鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的毒株的方法

摘要

公开了一种精确鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的方法,该方法包括:分析Oka株和样品水痘株之间基因组DNA及其片断的差异,并且确定样品株是否符合下列全部8个特征:HpaI－K片断和EcoRI－P片断的大小;Gene14的R2—487区域的大小以及PCR－SSCP分析;用AccⅢ消化R2—1764片断而获得的限制片断的大小;PstI切割位点存在与否;由R2—487区域编码的氨基酸序列的同源性;由VZVGene14的编码区编码的氨基酸序列的同源性。还公开了一种分离的水痘病毒株,按上述方法鉴定,它大体上是相同的病毒株;一种减毒水痘病毒活疫苗,它包含按上述方法鉴定的相同的病毒株;一种减毒水痘病毒Oka株抗原。

说明书

本发明涉及一种鉴定减毒水痘病毒Oka株的方法。更具体地说，本发明涉及一种鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的方法，以及一种分离的病毒株，按上述方法鉴定，该分离的病毒株大体上是相同于减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的毒株的病毒株。本发明还涉及一种减毒水痘病毒Oka株抗原。

正如众所周知的那样，目前使用的减素活水痘疫苗是由水痘—带状疤疹病毒(下文中常简称为水痘病毒)的一个种子株生产的，所述病毒是衍生自减毒水痘病毒Oka株的一种病毒(参见已审查的日本专利申请公开号53-41202和美国专利公开号3,985,615)，而且减毒活疫苗在全世界广泛应用(Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984：WHO Technical Report Series，No.725，pp.102-124，1985)。为确保疫苗的安全性和有效性，考虑到传代过程中可能发生的潜在的遗传突变，将生产疫苗用的病毒的传代数置于种子批系统(seed lot system)的控制之下。也就是说，生产者有义务仅从衍生自许可用于活水痘疫苗的种子病毒的病毒生产水痘疫苗，其中，从计为0代的许可种子病毒开始计算，所述病毒的传代数不超过10。换句话说，减毒活水痘疫苗的质量控制和质量保证取决于生产者满足种子批系统的要求，而且疫苗的质量还不是通过对种子病毒基因组DNA或疫苗病毒基因组DNA的直接遗传分析来测定的。

另外，从涉及对水痘疫苗效果的追踪和上市后调查(PMS)的流行病学角度来看，需要确定分离自自然感染的水痘患者的新鲜野生型毒株与衍生自上述Oka株的疫苗病毒株之间的病毒差异，为确定病毒差异已尝试过各种方法。自从VZV基因组的基因和该基因的结构被报道以来(Journal of General Virology，67，1759-1816，1986)，病毒差异的各种确定方法基于毒株性质和特征之间的差异，例如，不同VZV毒株之间的DNA序列的差异(Journal of Virology，59，660-668，1986)；限制酶PstI切割位点存在与否的差异(JapaneseJournal of Experimental Medicine，59，233-237，1989)；PCR(聚合酶链式反应)产物的RFLP(限制片断长度多态性)方面的差异(Journalof Virology，66，1016-1020，1992)；以及限制酶PstI限制位点存在与否的差异和PCR产物的RFLP方面的差异(Journal of Clinical Mi-Crobiology，33，658-660，1995)。不过，所有这些方法在可靠性上都有欠缺，不能用来准确鉴定Oka株。

换句话说，为了疫苗的质量控制和质量保证并从涉及对疫苗效果的追踪和PMS的流行病学角度来看，至关重要的是鉴定或测定上述的减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株(该Oka株或由其衍生的毒株可用作减毒活水痘疫苗的活性成分)。然而，尚未建立起能可靠地用于这种鉴定或测定的方法。本领域迫切需要开发这种方法。

在前述情况下，本发明人已进行广泛而深入的研究，意在开发一种精确、快速地鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的新方法。本发明人已进行深入的遗传分析，意在研究减毒水痘病毒Oka株(或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株)与其它水痘毒株之间基因组DNA的差异，例如已知的水痘毒株和新鲜野生型毒株。结果发现，下述的8个具体特征可用于精确、快速地鉴定减毒水痘病毒Oka株(或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株)。也就是说，他们发现，通过确定样品毒株是否符合所有这8个特征，可以精确、快速鉴定Oka株或由其衍生的有用毒株。根据这一新发现完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种精确、快速鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的新方法。

本发明的另一个目的是提供一种分离的病毒株，按上述方法鉴定，它大体上是相同于减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的病毒株。

本发明的又一目的是提供一种减毒水痘活疫苗，它包含作为活性成分的分离的病毒株，按上述方法鉴定，该分离的病毒株大体上是相同于减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的病毒株。

