使用谷物种子生产酶制品及饲料原料

摘要

本发明描述了用于生产酶的谷类和油料种子的发芽方法,还描述了从发芽种子生产各种高活性酶制品如植酸酶的方法。本发明提供了粉碎(或喷雾)后的发芽种子作为生产混合饲料的经济的原料的应用,还提供了酶制品作为各种家畜用药物的添加剂的应用。从种子生产酶制品的方法分为四个步骤,包括筛选种子、发芽、培养和干燥、粉碎和包装。

说明书

本发明涉及用各种种子生产高活性酶，更具体地，本发明涉及基于如下理念大量生产高活性酶的方法，所述的理念为当谷物和油料种子在合适的环境条件下发芽时，可以获得大量的高活性酶。

酶是一种与底物结合并导致增加底物的利用性的蛋白质，其是维持并激活生物体的生物学机制所必须的一种重要物质。基于对酶的生物化学特征和其在生命中的重要性的理解，酶已被广泛用于食品工业、医药工业和生物工程领域。另外，许多研究工作已能有效地生产酶，但是达到酶生产的工业化尚有许多障碍。另一问题是开发一种在各种生长条件(pH、温度等)下均能保持酶活性的方法学。第三，需开发大量生产的技术。为了有效克服这些问题，已利用基因工程技术进行了大量尝试去生产酶，但是由于其不利于大规模生产以及经济上不合算，所以这一技术的实际应用受阻并且这一技术的成功率也不高。

本发明的一个目的是提供一种大量生产高活性酶的方法。

本发明的另一目的是利用来自发芽种子的饲料原料作为原料生产分类的(或混合的)饲料，从而增加家畜的产率。

本发明的进一步目的在于通过用来自发芽种子的加酶饲料喂养家畜而降低家畜粪便中的有机磷酸盐量，由此降低由动物粪便导致的环境污染。

图1为示出本发明方法的流程图。

本发明的目的在于克服使用微生物生产酶所面临的各种困难，本发明是基于如下事实，即在各种种子发芽期观察到最高的酶活性。

本发明人发现，在谷物和油料种子如大麦、小麦、玉米、大豆和canola的发芽期有淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、CMC酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶的最高活性，在这些种子的发芽期也观察到增强的植酸酶活性。本发明提供了利用种子发芽并在最佳酶活阶段收获这些种子而生产酶的技术。作为动物饲料中淀粉来源的原料的谷类含有大量有机磷酸盐。单胃动物如鸡、猪和狗的消化道中缺少水解有机磷酸盐的酶，因此这些动物不能消化有机磷酸盐。为了补偿这一不利之处，在生产混合饲料时补加无机磷酸盐，过量使用无机磷酸盐会导致饲料成本增加及环境污染。由于这些动物不能利用有机磷酸盐，所以在混合饲料中使用水解有机磷酸盐的植酸酶能增加这些动物对饲料的利用率，并使产率最大，降低动物肉类生产成本，并降低由无机磷酸盐造成的环境污染。

最近，基于这一逻辑，已有许多尝试不仅在单胃动物饲料而且在反刍动物如牛、鹿、绵羊和山羊的饲料中添加植酸酶和其它酶。美国、加拿大、日本、荷兰、德国、英国和芬兰各国在这一领域已进行了许多研究工作。在荷兰，在动物饲料中添加植酸酶是强制性的。

在人口密度高、土地少并有较高比例家畜的国家，由于一些动物不能消化有机磷酸盐而使它们的粪便中含有有机磷酸盐，从而导致河流和绿地的严重环境污染。本发明通过使用来自发芽谷物种子的植酸酶和其它酶能增加动物饲料的利用率，降低环境污染，显著降低饲料成本并增加动物的生长率。另外，在本发明中，通过利用在各种植物种子发芽期的产酶机制，提供了经济有效的生产酶的方法。迄今为止，尚没有通过种子发芽过程利用植酸酶的报道。

在本发明中，基于下述原则开发了通过谷物种子发芽而生产酶的技术。通常，植物为繁殖需要而产生种子，为有效促进特别是发芽早期阶段发芽种子的生长，在种子中积累的各种营养成分被水解和利用。种子所含的营养成分有作为能量来源的淀粉、油和蛋白质以及矿物质如磷酸盐，其是生长所必需的。有效利用种子中积累的营养成分必需酶，因此当满足了发芽的特定条件时即开始分泌酶。当种子在特定环境条件下开始发芽时，各种酶水解种子中积累的营养成分以提供生长所需的能量和必需的矿物质，同上在种子中产生更多量的酶。特别是由磷酸盐组成的腺苷三磷酸(ATP)是能量代谢所需的，通过植酸酶水解有机磷酸盐而提供ATP。此外还产生β-葡聚糖酶、蛋白酶等以用于消化各种积累的营养成分。所产生的酶的量和活性取决于种子类别、发芽条件如温度、湿度、种子的含水量以及保温时间。即使来自同一物种的种子，例如水稻种子，酶的量和活性也根据种子的蛋白量、淀粉结构差异、品种和栽培品种的不同而不同。

