高等植物质体中的核－编码的转录系统

摘要

本发明提供了用于稳定地转化高等植物质体的新的DNA构建物和方法。本文所述的构建物包含由核编码的质体聚合酶和质体编码的质体聚合酶转录的单一的启动子。本发明的新构建物的应用方便了更广范围的植物种类的转化,使转化的DNA能在多细胞植物中进行组织特异地表达。

说明书

发明领域

本发明涉及植物基因工程，特别是高等植物中的质体基因转化。本发明提供了可用于不同植物种类中表达感兴趣外源基因新的启动子序列。

发明领域

叶绿体基因以包含质体-编码亚单位的RNA聚合酶转录，其中的亚单位与大肠杆菌RNA聚合酶α，β及β′亚单位同源。该酶所用启动子与大肠杆菌σ⁷⁰-启动子类似，包括-35和-10共同元件(G.L.Igloi和H.Kossel，植物科学的主要综述10，525，1992；W.Gruissem和J.C.Tonkyn，植物科学的主要综述12：-19，1993)质体编码的RNA聚合酶对启动子的选择依赖于核编码的sigma-样因子((Link等1994，植物启动子和转录因子，Springer Verlag，Heidelberg，63-83页)。另外，一些启动子的转录活性由核编码的与中心启动子上游的元件相互作用的转录因子调控(L.A.Allison和P.Maliga，EMBO杂志14：3721-3730；R.Iratni，L.Baeza，A.Andreeva，R.Mache，S.Lerbs-Mache，基因Dev.8，2928，1994)。这些因子介导质体基因表达的核调控，应答于发育和环境的变化。

已有关于质体中另一个转录系统存在的推测。然而，迄今为止还没有支持这一推测的直接证据。质体中另一新的转录系统的确认代表了植物基因工程领域一个巨大的进步。这样的系统使用于质体转化的植物种类具有更大的自由度和范围，并利于通过可由重组DNA技术操纵的构建物进行外源蛋白和RNAs的组织特异地表达。

发明概述

本发明提供了用于稳定地转化多细胞植物质体的DNA构建物和万法。本发明的DNA构建物扩展了能被转化的植物种类范围，并利于感兴趣的外源基因的组织特异地表达。

根据本发明的一个方面，提供了含有被核编码的质体(NEP)RNA聚合酶识别的新启动子序列的DNA构建物。DNA构建物包括一个转化DNA，后者包括定靶部分，用于插入至少一个感兴趣的外源基因的至少一个克隆位点，感兴趣的外源基因的表达由NEP聚合酶识别的启动子调控，及质体可选择的标记基因。

增加感兴趣的外源基因的表达的为质体编码的质体(PEP)RNA聚合酶识别的启动子因子的应用是本发明的另一个方面。如上所述的构建物，这些构建物也包括一个定靶部分，和一个用于感兴趣的外源基因表达的克隆位点。

质体编码的质体RNA聚合酶识别的启动子特征存在于光合组织，如叶中。而本发明的核编码的聚合酶转录系统指导质体基因的表达，亦存在于根，种子和分生组织中。大多数植物包括玉米，棉花和小麦中，植物的再生通过体细胞的胚胎产生完成(即，涉及分生组织)。在本发明的一个优选方案中，通过本发明的NEP质体转化系统，启动子和聚合酶的应用，大大便利了这些农作物的有效的质体转化。

本发明的NEP启动子插入现有的质体转化载体，其应用方法，见如美国专利No.5,451,513及美国未决申请号08/189,256，所述，和由Svab&Maliga所述，美国国家科学院院刊，90，913(1993)，其公开内容均引入本文的参考文献。为获得转基因植物，用可选的标记基因转化非光合组织的质体，标记基因由NEP启动子表达，由核编码的聚合酶转录。类似地，为表达感兴趣的蛋白，用由核编码的聚合酶转录的NEP启动子，构建用于非光合组织的高水平表达的表达试剂盒。本发明的另一方面中，本发明的PEP启动子插入现有的质体转化载体及其使用方法。