本发明的再一目的是提供一种减毒水痘病毒Oka株抗原，它包括由减毒水痘病毒基因组DNA的特定区域编码的氨基酸序列的至少一部分的邻接序列。

根据下文的详细描述、权利要求以及所附序列表和附图，对本领域技术人员而言，本发明的前述和其它目的、特点以及优点将是显而易见的。本发明所用术语的定义和解释

(1)VZV：引起水痘—带状疱疹的“水痘—带状疱疹病毒”(下文中常简写为“水痘病毒”)的缩写。本发明的鉴定方法可用于由水痘或带状疱疹患者分离到的病毒。

(2)水痘疫苗：有效防止VZV感染或防止感染后疾病发作的疫苗。

(3)减毒Oka株：相当于减毒水痘病毒Oka株的毒株(参见审查过的日本专利申请公开53-41202和美国专利公开号3,985,615)。该减毒Oka株于1975年3月14日保藏于ATCC(American TypeCulture Collection；12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852USA)，保藏号为VR-795。

(4)减毒水痘疫苗病毒：衍生自制备活水痘疫苗用的经许可的种子病毒的水痘病毒，其中从计为0代的经许可的种子病毒开始计算，该病毒的传代数不超过10(参见WHO Technical Report Series No.725，pp.107-108，1985)。减毒水痘病毒可用作水痘疫苗的活性成分。

(5)VZV的基因号(Gene14和Gene38)和该DNA的核苷酸号：这些号根据Davison和Scott的报道(Journal of General Virology，67，1759-1816，1986)。

(6)限制片断的大小{单位：碱基对(bp)}：用限制酶消化VZV基因DNA序列而获得的具有粘端的限制片断的大小是从限制酶的切割位点开始计算的。例如，当限制酶E切割位点是该序列的第10个核苷酸和第60个核苷酸时，所获得的该DNA限制片断E的大小为60-10＝50，即50bp。

(7)HK片断：图1中所示HpaI-K的缩写(Journal of InfectiousDiseases，149，956-963，1984；它指用限制酶HpaI消化VZV基因组DNA而获得的K片断)。

(8)EP片断：图1中所示EcoRI-P的缩写(Journal of Virology，59，660-668；它指用限制酶EcoRI消化VZV基因组DNA而获得的P片断)。

(9)PCR-SSCP：“聚合酶链式反应—单链构象多态性”的缩写，它是分析DNA片断的一种方法，该DNA片断按照SSCP由PCR进行扩增(Proceedings of National Academy of Science，USA，86，2766-2770，1989)。

(10)R2-487区域：VZV基因组的一个区域，它包括Gene14的重复序列R2，该区域以DNA片断形式获得，该DNA片断是采用表1中所示PCR引物(2)和(3)由PCR扩增的。减毒水痘活疫苗病毒Oka株的该R2-487区域的大小为487bp。

(11)R2-1764区域：VZV基因组的一个区域，它包括Gene 14的重复序列R2，该区域以DNA片断形式获得，该DNA片断是采用表1中所示PCR引物(1)和(3)由PCR扩增的。减毒水痘活疫苗病毒Oka株的该R2-1764区域的大小为1764bp。

(12)引物：本发明中所用PCR引物的名称和DNA序列{以从左(5′)到右(3′)的方向描述}如下面表1所示：

表1

引物的名称及其DNA序列引物(1)：5′-GATGGATATAATCCACACCC-3′(有义链)引物(2)：5′-GACGCATGTAACAAGGCATG-3′(有义链)引物(3)：5′-TCGACTGAATCTCAACCCAC-3′(反义链)引物(4)：5′-GATGTTTCCAAATCTAACTC-3′(反义链)引物(PS1)：5′-AAGTTTCAGCCAACGTGCCAATAAA-3′(有义链)引物(PS2)：5′-AGACGCGCTTAACGGAAGTAACG-3′(反义链)

如上所述，本发明人通过遗传分析对减毒水痘病毒Oka株(或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株)与其它VZV株之间的基因组DNA的差异进行了研究，例如，已知毒株和新鲜野生型毒株。这种遗传分析的主题可归纳于下面(a)-(e)中(也可参见图1)：

(a)分别测定HK片断和EP片断的大小；

(b)通过PCR扩增R2-1764区域，得到VZV基因组DNA片断，用限制酶AccIII处理所得到的片断(A Practical Guide to Molecu-lar Cloning，Second Edition，1988)以证实其裂解为两部分，然后测定这两部分的大小；

(c)通过PCR扩增R2-487区域，得到VZV基因组DNA片断，测定该DNA片断的大小，其中还通过PCR-SSCP分析R2-487区域并测定该区域的核苷酸序列；

(d)通过PCR扩增Gene 38的一部分，得到VZV基因组DNA片断，用限制酶PstI处理所得到的片断，在进行处理之前和之后测定该片断的大小，由此确定该片断是否被PstI裂解，其中的分析证实限制酶PstI切割位点存在与否；以及

