前述缓冲液可为例如约10mM-1M Tris-HCl，pH约为7-8．5。在进一步处理流出液之前可洗涤阳离子交换柱(见泳道4，图2)。

来自阳离子交换柱的流出液和洗涤液(TfR2-3)仍含有OMP B2蛋白以及少量残留的蛋白质污染物。可在柱优先与TfR2蛋白而非OMP B2蛋白及其它污染蛋白质结合，使后者流出柱的缓冲条件下，对TfR2-3使用羟基磷灰石柱。这种条件可通过使用pH约为6-8．5，浓度约为5-50mM的磷酸钾缓冲液达到。流出液中含有污染蛋白质(见泳道5，图2)。

用缓冲液反复洗涤除去柱上残留的污染物后，使用适当的缓冲液，如pH约为7-8．5浓度约为150-250mM的磷酸钾缓冲液，将TfR2蛋白从羟基磷灰石柱上洗脱下来。收集洗脱的级分，通过SDS-PAGE分析等分试样，合并含有TfR2的级分。浓缩合并的级分以提供含有TfR2蛋白的溶液(见泳道6，图2)。通过此方法提供了经分离和纯化的未变性TfR2蛋白的水溶液。所提供的TfR2水溶液的浓度可以是与该物质预期的用途一致的任何便利浓度，一般约为100-200μg／ml。

参照图2，显示了通过SDS-PAGE对运铁蛋白之受体蛋白所作的纯度分析，所述蛋白是通过本文所述的方法，典型地如通过图1图解显示的方法纯化的。在图2中，泳道1表示粘膜炎莫拉氏菌细胞裂解物，泳道2表示合并的上清液(TfR2-1)，泳道3表示经DEAE-Sephacel柱层析后流出的级分(TfR2-2)，泳道4经表示SE-纤维素／D529柱层析后流出的级分(TfR2-3)，泳道5表示经HTP流出的级分并含有OMP B2蛋白，泳道6表示含有TfR2的与HTP结合的级分，泳道7表示通过基本上如ref．29所述的亲和层析分离的运铁蛋白之受体蛋白TfR2。按本文所提供的纯化TfR2蛋白的方法产生了纯度至少为70％的TfR2蛋白制品。通过光密度法扫描测定出图2泳道6中显示的制品纯度至少为95％。

参照图3，阐明了本文提供的粘膜炎莫拉氏菌的纯化的TfR2特异性结合人运铁蛋白的能力。通过SDS-PAGE分离蛋白质，基本上如ref．27所述评价运铁蛋白的体外结合。泳道1含有通过基本上如ref．29所述的亲和层析分离出的粘膜炎莫拉氏菌的TfR2，泳道2含有按本文所述纯化的粘膜炎莫拉氏菌的TfR2，泳道3含有粘膜炎莫拉氏菌的OMP B2蛋白。从图3中可以看出，结合运铁蛋白的蛋白质制品能特异性地与运铁蛋白结合。这些结果进一步证实了通过本文提供的方法可从粘膜炎莫拉氏菌中分离出TfR2。

为了能用作免疫原性组合物(包括疫苗)的成分和诊断实施方案中的抗原，按本文所述纯化的运铁蛋白之受体蛋白应有助于产生识别或中和粘膜炎莫拉氏菌菌株(包括其多数菌株)的抗体。

参照图4(a)，4(b)和4(c)，显示了本文所提供的TfR2的免疫印迹分析，并显示了TfR2与OMP B2蛋白的特异性分离。在每个图中，样品1含有OMP B2蛋白，样品2含有TfR2蛋白。粘膜炎莫拉氏菌菌株是a：菌株5191；b：菌株135；和c：菌株4223。通过SDS-PAGE分离样品，样品3是纯化的TfR2。图4(a)显示了经考马斯蓝染色的凝胶，图4(b)显示了使用抗TfR2抗血清的免疫印迹，图4(c)显示了使用抗OMP B2抗血清的免疫印迹。图4的结果进一步证实了通过本文提供的方法可从粘膜炎莫拉氏菌中特异性地纯化运铁蛋白之受体蛋白TfR2，尤其是所述蛋白基本上不含OMP B2蛋白。

参照图5(b)，免疫印迹的结果显示了豚鼠抗TfR抗血清识别粘膜炎莫拉氏菌的TfR2蛋白的能力，所述抗血清是通过用本文提供的经纯化的TfR蛋白免疫豚鼠得到的，所述粘膜炎莫拉氏菌分离自多种来源。测试样品如下述：