在本发明中，我们鉴定了各种种子的优化发芽条件并筛选了酶产生的最佳条件，从而家畜工业和饲料工业上可以有效利用这一技术。在本发明中主要说明了植酸酶的产生，其它酶是辅助性描述。

以下参照图1描述了生产者可以容易采用的步骤，包括选择种子、培养、干燥、粉碎和包装。在本发明中，在阶段1中生产饲料原料，在阶段2中生产高纯度饲料材料，在阶段3中生产酶制品。

第1步：种子选择

将储存在罐1中的种子输送到筛子11，在一级筛选中去除破碎的种子，在二级筛选中去除延迟发芽的种子和污染有真菌的种子。将通过第1个筛子的种子置入一种盐溶液中，并仅使用那些浸入溶液的种子。在用收集装置5收集漂浮种子后将其弃掉。将通过第1次筛选和第2次筛选的种子浸入含有非离子性亲水乳化剂的容器7中并转移至配有温度计9和湿度计10的发芽温箱8中。

第2步：发芽及保温

将上述选择的种子均匀分布并在合适的湿度和温度下培养，当产生最大量的酶时停止培养并起动干燥步骤。

第3步：干燥

在第2步结束时，收集发芽的种子(以下称为“酶制品”)并用热干燥空气发生器干燥。

第4步：粉碎和包装

如图1所示，将来自第3步的干燥的酶制品加工成三种制品，第一种制品为高纯度酶制品，并通过脱壳机16脱壳，粉碎成0.1mm大小粉末并用真空包装机18包装(途径2)。第二种制品制成动物饲料添加剂，带壳的酶制品在粉碎机14中粉碎并包装(15)(途径1)。第三种制品是液体酶制品，将上述途径2的高纯度粉末制品浸入缓冲溶液20和21中并用酶提取器19提取酶，离心(20)后取上清(途径3)，制得该液体酶制品。将这三种制品储存于干燥的冷房间。

下面我们详细描述酶和饲料生产步骤的实际操作。实际操作1

筛选后，将大麦粒浸入1.5％氯化钠溶液中，然后转移至水中。当大麦的含水量为50％时，将大麦粒在培养箱中于25-30℃、90-95％湿度下培养30小时。当芽长2.0cm时，终止发芽过程并在40℃的热干36小时。发芽的干大麦种子的含水量为9％。实际操作2

除了将大麦浸入作为非离子型亲水性乳化剂的0.05％聚山梨酸中12小时以加速发芽外，其余操作与上述操作1相同。其缩短发芽时间约12-24小时。发芽的干大麦种子的含水量为12％。实际操作3

除了使用水稻种子，其余操作与上述操作1相同。发芽的干水稻种子的含水量为9％。实际操作4

除了使用小麦，其余操作与上述操作1相同。发芽的干小麦种子的含水量为9％。实际操作5

将筛选后的大豆浸入3.0％氯化钠溶液中，当大豆的含水量为60％时，将大豆在湿度为90-95％的培养箱内于30℃培养36小时。当芽长1cm时，终止培养并将大豆置于温度为80℃的热空气干燥器内24小时以热干燥。产品的含水量为12％。实际操作6

除了使用canola，其余操作与上述操作5相同。发芽的干canola的含水量为9％。实际操作7

除了将大豆浸入作为非离子型亲水性乳化剂的10％聚山梨酸80中4小时以加速发芽外，其余操作与上述操作5相同。其缩短发芽时间约24-36小时。终产物的含水量为12％。实际操作8

除了使用玉米，其余操作与上述操作5相同。玉米芽长1.5cm，终产物的含水量为10％。

为了稳定从粉碎的酶制品获得的酶提取物中的酶活，将MgCl₂加入到液体酶提取物中至浓度为0.5-1.0M。通过在5000×g离心这些酶制品得到液体酶制品。使用一种生物学缓冲溶液提取酶。实验1

为确保酶活的稳定性，用0.5-1.0M MgCl₂，CaCl₂和CoCl₂处理液体酶制品，MgCl₂对酶稳定性的效果比CaCl₂高200多倍，从而可使液体酶制品储存超过4个月。实验2