(e)通过PCR扩增VZV Gene14的整个编码区，测定其核苷酸序列。

本发明是基于上述分析(a)-(e)的结果完成的。

SEQ ID NO.1是减毒Oka株基因组DNA的R2-487区域的核苷酸序列，以及按通用密码由该核苷酸序列翻译得到的氨基酸序列(162个氨基酸残基)；

SEQ ID NO.2是Gene14的整个编码区的核苷酸序列(1683bp)，以及按通用密码由该核苷酸序列翻译得到的氨基酸序列(560个氨基酸残基)；

SEQ ID NO.3-8是用来制备VZV基因组DNA的DNA片断的PCR引物，这些DNA片断用于鉴定减毒水痘病毒Oka株。

附图中：

图1表示VZV基因组DNA(约125kb)，表示出Gene14的位置、减毒Oka株基因组DNA的限制片断的位置和大小，以及本发明中所用引物的核苷酸序列；

图2A-1至2A-3以及图2B-1至2B-3表示减毒Oka株、Davison和Scott公开的序列(Journal of General Virology，67，1759-1816，1986)和Kinchington等公开的序列(Journal of Virology，59，660-668，1986)之间核苷酸序列和氨基酸序列的比较。图2A-1至2A-3中比较了Gene14的整个编码区的每一核苷酸序列，图2B-1至2B-3中比较了按通用密码由该核苷酸序列翻译得到的每一氨基酸序列。

按照本发明，提供了一种精确鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的新方法。

为便于理解本发明，下文中将阐述本发明的基本特征和各种优选实施方案。

1.鉴定减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的方法，它包括：

分析样品水痘病毒的基因组DNA及其DNA片断；以及

确定所述样品水痘病毒的分析过的基因组DNA及其DNA片断是否符合下列全部八个特征(A1)-(A8)：

(A1)用限制酶HpaI消化水痘病毒基因组DNA而获得的K片断的大小为3231bp；

(A2)用限制酶EcoRI消化水痘病毒基因组DNA而获得的P片断的大小为1749bp；

(A3)当用限制酶AccIII处理采用SEQ ID NO.3的PCR引物(1)和SEQ ID NO.5的PCR引物(3)、通过PCR由水痘病毒基因组DNA扩增的DNA片断时，该DNA片断被切割成大小分别为1208bp和556bp的两部分；

(A4)采用SEQ ID NO.4的PCR引物(2)和SEQ ID NO.5的PCR引物(3)、通过PCR由水痘病毒基因组DNA扩增的DNA片断的大小为487bp；

(A5)就一DNA片断而言，由PCR-SSCP测定的水痘病毒基因组DNA和减毒水痘病毒Oka株基因组DNA的电泳迁移率大体相同，其中，在PCR-SSCP的PCR中采用SEQ ID NO.4的PCR引物(2)和SEQ ID NO.5的PCR引物(3)；

(A6)采用SEQ ID NO.7的PCR引物(PS1)和SEQ ID NO.8的PCR引物(PS2)、通过PCR由水痘病毒基因组DNA扩增的DNA片断缺少限制酶PstI切割位点；

(A7)由水痘病毒基因组DNA编码、相应于SEQ ID NO.1的162氨基酸序列的162氨基酸序列与SEQ ID NO.1的162氨基酸序列之间的同源性为98-100％；和

(A8)由水痘病毒基因组DNA编码、相应于SEQ ID NO.2的560氨基酸序列的560氨基酸序列与SEQ ID NO.2的560氨基酸序列之间的同源性为99-100％。

2.一种分离的病毒株，按上面项1的方法鉴定，它大体上是相同于减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的病毒株。

3.一种减毒水痘病毒活疫苗，它包含作为活性成分的分离的病毒株，按上面项1的方法鉴定，所述分离的病毒株是大体上相同于减毒水痘病毒Oka株或由其衍生的能起减毒水痘活疫苗病毒作用的毒株的病毒株。

4.一种减毒水痘病毒Oka株抗原，它包含选自SEQ ID NO.2氨基酸序列的至少3个氨基酸的邻接序列。

在下文中详细地描述本发明。

本发明中，对于核苷酸序列，A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶。

本发明中，对于氨基酸序列，Ala代表丙氨酸残基，Arg代表精氨酸残基，Asn代表天冬酰胺残基，Asp代表天冬氨酸残基，Cys代表半胱氨酸残基，Gln代表谷氨酰胺残基，Glu代表谷氨酸残基，Gly代表甘氨酸残基，His代表组氨酸残基，Ile代表异亮氨酸残基，Leu代表亮氨酸残基，Iys代表赖氨酸残基，Met代表蛋氨酸残基，Phe代表苯丙氨酸残基，Pro代表脯氨酸残基，Ser代表丝氨酸残基，Thr代表苏氨酸残基，Trp代表色氨酸残基，Tyr代表酪氨酸残基，Val代表缬氨酸残基。(1)制备HK片断和EP片断，并测定其大小：

由受减毒Oka株病毒感染的细胞或者受得自自然感染的水痘患者的小囊泡液(vesicle fluid)等感染的细胞提取并纯化VZV基因组DNA。用HpaI或EcoRI消化提取到的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳测定所得每一DNA片断的大小。为繁殖VZV，可采用WI-38细胞和MRC-细胞。优选的是，在水痘发作后3天内由自然感染的患者获得小囊泡液，这种小囊泡液用作扩增和制备新鲜野生型株的病毒基因组DNA用的样品。(2)制备PCR引物：