泳道    粘膜炎莫拉氏菌    来源

1         纯化的TfR2    粘膜炎莫拉氏菌4223

2             56          中耳液

3            4223         中耳液

在本发明的一个实施方案中，本文所提供的经分离和纯化的TfR2蛋白能用于产生抗体，所述抗体可特异性鉴别粘膜炎莫拉氏菌和能引起中耳炎的其它细菌病原体。因此，参照图5(a)和5(b)，分别通过SDS-PAGE和免疫印迹图解显示了豚鼠抗TfR2抗血清的特异反应性，该抗血清通过用本文提供的TfR2蛋白免疫豚鼠得到。被分析的样品如下所示：

泳道    细菌               来源

1     TfR2蛋白         粘膜炎莫拉氏菌4223

2    粘膜炎莫拉氏菌56      中耳液

3    粘膜炎莫拉氏菌4223    中耳液

4    流感嗜血杆菌菌株12

5    流感嗜血杆菌菌株30    中耳分离物

6    流感嗜血杆菌LCOC1     中耳分离物

7    肺炎链球菌            ATCC 6303

8    肺炎链球菌            ATCC 6304

9    肺炎链球菌            ATCC 6314

图5(b)所示的结果清楚地表明本文所提供的TfR2-特异性抗血清具有鉴别引起相似临床症状之疾病的细菌病原体的用途。

下表1中所示的结果阐明了通过用本文提供的TfR2蛋白免疫豚鼠产生的抗TfR2抗血清杀死粘膜炎莫拉氏菌的能力。结果表明通过用分离自菌株4223的TfR2蛋白免疫产生的抗血清对于衍生自菌株4223的同源非集群的粘膜炎莫拉氏菌菌株RH408而言是杀菌的。本文所提供的经分离和纯化的TfR2蛋白产生杀菌抗体的能力是本文所提供的TfR2蛋白能用作保护个体免受由粘膜炎莫拉氏菌引起之疾病的疫苗的活体内证据。

因此，根据本发明的另一方面，提供了抗能产生TfR2蛋白或产生能诱导特异性识别TfR2之抗体的蛋白质的莫拉氏菌属或其它细菌病原体的疫苗，所述疫苗含有免疫原有效量的本文所提供的TfR2蛋白及生理学可接受的载体。本文所提供的TfR2蛋白也可用作半抗原，多糖或肽的载体蛋白以制备抗与TfR2不相关的抗原决定簇的缀合疫苗。

本文所提供的TfR2蛋白也可用作诊断试剂，抗原或用于产生抗TfR2抗体，作为抗原免疫接种以抵抗由莫拉氏菌属的菌种引起的疾病。

在本发明另外的实施方案中，本文所提供的TfR2蛋白可作为载体分子以制备抗病原体细菌包括有荚膜的细菌的嵌合分子和缀合疫苗(包括糖缀合物)。因此，例如，使用本发明的糖缀合物可保护个体抵抗由任何具有多糖抗原的细菌引起的疾病和感染，所述多糖抗原包括脂寡糖(LOS)和PRP。这些细菌病原体可包括例如流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，变异链球菌(Streptococcus mutants)，新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)，克雷伯氏杆菌(Klebsiella)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。能与TfR2蛋白缀合的特殊抗原和实现这种缀合的方法描述于已公开的PCT申请WO94／12641中，此申请被转让给受让人，并在此引入，作为参考。

在另一个实施方案中，TfR2蛋白的载体功能可被用于，例如诱导针对肿瘤细胞异常多糖的免疫力，或产生能与化疗剂或生物活性剂缀合的抗肿瘤抗体。

本发明尚涉及将TfR2蛋白用作药物，尤其是用作抗由莫拉氏菌属菌株感染引起的疾病的疫苗中的活性成分。

在另一方面，本发明提供了TfR2蛋白用于制备抗由莫拉氏菌属的菌株感染引起的疾病的免疫药物的用途。

本发明的多种实施方案在免疫接种，诊断，治疗莫拉氏菌属的感染和生产免疫学试剂等领域具有很多应用，这一点对于本领域的技术人员而言是显而易见的。下文中进一步展现了这些用途的非限制性讨论。1．疫苗制品和用途