本发明的另一方面，通过双重NEP/PEP启动子的使用，还将NEP转录系统与σ⁷⁰-型系统结合起来。

附图简述

图1.烟草质体基因组中定向基因置换造成的rpoB的缺失。(A)通过质粒PLAA57中aadA侧翼的质体DNA序列同源重组(对角线)，导致野生型质体基因组(ptDNA)中rpoB(Sacl至SmaI片段)为aadA序列取代。产生ΔrpoB质体基因组(ΔrpoB ptDNA)。缩写：rpoB，rpoC1，rpoC2是编码大肠杆菌样RNA聚合酶的β，β′，β″亚单位的质体基因；aadA是一个嵌合的抗壮观霉素基因。限制性酶识别位点：P，Pst I；Sm，Sma I；Sc，Sac I。(B)色素缺乏与rpoB缺失相关。从来源于三个独立转化株(Nt-pLAA57-11B株，第1和2泳道；Nt-pLAA57-16B株，第3和4泳道；Nt-pLAA57-18C株，第5和6泳道)和野生型绿叶组织(Nt，第7泳道)的绿色(第1，3，5泳道)和白色(第2，4，6泳道)叶组织分离总细胞DNA。DNA用Pst I进行消化，胶印迹与含部分rpoC1(图1A中的深黑线)的DNA片段(核苷酸位置ptDNA的22883-24486，按照K.Shinozaki，等(EMBO杂志5，2043，1986)编号)杂交。探针与野生基因组的一个9.0kb片段杂交，与来自ΔrpoB ptDNA的一个4.2kb片段杂交。(C)DNA胶印迹分析确证了Nt-pLAA57-10A株的白色枝条(第2泳道)和来自同一株的嫁接嵌合植物的白色种子后代(第3泳道)中野生型ptDNA拷贝的缺失。野生型绿叶组织的DNA载于1泳道。注意ΔrpoB植物中野生型ptDNA片段的缺失。印迹制法同图1B。

图2.rpoB的缺失导致色素缺乏的表型。(A)显示了绿色野生型(左)，色素缺乏的ΔrpoB(右)，及嵌合(中)植物。(B)温室中开花的嵌合植物。注意白色的叶缘表明第二叶层中的ΔrpoB质体，它形成了种系细胞。

图3.(A)ΔrpoB植物叶肉细胞中的质体(P)缺少系统的光合作用膜。缩写：N，核；V，囊(vesicles)；M，线粒体(B)为比较起见，显示了具有类囊体膜(T)的野生型叶绿体(Cp)的电子显微照片。(A)和(B)中的放大倍率均为7,800X。

图4.(上部分)ΔrpoB植物中质体mRNA的积累(A)光合成基因和(B)遗传系统基因。凝胶印迹由总细胞RNA制备(A，每泳道3微克；B，每泳道5微克)来自野生型(1，3，5泳道)及ΔrpoB(2，4，6泳道)叶组织，与指出的质体基因序列杂交。(下部分)以上所示印迹再以25S rDNA序列探测。杂交信号通过一个分子动力学PhosphorImager定量，并使之标准化至25S rRNA信号。每泳道下显示了对于每个探针野生型的信号强度高出ΔrpoB的倍数。

图5.ΔrpoB植物中转录从一个不规范启动子开始。(A)用引物延伸分析来定位野生型(1，3泳道)和ΔrpoB(2，4泳道)植物中rbcL和16SrDNA转录本5′末端。初级转录本由圈标出(野生型为空心，ΔrpoB为实心)，加工转录本由三角标出。未知起源的转录本用星号标出。用与引物延伸反应中相同的引物产生伴随的序列梯(加样顺序GATC)。每个延伸产物旁边的数字标出了距rboL编码序列的第一个核苷酸和成熟的16S rRNA第一个核苷酸的距离。(B)定位野生型(第2泳道)和ΔrpoB(第3泳道)植物中的16S rRNA的初级转录本。总叶RNA(20微克)体外加帽，带帽的16S rRNA与互补的RNA探针杂交后通过RNA酶保护识别。带帽保护的产物如(A)中标出。第一泳道包括所示大小的标准RNA。(C)16S rDNA上游区的DNA序列和始于质体编码(σ⁷⁰型，P1)和核编码(P2)的聚合酶(P1，P2的名称基于A.Vera和M.Sugiura，现代基因学27，280，1995)的启动子的转录本。共同的启动区(-35和-10)框出。起始位点如(A)和(B)中，以圈标出。从16S rDNA编码区上游的第一个核苷酸开始编号(烟草质体基因组中，-1＝核苷酸102757)。

图6.野生型和ΔrpoB烟草叶中质体mRNA的累积。质体基因的印迹(见实施例I)如下分组。(A)野生型叶中mRNA显著多于ΔrpoB植物的叶中。(B)野生型和ΔrpoB植物的叶中mRNA水平相当，或(C)ΔrpoB叶中mRNA水平较高。凝胶印迹用来自野生型(第一泳道)和ΔrpoB(第二泳道)叶组织的总细胞RNA(每泳道3微克)制备，与所示质体基因序列杂交。(较低的组)为控制载样，上面所示的印迹再与25SrDNA序列杂交。

图7.定位野生型和ΔrpoB烟草叶中atpB转录起始位点。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)样品得到的末端标记的引物延伸产物与用相同引物得到的同源序列并排跑胶。序列旁边的数字指示距ATG翻译起始位点的距离。从NEP和PEP得到的初级转录本分别以实心和空心圈标出。(B)体外加帽和RNA酶保护试验来确认初级转录本的5′末端。各泳道分别载以带有(2，4)和不带(1，5)保护的互补反义RNA的ΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA样品。分子量(MW)标记物(100，200，300，400和500核苷酸)载于第三泳道。(A)中转录本5′末端对应于括号中保护的片段大小：-254(277nt)，-289(311)。注意未保护的RNA样品中出现在200nt标记物稍下方的伪迹。(C)atpB-rbcL两个基因间区的物理定位。atpB NEP和PEP启动子的初级转录本5′末端的定位如(A)中标出。