用一台DNA合成仪制备包括约15-30个核苷酸的邻接序列的一对多核苷酸链，其中一个多核苷酸链相应于待PCR扩增的VZV基因组DNA链之一的所需区域的5′-末端序列，另一个多核苷酸链相应于上述VZV基因组DNA链的互补链的所需区域的5′-末端序列(例如，有义链和反义链)。所制备的多核苷酸链同时用作PCR引物。当设计PCR引物用的多核苷酸的核苷酸序列时，可参照本说明书上述的现有技术。(3)制备分别相应于R2-区域的片断，测定其大小，分析其核苷酸序列：

按上述方式从小囊泡液中直接提取VZV基因组DNA之后，通过PCR分别对提取的DNA的R2-487区域和R2-1764区域进行扩增。用琼脂糖凝胶电泳测定每一扩增DNA片断的大小。可以用常规方法分析该核苷酸序列，例如双脱氧法，以及采用Cycle se-quence Kit(由TAKARA SHUZO Co.Ltd.，Japan生产并销售)的方法。

就VZV Gene14的整个编码区而言，可按与上述大体上相同的方式制备和分析DNA。减毒水痘病毒Oka株的Gene14的整个ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO.2。该序列已被阐述并由本发明的发明人首次公开。

R2是在上述Gene14中发现的一个重复序列，并且在HK片断和EP片断中都含有R2(见图1)。也可采用限制酶AccIII通过RFLP来分析扩增的R2-1764区域。(4)制备相应于限制酶PstI位点区域的一个片断，确定限制酶PstI切割位点存在与否：

按上述方式从小囊泡液中直接提取VZV基因组DNA之后，用PCR扩增提取的DNA的PstI位点区域(647bp)。用限制酶PstI消化扩增的DNA片断并进行琼脂糖凝胶电泳以确定由647bp组成的PstI位点区域是否裂解为大小分别为290bp和357bp的两部分。PstI位点区域裂解为两部分就证实PstI位点区域中存在PstI切割位点。减毒Oka株的基因组DNA在其PstI位点区域中缺少PstI切割位点，所以，扩增的DNA片断不被裂解为两部分。(5)PCR-SSCP：

采用在其各自的5′-末端标记有32P的PCR引物，通过PCR来扩增VZV基因组DNA的R2-487区域，由此获得标记过的DNA片断。对每一扩增DNA片断进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将该片断的电泳迁移率与减毒Oka株的R2-487区域的电泳迁移率进行比较。(6)包含减毒Oka株的疫苗：

该减毒Oka株病毒或由本发明鉴定的由其衍生的病毒适用于水痘疫苗的活性成分，而且这种毒株可以水痘疫苗形式提供。(7)可用作诊断用抗原的减毒水痘病毒Oka株的gpV：

从图2A和2B可清楚地看出，由本发明鉴定的减毒水痘Oka株病毒包含一氨基酸序列(SEQ ID NO.2中所示)，该序列对减毒水痘病毒Oka株具有特异性。因此，由减毒水痘病毒Oka株基因组的Gene14所编码的gpV(糖蛋白V)可有利地用作例如诊断用抗原。例如，通过采用本发明的抗原的皮内反应可以确定接种的必要性。本发明的减毒水痘病毒抗原包含一个3或更多个氨基酸、优选5个氨基酸、更优选7个氨基酸的选自SEQ ID NO.2的氨基酸序列的邻接序列。

下文中将参照实施例更详细地描述本发明，但这些实施例不应视为限定本发明的范围。实施例1

按下述对Kawaguchi毒株(它是一种野生型VZV株)和分别从9个自然感染水痘的患者的小囊泡液分离到的新鲜野生型毒株(共10个样品)进行试验。减毒Oka株被用作对照，把对10个样品进行试验的结果与对减毒Oka株进行试验的结果作比较。试验(1)测定HK片断的大小：

分别将减毒Oka株、Kawaguchi株以及分别从自然感染水痘的患者得到的9个小囊泡液样品接入MRC-5细胞中，得到感染的细胞，并对感染的细胞进行培养。在4℃、400xg下，低速离心每种细胞培养物(10⁶个细胞)5分钟，由此收集感染的细胞，并对收集到的细胞进行冻融。将收集到的每种细胞分别悬浮于5.0ml下述的裂解缓冲液中，在37℃用DNaseI和RNase A各50μg处理30分钟，然后在冰中冷却10分钟。接着，向所得各种混合物中加入2.5ml三氯三氟乙烷并剧烈搅拌6分钟，然后在4℃、400xg下低速离心15分钟，从而得到上清液。将所得各种上清液分别在间断密度梯度的双层组合物中分层，所述组合物由分别含5％(v/v)和40％(v/v)甘油的7.5ml裂解缓冲液共2层组成，将所得材料在4℃、100,000xg下超速离心70分钟，由此获得一种沉淀物。将所得每种沉淀物重悬浮于0.5ml的STE缓冲液中{1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠；0.05mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)；和10mM EDTA(2Na)}，在65℃下用500μg蛋白酶K处理3小时。通过用含水饱和酚重复进行酚提取三次，然后在-70℃进行乙醇沉淀，使所得混合物得以纯化。结果获得了10个样品VZV病毒(包括Kawaguchi株)的每一样品的基因组DNA和减毒Oka株的基因组DNA。裂解缓冲液的组成