可由本文公开的免疫原性的运铁蛋白之受体蛋白或类似物制备适于用作疫苗的免疫原性组合物。优选充分透析抗原性物质以除去不符合要求的小分子量分子和／或冻干之以更易于配制到所需的赋形剂中。免疫原性组合物引发可产生抗体的免疫应答，所述抗体包括抗运铁蛋白之受体的抗体和调理性或杀菌性抗体。如果被免疫接种的受试者受到莫拉氏菌属或其它产生运铁蛋白受体的细菌的攻击，抗体将与运铁蛋白受体结合，从而防止细菌接近存活所必需的铁源。另外，调理性或杀菌性抗TfR抗体也可通过其它机制提供保护作用。

包括疫苗的免疫原性组合物可被制备成能注射的液体溶液或乳剂。可将运铁蛋白之受体蛋白与能与之相容的可药用的赋形剂混合。这种赋形剂包括水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇以及它们的组合。免疫原性组合物和疫苗可进一步地含有辅助物质，如增湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或能增强其效力的佐剂。通过皮下或肌内注射可以非肠道施用免疫原性组合物和疫苗。或者，以在粘膜表面引起免疫应答的方式配制和释放根据本发明形成的免疫原性组合物。因此，可通过例如鼻内或口服(胃内的)途径将免疫原性组合物施用到粘膜表面。或者也可使用包括栓剂和口服制剂的其它施用模式。对于栓剂而言，结合物和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。这种栓剂可由含有约0．5-10％，优选约1-2％的活性成分的混合物形成。口服制剂可包括正常使用的赋形剂，如药用级的糖精，纤维素和碳酸镁。这些组合物的形式可以是溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释剂或粉末，并含有约1-95％，优选约20-75％的运铁蛋白之受体蛋白。

免疫原性的制品和疫苗的施用方式应与制剂的剂量相容，所使用的量应是治疗有效的，保护性的和免疫原性的量。施用的量取决于被治疗的受试者，包括例如个体免疫系统合成抗体的能力，所需保护作用的水平和如有必要，产生细胞介导的免疫应答的能力。需要施用的活性成分的精确的量取决于具体操作者的判断。然而，本领域的技术人员容易决定适当的剂量范围，该剂量范围可以是每次免疫接种的运铁蛋白之受体蛋白为微克级。最初施用和加强剂量的适当安排也可以改变，但可包括首次施用和随后的再次施用。剂量也取决于施用的途径，并根据宿主的大小将有所改变。

根据本发明的免疫原性组合物中运铁蛋白之受体蛋白的浓度一般约为1-95％。含有仅一种病原体的抗原性物质的疫苗是单价疫苗，含有几种病原体的抗原性物质的疫苗是联合疫苗，它也属于本发明。这种联合疫苗含有例如来自多种病原体或相同病原体的多种株，或来自多种病原体的联合的物质。

如果抗原与佐剂共同施用，则可显著改善抗原的免疫原性，佐剂通常以磷酸盐缓冲液中的0．05-0．1％溶液使用。佐剂可增强抗原的免疫原性，但其本身不必为免疫原性的物质。佐剂通过将抗原局部保留于施用位点的附近，产生有利于将抗原缓慢、持续释放给免疫系统的细胞的仓库效应而行使其作用。佐剂也可将免疫系统的细胞吸引至抗原仓库并刺激这种细胞产生免疫应答。

多年来一直使用免疫刺激剂或佐剂以改善宿主对例如疫苗的免疫应答。如脂多糖的内部佐剂正常地是用作疫苗的被杀死或减毒的细菌的成分。外部佐剂是免疫调节剂，它一般与抗原非共价连接，并被配制以增强宿主的免疫应答。因此，佐剂已被鉴定为可增强对非肠道释放的抗原的免疫应答。然而，一些这种佐剂是有毒的，可导致不需要的副作用，使得它们不适于用于人和很多动物。事实上，在人和兽用疫苗中，仅有氢氧化铝和磷酸铝(通常总称为铝盐)被常规用作佐剂。已充分明确了铝盐在增加对白喉和破伤风类毒素的抗体应答中的效力，HBsAg疫苗中已使用铝盐为佐剂。尽管对于一些应用而言，铝盐的用途充分明确，但仍存在局限性。例如，铝盐对于流感免疫接种是无效的，它不能自始至终引发细胞介导的免疫应答。在小鼠中，通过用铝盐作佐剂的抗原引发的抗体主要是IgGl同种型，它对于通过一些接种剂产生的保护作用不是最适的。