为测定根据本发明从发芽大麦中提取的淀粉酶的活性，进行体外实验。从底物如玉米、小麦和大麦中释放的葡萄糖的量分别为223.8μM、288.8μM和318.9μM。在这些实验中，将作为底物的未发芽的玉米、小麦和大麦粉碎成能通过0.5mm筛子的小颗粒并在38℃保温24小时。实验3

为测定根据本发明从发芽大麦中提取的植酸酶的活性，进行如上述实验2的体外实验。从上述底物玉米、小麦和大麦释放的磷酸盐的量分别为613.7μg、373.9μg和1573.8μg。实验4

表1示出了根据本发明来自未发芽的和发芽的谷类种子和油料种子的淀粉酶活性的对比数据。淀粉酶活性的增加从最小值小麦和大豆中的210％至最大值玉米中的1300％。

表1  未发芽的和发芽的谷类种子和油料种子的淀粉酶活性

 淀粉酶活性(单位/千克)谷类    未发芽    发芽    相对增加(％)玉米    5200      66100      1300小麦    66500     139400     210大麦    64444     176100     280水稻    12962     117800     910大豆    65679     133500     210实验5

表2示出了根据本发明来自未发芽的和发芽的谷类种子和油料种子的植酸酶活性的对比数据。植酸酶活性的增加从最小值大豆中的120％至最大值玉米中的470％。

表2  未发芽的和发芽的谷类种子和油料种子的植酸酶活性

 植酸酶活性(单位/千克)谷类    未发芽    发芽    相对增加(％)玉米    13900     64600       470小麦    112400    227600      210大麦    119400    305600      260水稻    5200      31900       630大豆    39000     43900       120实验6

为测定从发芽大麦中提取的各种酶的活性，进行如上述实验4的实验，使用未发芽大麦作为对照。与未发芽大麦相比，在发芽大麦中各种酶的活性均已增加，例如纤维素酶为300％，果胶酶为500％，CMC酶为500％，半纤维素酶为300％，蛋白酶为400％。实验7

使用大豆进行上述实验6相同的实验，与未发芽大豆相比，在发芽大豆中各种酶的活性均已增加，例如淀粉酶为2500％，纤维素酶为400％，果胶酶为600％，CMC酶为500％，半纤维素酶为200％，蛋白酶为600％，植酸酶为450％。动物饲养实验1：猪

用如上述操作1所述产自大麦的粉碎酶制品作为生淀粉饲料材料喂养猪，喂养3个月后观察到与喂养普通饲料的对照组相比相对体重增加20％。饲料组成淀粉饲料(来自本发明的饲料原料)40-50％纤维素酶饲料                  20％蛋白饲料                      20％添加剂、药物和矿物质          10-20％动物饲养实验2：肉鸡

用产自操作5所述的大豆的粉碎酶制品喂养肉鸡，饲料组成如上所述，只是使用来自大豆的粉碎酶制品作为蛋白饲料来源。喂养8周后观察到与喂养普通饲料的对照组相比相对体重增加15％。动物饲养实验3：下蛋母鸡

进行与上述动物饲养实验2相同的实验，只是采用下蛋母鸡，与用普通饲料喂养的对照组相比，产蛋率增加8-10％，最初下蛋时间缩短约2周。动物饲养实验4：狗、水貂和狐狸

在狗、水貂和狐狸中进行与上述动物饲养实验2相同的实验，在狗、水貂和狐狸中观察到体重增加分别为15％、13％和20％。看起来实验组的水貂和狐狸的毛皮比对照组亮。来自发芽谷物种子的酶制品含有高数量的各种高活性酶，因此，预计各种底物协同水解。我们证实与普通添加剂相比，在动物药品中添加0.5％(w/w)酶制品的置换效果非常好。

本发明开发了从发芽的谷物种子中生产酶的技术，该技术利用了自然规律，以低成本生产了最大量的酶。这种酶制品对于动物使用是无毒而安全的，因为这种酶制品是从供人和动物消耗的谷物中生产的。这种酶制品不仅含有最大量的植酸酶，而且含有大量的各种酶，各种底物预计能协同水解。这种酶制品具有优异的置换效果，因为其含有各种营养成分，可用作生产混合饲料的饲料原料。

通过使用这种酶制品，不需再在反刍动物和单胃动物的饲料中添加植酸酶以消化有机磷酸盐。因此，本发明在动物饲料和家畜业非常有用，因为其应用可以明显降低饲料成本，在经济上非常有利。