50mM Tris-HCl缓冲液{pH7.4；Tris是“三(羟甲基)氨基甲烷”}中所含溶质及其浓度如下：3mM氯化钙；5mM乙酸镁；125mM氯化钾；1mM EDTA(2Na)(乙二胺四乙酸二钠)；1mM DTT(二硫苏糖醇)0.5％(w/v)SDC(脱氧胆酸钠)和0.5％(w/v)Nonidet P-40(由Sigma Chemical Company，USA生产并销售)。

用限制酶HpaI消化上面制备的每种基因组DNA，通过在0.5％(w/v)琼脂糖凝胶中进行的琼脂糖凝胶电泳来测定所得每种DNA片断(HK片断)的大小。结果发现，减毒Oka的HK片断的大小为3231bp，而10个试验样品中仅有3个样品的HK片断大小与减毒Oka株的相同。试验(2)测定EP片断的大小：

对上述每一样品和对照物而言，通过用限制酶处理基因组DNA而获得一种DNA片断(EP片断)，用与上面试验(1)大体相同的方式用电泳法测定所得片断的大小，所不同的是用限制酶EcoRI代替HpaI。结果发现，减毒Oka株的EP片断的大小为1749bp，而试验的10个样品中仅有3个样品的EP片断大小与减毒Oka株的相同。试验(3)测定R2-487区域的大小和核苷酸序列

减毒Oka株和Kawaguchi株各自的基因组DNA片断分别由感染了各自毒株的细胞的培养基来制备。9个新鲜野生型株的每一个的基因组DNA直接由患者的小囊泡液制备。特别是，用终浓度为5.5M的硫氰酸胍处理小囊泡液来溶解VZV基因组DNA。用酚对溶解的基因组DNA进行酚提取，然后进行氯仿/异戊醇提取，再用异丙醇沉淀法纯化，由此得到新鲜野生型株的基因组DNA。

采用PCR引物(2)和(3)由PCR扩增上面获得的基因组DNA的R2-487区域，得到R2-487片断。通过在4％(w/v)琼脂糖凝胶中进行的琼脂糖凝胶电泳测定所得每一R2-487区域的大小。结果发现，减毒Oka株的R2-487区域的大小为487bp，而试验的10个样品中仅有5个样品的R2-487区域的大小与减毒Oka株的相同。

此外，用Cycle Sequence Kit(由TAKARA SHUZO Co.Ltd.，Japan生产并销售，Manual Code No.R014)测定每种R2-487区域的核苷酸序列。将样品的R2-487区域的核苷酸序列分别与减毒Oka株的核苷酸序列进行比较，以确定核苷酸序列间的DNA同源性。同样，将样品的R2-487区域的氨基酸序列(按通用密码翻译核苷酸序列而得到)分别与Oka株的进行比较，以确定氨基酸序列间的同源性。这种确定过程是通过基因分析用的计算机软件{GENETYX(ver.9.0)；由Software Development Co.，Ltd.，Japan生产和销售}进行的。减毒Oka株的R 2-487区域的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ ID NO.1中。

减毒Oka株的R2-487区域的核苷酸序列与包括Kawaguchi株的10个样品的每一样品的核苷酸序列间的比较表明，在每一样品的R2-487区域中发现4个或更多个核苷酸有核苷酸差异，而且这种核苷酸的差异伴随有氨基酸的变化(由162个密码子所编码，即162个密码子＝487bp/3)。因此，减毒Oka株的氨基酸序列与10个样品中每一样品的氨基酸序列间的同源性低于98％。{即，487bp/3＝162个密码子；[(162个密码子-4个不同的密码子)/162个密码子]×100＝97.5％＜98％}。试验(4)测定R2-1764区域的大小：

按与上述试验(3)大体相同的方式制备每种病毒的基因组DNA，各种基因组DNA的每一R2-1764区域各自采用PCR引物(1)和(3)由PCR进行扩增，由此获得R2-1764片断。用限制酶AccIII消化获得的每个R2-1764片断，通过在4％(w/v)琼脂糖凝胶中进行的琼脂糖凝胶电泳测定每个消化的DNA片断的大小。结果发现，减毒Oka株的R2-1764片断被裂解为大小分别为1208bp和556bp的两部分，而且试验的10个样品中仅有5个样品显示与减毒Oka株相同的限制图。试验(5)确定限制酶PstI切割位点存在与否：

减毒Oka株和Kawaguchi株的各自基因组DNA片断分别由各自毒株感染的细胞的培养基来制备。9种新鲜野生型毒株的每一种的基因组DNA直接由患者的小囊泡液制备。特别是，按与前述试验(3)大体相同的方法获得VZV基因组DNA。