广范围的外部佐剂可引起针对抗原的潜在免疫应答。这些佐剂包括与膜蛋白抗原络合的皂苷(免疫刺激复合物)，含矿物油的普卢兰尼克聚合物，于矿物油中的被杀死的分枝杆菌，弗氏完全佐剂，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)的细菌产物，以及脂质A和脂质体。

为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫力(CMI)，经常将免疫原乳化于佐剂中。很多佐剂是有毒的，可诱导肉芽肿，急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂，FCA)，细胞裂解(皂苷和普卢兰尼克聚合物)和发热，关节炎和前眼色素层炎(LPS和MDP)。尽管FCA是出色的佐剂，并被广泛用于研究中，但由于其毒性的存在，FCA仍不能被获准用于人用或兽用疫苗。

理想的佐剂所需要的特征包括：(1)无毒性；(2)刺激长期延续的免疫应答的能力；(3)操作简单和长期储存稳定；(4)如有必要，对通过多种途径施用的抗原既引发CMI又引发HIR。(5)与其它佐剂的协同作用；(6)与抗原呈递细胞(APC)群体选择性地相互作用的能力；(7)特异性地引发适当的T_H1或T_H2细胞特异性免疫应答的能力；和(8)选择性地增加针对抗原的适当抗体同种型水平(例如IgA)的能力。

1989年8月8日授权于Lockhoff等人的美国专利4，855，283(列入本文参考文献)中指出糖脂类似物可用作免疫调节剂或佐剂，所述糖脂类似物包括N-糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，它们中的每一个的糖残基被氨基酸取代。因此，Lockhoff等人(美国专利4，855，283和ref．33)报道了在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病疫苗中，显示出与天然产生的糖脂，如糖鞘脂类和糖甘油脂具有类似结构的N-糖脂类似物能够引发强烈的免疫应答。已由长链烷基胺和通过异头碳原子与糖直接相连的脂肪酸合成了一些糖脂，以模拟天然产生的脂残基的功能。

授予Moloney的美国专利4，258，029(此专利已转让给本文的受让人，并被列入本文参考文献)指出当十八烷基酪氨酸盐酸化物(OTH)与破伤风类毒素和经福尔马林灭活的Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒疫苗络合时，可行使佐剂的功能。Nixon-George等人(ref．34)也报道了与重组的乙肝病毒表面抗原络合的芳香族氨基酸十八烷基酯可增强宿主抗乙肝病毒的免疫应答。2．免疫测定

本发明的运铁蛋白之受体蛋白可用作免疫原以产生抗运铁蛋白之受体蛋白的抗体，也可用作免疫测定中的抗原，所述免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，RIA和其它非酶联抗体结合试验或本领域中已知的检测抗细菌，抗莫拉氏菌属和抗TfR抗体的方法。在ELISA测定中，运铁蛋白之受体蛋白被固定于选定的表面上，例如象聚苯乙烯微量滴定板的孔那样能结合蛋白质的表面。洗涤以除去未完全吸附的运铁蛋白之受体蛋白后，可将已知对检测样品而言抗原性为中性的非特异性蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)的溶液结合到选定的表面上。这样即可封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，从而降低由抗血清非特异性地结合于表面而产生的背景。

然后以有助于免疫复合物(抗原／抗体)形成的方式，将固定化的表面与需检测的如临床或生物学材料等的样品接触。这可以包括用稀释剂稀释样品，所述稀释剂如BSA，牛γ球蛋白(BGG)和／或磷酸盐缓冲液(PBS)／吐温的溶液。然后在大致为25℃-37℃的温度下，将样品保温2-4小时。保温后，洗涤与样品接触的表面以除去未经免疫络合的材料。洗涤方法可包括用如PBS／吐温或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。当检测样品和被结合的运铁蛋白之受体蛋白之间形成特异性的免疫复合物，并再次洗涤之后，通过使免疫复合物接触对第一抗体具有特异性的第二抗体即可测定免疫复合物的形成，甚至对其定量。如果检测样品来源于人，第二抗体是对人免疫球蛋白具有特异性的抗体，一般为IgG。为了提供检测的手段，第二抗体可具有相关的活性，如通过与适当的生色底物保温可显色的酶活性。通过使用例如分光光度计测量显色的程度即可定量。

实施例

以上内容一般性地描述了本发明，参照下列具体的实施例可更完整地理解本发明。描述这些实施例只是为了阐明而不是限制本发明的范围。若情况所需或较为便利时，也可考虑形式的改变和等价的替代。尽管本文使用了特殊的术语，但这种术语只是为了描述而不是限制本发明。

本文描述部分和实施例中使用的、但未详述的分子遗传学，蛋白质生物化学和免疫学方法在科技文献中有大量报道，这些方法也完全在本领域技术人员的能力范围之内。实施例1

此实施例阐明了粘膜炎莫拉氏菌的培养。

所用的粘膜炎莫拉氏菌菌株是135，4223(ref．35)，5191(ref．35)(都是中耳分离物)，ATCC 25240，Q8(痰液分离物)和RH408。

为了提供细胞以分离TfR2，按常规在巧克力琼脂平板(BBL)上维持粘膜炎莫拉氏菌菌株。

将粘膜炎莫拉氏菌菌株4223接种到20ml脑心浸液(BHI)肉汤中，在37℃下，通气温育培养物过夜。为了在铁限制的条件下生长，将1ml过夜生长的培养物接种到20ml含有25μM EDDA的BHI肉汤中，在37℃下，使培养物生长约3-4小时。通过在10，000×g下离心20分钟收获生长至对数中期(A₅₇₈＞0．5)的细胞。如下文实施例3所述，使用细胞沉淀物提取运铁蛋白之受体(TfR2)蛋白。实施例2

此实施例阐明了粘膜炎莫拉氏菌的非集群菌株(RH408)的产生。

将粘膜炎莫拉氏菌菌株4223接种于几个含有20ml BHI肉汤的烧瓶中，在37℃下，振荡(170rpm)温育培养物过夜。将5ml每种过夜培养物转移到各个1ml的试管中，在室温下静置3-8小时以使细菌沉降。用各个培养物清亮的上层液100μl接种25ml BHI肉汤，如上所述在37℃下将培养物温育过夜。每次用25μl清亮的培养基接种25ml BHI过夜培养，重复传代6次。为了比较传代株与原始的粘膜炎莫拉氏菌菌株4223培养物的沉降速度，通过以3小时为间隔期测量A₅₇₈以鉴定非集群的细菌培养物。包括粘膜炎莫拉氏菌RH408的非集群突变体在3小时的期限内不会聚集。在BHI琼脂平板上，菌株RH408具有所有非集群的菌株的典型菌落形态。根据布达佩斯条约的条款，于1994年12月13日将菌株RH408保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852，U．S．A．，给予的ATCC保藏号为55637。实施例3

此实施例阐明了通过亲和纯化提取运铁蛋白之受体蛋白TfR2。

按参考文献29所述，使用与人运铁蛋白(Sigma)缀合的琼脂糖凝胶4B(Pharmacia)由总膜制备亲和纯化的TfR2。使用50mM Tris-HCl，pH8．0，1M NaGl，10mM EDTA，0．05％十二烷基肌氨酸钠，2M胍的缓冲液选择性地洗脱与亲和基质结合的细菌受体蛋白。将经洗脱的蛋白质对50mM的Tris-HCl，pH8．0透析。实施例4

此实施例阐明了运铁蛋白之受体蛋白TfR2的提取和纯化。

通过图1中一般性阐明的方法从粘膜炎莫拉氏菌中分离运铁蛋白之受体蛋白。

将得自铁缺乏的粘膜炎莫拉氏菌过夜培养物的细胞沉淀物重悬于50mM的Tris-HCl，pH8．0中，通过超声处理破碎细胞。在20，000×g下将超声处理物离心30分钟，弃去所得的含有可溶性蛋白质的上清液(S1)，将沉淀物(PPT1)悬浮于含有0．5％Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris，pH8．0中，此提取步骤溶解了TfR2。在20，000×g下将悬浮液离心20分钟以除去不溶性的物质，将上清液上样到用50mMTris-HCl缓冲液，pH8．0平衡过的DEAE-Sephacel(Pharmacia)柱上。TfR2在流出级分中收集，使用用50mM Tris-HCl，pH8．0平衡过的SE-纤维素D529柱进一步纯化TfR2。然后将含有TfR2的流出级分上样于用10mM磷酸盐缓冲液，pH8．0平衡过的羟基磷灰石(HTP)柱上。此步骤将OMP B2(存在于HTP的流出级分中)与结合于HTP上的TfR2分离开来。用50mM磷酸盐缓冲液，pH8．0充分洗涤HTP柱之后，用200mM磷酸盐缓冲液，pH8．0将TfR2从基质上洗脱下来。通过SDS-PAGE分析评价TfR2的纯度。实施例5