采用PCR引物(PS1)和(PS2)由PCR分别扩增上面制备的每个基因组DNA的PstI位点片断(647bp)。用限制酶PstI处理每个PCR产物，然后在4％(w/v)琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳以确定限制酶PstI切割位点的存在与否。结果发现，减毒Oka株和Kawaguchi株每一个的PstI位点区域(647bp)不能被裂解成两部分，由此证实不存在PstI切割位点。其它9个样品每一个的PstI位点片断被裂解成大小分别为290bp和357bp的两部分。通过PstI位点区域的裂解证实了PstI切割位点的存在。试验(6)PCR-SSCP分析：

按与上述试验(3)大体相同的方式扩增并制备10个样品中每一个样品的以及对照物的R2-487区域，所不同的是，用在其各自5′-末端分别标记有³²P的PCR引物(2)和(3)代替未标记的引物。在95℃下加热2分钟使每个PCR产物变性，在5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，由此测定每个PCR产物的电泳迁移率。结果发现，由各样品的基因组DNA制备的PCR产物没有一个显示出与由减毒Oka株的基因组DNA制备的PCR产物大体相同的电泳迁移率，而且证实了这10个样品病毒株中没有一个是减毒Oka株病毒。试验(7)分析减毒Oka株基因组DNA的Gene14的核苷酸序列：

一个相应于Gene14的整个编码区的片断是采用PCR引物(1)和(4)通过PCR由减毒Oka株的基因组DNA制备的。用一台DNA测序仪(Li-cor，USA生产和销售)分析扩增DNA的核苷酸序列。上面测定的、减毒Oka株的Gene14的整个编码区的核苷酸序列示于SEQ ID NO.2中。

此外，按与上述试验(3)大体相同的方式分析SEQ ID NO.2的氨基酸序列与现有技术中公开的每种序列(Davison和Scott，Journalof General Virology，67，1759-1816，1986；以及Kinchington等，Journal of Virology，59，660-668，1986)之间的氨基酸同源性。结果示于图2A和2B中。图2B中所示各氨基酸序列间的比较表明，氨基酸序列间存在8个氨基酸的差异(对Davison等)和9个氨基酸的差异(对Kinchington)；因此，减毒Oka株的氨基酸序列与现有技术中每种序列之间的氨基酸同源性低于99％{即，[(560a.a.-8a.a.)/560a.a.]×100＝98.6％，对Davison；[(560a.a.-9a.a)/560a.a.]×100＝98.4％，对Kinchington}。还证实，现有技术中公开的两个VZV株都具有上面试验(5)中所述的限制酶PstI切割位点。

试验(1)-(7)的结果归纳于下面表2中。

     表2减毒Oka株所符合的具体特征         不符合这些特征的样品的数目

                              (分母表示不同样品的总数)HK片断的大小[3231bp]               3/10EP片断的大小[1749bp]               3/10R2-1764区域AccIII片断的大小[1764bp→1208bp+556bp]             5/10R2-487区域大小[487bp]                        5/10PCR-SSCP[凝胶中表现的电泳迁移率]           10/10氨基酸序列[同源性：98％或更高]     10/10(低于98％)PstI位点区域[647bp]PstI片断[不存在，即，片断大小＝647bp]      [存在，即，647bp→

                               290bp+357bp]PstI限制[不存在]                   9/10(存在)Gene14编码区[1680bp]氨基酸残基数(560)氨基酸序列[同源性：99％或更高]    2/2(低于99％)

从上述可清楚地看到，通过确定是否符合上述所有8个特征，可将减毒Oka株与其它VZV株区分开并进行精确度极高的鉴定。

按照本发明的方法，能够在当今使用的减毒水痘活疫苗的生产中达到准确的质量控制和质量保证。此外，提供了一种准确、有利的技术，它可用于水痘和带状疱疹的流行病学领域的研究中，包括对疫苗效果的追踪以及PMS。所以，本发明提供了一种用于预防水痘和带状疱疹的精确而非常有效的手段，它对人类健康作出了贡献。序列表

SEQ ID NO：1

序列长度：487

序列类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

来源

生物体：水痘—带状疤疹病毒

株：减毒水痘病毒Oka株

序列描述TCG ACT GAA TCT CAA CCC ACA CCC GTA AGT ATA ATT GAA TTA TAT ACC      48Ser Thr Glu Ser Gln Pro Thr Pro Val Ser Ile Ile Glu Leu Tyr Thr 1               5                  10                  15TCG GCC GCT TCC CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC      96Ser Ala Ala Ser Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala

        20                  25                  30GCT TCC CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC     144Ala Ser Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser

    35                  40                  45CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAG     192Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg Lys

50                  55                   60CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT ACC CGA AAT CCC GAT     240Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Thr Arg Asn Pro Asp 65                 70                  75                   80CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAT CCC GAT CCC GCC     288Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg Asn Pro Asp Pro Ala

             85                 90                  95GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAT CCC GAT CCC GCC GTC GCG     336Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg Asn Pro Asp Pro Ala Val Ala