此实施例描述了粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白B2 OMP B2的纯化。

通过12．5％的SDS-PAGE分析HTP柱的流出级分，电泳后，从凝胶上切下对应于OMP B2蛋白带的凝胶薄片，通过在100伏特下，于洗脱缓冲液(15mM NH₄CO₃／0．1％SDS)中电洗脱12小时从凝胶薄片中回收蛋白质。实施例6

此实施例阐明了豚鼠的免疫接种。

在第一天用乳化于完全弗氏佐剂(CFA)中的5μg剂量的TfR2或OMP B2蛋白肌内(i．m．)免疫豚鼠(Charles River，Quebec)。在第+14和+28天用乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)中的相同剂量的蛋白质加强免疫动物。在第+42天取血样。所得结果示于表1。实施例7

此实施例描述了对经纯化的TfR2和OMP B2蛋白所作的分析。

按Lugtenberg等人(ref．36)的描述，在分离凝胶中使用11．5％或12．5％(w／v)的丙烯酰胺(BRL)通过SDS-PAGE分离蛋白质。通过用考马斯亮蓝(BioRad)染色凝胶即可肉眼观察到蛋白质，蛋白质标准分子量的标记物来自BioRad和Pharmacia。

通过Towbin等人的方法(ref．37)在聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore)上电印迹通过SDS-PAGE分离的蛋白质。为了进行免疫印迹，使用1∶1，000稀释的抗血清。按1∶4，000稀释的重组G蛋白辣根过氧化物酶偶联物(Zymed)被用作报道分子。使用比色反应(4CN／DAB；Pierce)或化学发光反应(LumiGlo；Kirkegaard和Perry)显现印迹。两种检测方法都要遵从厂商推荐的操作过程。预染色的分子量标记物购自BioRad。

按照作了一些改动的Schryvers和Lee(ref．27)所述的方法评价经纯化的蛋白质在体外结合运铁蛋白的活性。简单地说，通过SDS-PAGE分离蛋白质样品，然后将样品电泳转移到PCDF膜上，在4℃下，将膜与同辣根过氧化物酶偶联的人运铁蛋白(1∶50稀释；JacksonImmunoResearch)一起保温过夜。使用上述的LumiGlo化学发光反应显现印迹。实施例8

此实施例阐明了对B．catarrhalis的杀菌试验。

将抗血清样品(25μl)加热至56℃达30分钟以消除补体活性，在含有0．1％BSA的佛罗那(veronal)缓冲液(NaCl 8．0g／1， NaHCO₃0．25g／l，巴比妥酸钠0．30g／l，巴比妥酸0．45g／l，MgCl₂．6H₂O 0．1g／l，CaCl₂·2H₂O 0．05g／l)(VBS)中按1∶8稀释样品，然后将经稀释的样品加入96孔Nunc微量滴定板的第一个孔中。将用VBS两倍系列稀释的抗血清置于剩余的孔中，用VBS按1∶200，000稀释生长至OD₅₇₈＞0．5的细菌细胞，在每个孔中加入25μl细菌悬浮液。用VBS按1∶10稀释豚鼠的补体(Biowhittaker，Walkersville，MD)，在每个孔中加入25μl溶液以启动反应。在37℃下保温培养板60分钟，然后将50μl各个反应混合物涂布于含有2．2％Mueller-Hinton肉汤和1．5％琼脂的Mueller-Hinton琼脂平板上。在37℃下温育48小时后，计数菌落以测定杀菌滴度(与含有免疫前的血清的对照相比，能杀死50％以上细菌的抗血清的最高稀释度的倒数)，结果示于表1。

本发明概要

概括地说，本发明提供了分离自粘膜炎莫拉氏菌，表观分子量约为80kDa-90kDa的运铁蛋白之受体蛋白，其制备方法和作为免疫原性组合物的用途和诊断实施方案。上述内容的改动也在本发明的范围之内。

表1

应用来自粘膜炎莫拉氏菌4223的运铁蛋白之受体蛋白(TfR2)

免疫豚鼠得到的抗血清的抗TfR2抗体滴度和杀菌活性

免疫原    杀菌滴度¹         抗TfR2滴度²

        免疫前    免疫后       免疫前    免疫后

TfR2     ＜3．0    13．5        ＜0．5    14．0

OMP B2   ＜3．0    ＜3．0       ＜0．5    ＜0．5¹杀菌滴度：以log₂表示为能杀死50％粘膜炎莫拉氏菌4223细菌的抗血清稀释度。²抗TfR2滴度：以log₂表示(滴度／100)。

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