        100                 105                110CCC ACC TCG GCC GCT ACC CGA AAG CCC GAT CCC GCA GCC AAC GCC CAA     384Pro Thr Ser Ala Ala Thr Arg Lys Pro Asp Pro Ala Ala Asn Ala Gln

   115                  120                 125CAT TCA CAA CCA CCT TTT CTA TTT GAA AAT ATA CAA TGC GTT CAC GGC     432His Ser Gln Pro Pro Phe Leu Phe Glu Asn Ile Gln Cys Val His Gly

 130                135                  140GGA ATA CAA TCC ATA CCC TAT TTT CAC ACA TTT ATC ATG CCT TGT TAC     480Gly Ile Gln Ser Ile Pro Tyr Phe His Thr Phe Ile Met Pro Cys Tyr145                 150                 155                 160ATG CGT C 487Met Arg

162SEQ ID NO：2序列长度：1683序列类型：核酸链型：双链拓扑结构：线性分子类型：基因组DNA来源生物体：水痘—带状疱疹病毒株：减毒水痘病毒Oka株序列描述ATG AAG CGG ATA CAA ATA AAT TTA ATT TTA ACG ATC GCG TGT ATA CAA      48Met Lys Arg Ile Gln Ile Asn Leu Ile Leu Thr Ile Ala Cys Ile Gln 1               5                  10                  15TTA TCG ACT GAA TCT CAA CCC ACA CCC GTA AGT ATA ATT GAA TTA TAT      96Leu Ser Thr Glu Ser Gln Pro Thr Pro Val Ser Ile Ile Glu Leu Tyr

         20                  25                  30ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG     144Thr Ser Ala Ala Ser Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser

     35                  40                  45GCC GCT TCC CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT     192Ala Ala Ser Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala

 50                  55                  60TCC CGA AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA     240Ser Arg Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg 65                 70                  75                   80AAG CCC GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT ACC CGA AAT CCC     288Lys Pro Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Thr Arg Asn Pro

            85                   90                  95GAT CCC GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAT CCC GAT CCC     336Asp Pro Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg Asn Pro Asp Pro

        100                 105                 110GCC GTC GCG CCC ACC TCG GCC GCT TCC CGA AAT CCC GATCCC GCC GTC      384Ala Val Ala Pro Thr Ser Ala Ala Ser Arg Asn Pro Asp Pro Ala Val

115                   120                  125GCG CCC ACC TCG GCC GCT ACC CGA AAG CCC GAT CCC GCA GCC AAC GCC     432Ala Pro Thr Ser Ala Ala Thr Arg Lys Pro Asp Pro Ala Ala Asn Ala

130                 135                 140CAA CAT TCA CAA CCA CCT TTT CTA TTT GAA AAT ATA CAA TGC GTT CAC     480Gln His Ser Gln Pro Pro Phe Leu Phe Glu Asn Ile Gln Cys Val His145             150                     155                 160GGC GGA ATA CAA TCC ATA CCC TAT TTT CAC ACA TTT ATC ATG CCT TGT     528Gly Gly Ile Gln Ser Ile Pro Tyr Phe His Thr Phe Ile Met Pro Cys

            165                 170                 175TAC ATG CGT CTA ACG ACC GGA CAA CAG GCG GCC TTT AAG CAG CAA CAA     576Tyr Met Arg Leu Thr Thr Gly Gln Gln Ala Ala Phe Lys Gln Gln Gln

        180                 185                 190AAA ACA TAT GAA CAA TAT TCT TTA GAT CCG GAA GGT TCA AAT ATA ACA     624Lys Thr Tyr Glu Gln Tyr Ser Leu Asp Pro Glu Gly Ser Asn Ile Thr

    195                 200                 205AGG TGG AAG TCG CTT ATA CGC CCC GAT CTT CAT ATT GAA GTT TGG TTT     672Arg Trp Lys Ser Leu Ile Arg Pro Asp Leu His Ile Glu Val Trp Phe

210                 215                 220ACG CGT CAC CTT ATA GAT CCG CAC CGT CAA CTG GGC AAT GCG TTA ATA     720Thr Arg His Leu Ile Asp Pro His Arg Gln Leu Gly Asn Ala Leu Ile225                 230                 235                 240CGC ATG CCA GAT TTA CCG GTT ATG TTA TAT AGC AAC AGT GCC GAT TTA     768Arg Met Pro Asp Leu Pro Val Met Leu Tyr Ser Asn Ser Ala Asp Leu

        245                     250                 255AAC TTA ATA AAC AAC CCT GAG ATA TTT ACA CAC GCT AAG GAA AAT TAT     816Asn Leu Ile Asn Asn Pro Glu Ile Phe Thr His Ala Lys Glu Asn Tyr

        260                 265                 270GTA ATA CCA GAT GTT AAA ACA ACG TCT GAT TTT TCT GTA ACA ATT TTA     864Val Ile Pro Asp Val Lys Thr Thr Ser Asp Phe Ser Val Thr Ile Leu

    275                 280                 285TCT ATG GAT GCT ACC ACG GAG GGA ACG TAT ATT TGG CGA GTC GTT AAT     912Ser Met Asp Ala Thr Thr Glu Gly Thr Tyr Ile Trp Arg Val Val Asn

290                 295                 300ACA AAA ACT AAG AAC GTC ATA TCG GAA CAC AGT ATT ACA GTT ACA ACG     960Thr Lys Thr Lys Asn Val Ile Ser Glu His Ser Ile Thr Val Thr Thr305                 310                 315                 320TAT TAT CGT CCA AAT ATT ACC GTT GTC GGC GAT CCA GTC TTA ACC GGA    1008Tyr Tyr Arg Pro Asn Ile Thr Val Val Gly Asp Pro Val Leu Thr Gly

325                 330                 335CAG ACA TAC GCA GCC TAC TGT AAC GTA TCA AAG TAT TAT CCA CCG CAC    1056Gln Thr Tyr Ala Ala Tyr Cys Asn Val Ser Lys Tyr Tyr Pro Pro His

        340                 345                 350TCG GTA CGT GTT CGG TGG ACT TCA AGG TTT GGT AAC ATC GGA AAA AAT    1104Ser Val Arg Val Arg Trp Thr Ser Arg Phe Gly Asn Ile Gly Lys Asn

    355                 360                 365TTT ATA ACC GAT GCA ATA CAA GAA TAT GCC AAT GGA TTA TTT AGT TAT    1152Phe Ile Thr Asp Ala Ile Gln Glu Tyr Ala Asn Gly Leu Phe Ser Tyr

370                 375                 380GTT TCG GCG GTA CGA ATT CCA CAG CAA AAA CAA ATG GAT TAC CCA CCC    1200Val Ser Ala Val Arg Ile Pro Gln Gln Lys Gln Met Asp Tyr Pro Pro385                 390                 395                 400CCA GCC ATC CAA TGT AAT GTT TTA TGG ATT CGG GAT GGC GTC TCT AAT    1248Pro Ala Ile Gln Cys Asn Val Leu Trp Ile Arg Asp Gly Val Ser Asn

            405                 410                 415ATG AAA TAT TCT GCT GTC GTT ACC CCT GAC GTC TAT CCA TTT CCC AAC    1296Met Lys Tyr Ser Ala Val Val Thr Pro Asp Val Tyr Pro Phe Pro Asn

        420                 425                 430GTG TCT ATA GGT ATT ATT GAT GGA CAC ATA GTA TGT ACG GCA AAA TGT    1344Val Ser Ile Gly Ile Ile Asp Gly His Ile Val Cys Thr Ala Lys Cys

    435                 440                 445GTG CCA CGT GGC GTT GTA CAT TTC GTA TGG TGG GTT AAC GAT TCT CCC    1392Val Pro Arg Gly Val Val His Phe Val Trp Trp Val Asn Asp Ser Pro

450                 455                 460ATC AAC CAC GAA AAC AGT GAG ATT ACT GGG GTG TGT GAT CAA AAC AAA    1440Ile Asn His Glu Asn Ser Glu Ile Thr Gly Val Cys Asp Gln Asn Lys465                 470                 475                 480CGG TTT GTA AAC ATG CAA AGT TCT TGT CCA ACA TCG GAA CTC GAC GGA    1488Arg Phe Val Asn Met Gln Ser Ser Cys Pro Thr Ser Glu Leu Asp Gly

            485                 490                 495CCT ATC ACC TAT TCG TGT CAT CTA GAT GGT TAC CCT AAA AAA TTC CCT    1536Pro Ile Thr Tyr Ser Cys His Leu Asp Gly Tyr Pro Lys Lys Phe Pro

        500                 505                 510CCG TTT TCG GCC GTT TAT ACC TAC GAT GCA TCT ACC TAC GCC ACT ACA    1584Pro Phe Ser Ala Val Tyr Thr Tyr Asp Ala Ser Thr Tyr Ala Thr Thr

    515                 520                 525TTT TCC GTT GTA GCA GTT ATA ATT GGT GTG ATA TCT ATC CTT GGG ACA    1632Phe Ser Val Val Ala Val Ile Ile Gly Val Ile Ser Ile Leu Gly Thr

530                 535                 540TTG GGT CTT ATC GCA GTT ATC GCA ACC CTA TGC ATC CGT TGC TGT TCA    1680Leu Gly Leu Ile Ala Val Ile Ala Thr Leu Cys Ile Arg Cys Cys Ser545                 550                 555                 560TAA 1683SEQ ID NO：3序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述GATGGATATA ATCCACACCC                                              20SEQ ID NO：4序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述GACGCATGTA ACAAGGCATG                 20SEQ ID NO：5序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述TCGACTGAAT CTCAACCCAC                 20SEQ ID NO：6序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述GATGTTTCCA AATCTAACTC                 20SEQ ID NO：7序列长度：25序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述AAGTTTGAGC CAACGTGCCA ATAAA           25SEQ ID NO：8序列长度：23序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其它核酸，合成的DNA PCR引物序列描述AGACGCGCTT AACGGAAGTA ACG                23