图8.定位野生型和ΔrpoB烟草叶中atpI转录起始位点。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)样品得到的末端标记的引物延伸产物与用相同引物得到的同源序列并排跑胶。序列旁边的数字指示距ATG翻译起始位点的距离。从NEP和PEP得到的初级转录本分别以实心和空心圈标出。(B)体外加帽和RNA酶保护试验来确认初级转录本的5′末端。各泳道分别载以带有(2，4)和不带(1，5)保护的互补反义RNA的ΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA样品。分子量(MW)标记物(100，200，300，400和500核苷酸)载于第三泳道。(A)中转录本5′末端对应于括号中保护的片段大小：-130(235nt)，-207，209，212(303，305，309；未分离)。注意未保护的RNA样品中出现在200nt标记物稍下方的伪迹。(C)rps2-atpI两个基因间区的物理定位。atpI NEP和PEP启动子的初级转录本5′末端的定位如(A)中标出。

图9.定位野生型和ΔrpoB烟草叶中clpP转录起始位点。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)样品得到的末端标记的引物延伸产物与用相同引物得到的同源序列并排跑胶。序列旁边的数字指示距ATG翻译起始位点的距离。从NEP和PEP得到的初级转录本分别以实心和空心圈标出。(B)体外加帽和RNA酶保护试验来确认初级转录本的5′末端。各泳道分别载以带有(2，4)和不带(1，5)保护的互补反义RNAΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA样品。分子量(MW)标记物(100，200，300，400和500核苷酸)载于第三泳道。(A)中转录本5′末端对应于括号中保护的片段大小：-53(96nt)，-95(138nt)，-173(216nt)，及-511(69nt)。注意未保护的RNA样品中出现在200nt标记物稍下方的伪迹。(C)clpP-psbB两个基因间区的物理定位。clpP NEP和PEP启动子的初级转录本5′末端的定位如(A)中标出。

图10.定位野生型和ΔrpoB烟草叶中accD转录起始位点。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)样品得到的末端标记的引物延伸产物与用相同引物得到的同源序列并排跑胶。序列旁边的数字指示距ATG翻译起始位点的距离。PaccD-129 NEP启动子的初级转录本以实心圈标出。(B)体外加帽和RNA酶保护试验来确认初级转录本的5′末端。各泳道分别载以带有(2，4)和不带(1，5)保护的互补反义的RNAΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA样品。分子量(MW)标记物(100，200，300，400和500核苷酸)载于第三泳道。(A)中-57转录本5′末端对应于保护的103nt片段。注意未保护的RNA样品中出现在200nt标记物稍下方的人工产物。(C)accD-rbcL两个基因间区的物理定位。标出了PaccD-129 NEP启动子的初级转录本5′未端的定位。

图11.NEP启动子转录起始位点侧翼的DNA序列排列。框出多于六对匹配的核苷酸。转录起始位点邻近的共同序列在下面显示。5′末端的位置以实心圈标出。注意，Prps12-152和Prps16-107没有加帽，可能不是初级转录本。

图12.通过识别不同的启动子，NEP和PEP聚合酶提供了质体基因选择性转录的机制。注意一些基因只有PEP启动子(光系统I和光系统II)，其它既有PEP，又有NEP启动子(大多数管家基因)，或仅有NEP启动子(accD)。

图13.NEP启动子表达的嵌合质体基因的系统图。

发明详述

若干报道认为存在另外的，质体中存在的，核编码的RNA聚合酶(综述于Gruissem和Tonkyn，1993；Igloi和Kossel，1992；Mullet，1993；Link，1994)。通过使编码烟草大肠杆菌样RNA聚合酶的必需β亚单位的rpoB基因缺失，另一个由核编码的质体转录系统的存在得以证明(Allison等，1996，EMBO杂志15：2802-2809)。rpoB基因的缺失产生了光合作用缺陷的，色素缺乏的植物。对ΔrpoB植物叶肉细胞中的质体超微结构的研究发现了原质体样细胞器，它缺乏作为具有光合作用活性的叶绿体的特点的堆积排列的类囊体膜。光合作用基因rbcL，psbA，及psbD的转录本很低，而rp116，atpI，及16S rDNA的mRNA则累加至相当于野生型或高于野生型水平。光合作用基因转录本累加的缺乏归因于σ⁷⁰型启动子活性的缺乏。野生型烟草叶中，核糖体RNA操纵子通常从σ⁷⁰型启动子转录，而ΔrpoB植物中，rRNA操纵子则由非σ⁷⁰启动子转录。rRNA操纵子是质体编码的和核编码的质体RNA聚合酶(分别为PEP和NEP)所识别的第一个转录单位。

其它基因的启动子区的分析表明rRNA操纵子并非唯一。它是一大类质体基因的一员，这类基因对于PEP和NEP之每一至少有一个启动子，并能被两个质体RNA聚合酶中的任意一个表达。另外，仅为NEP转录的质体基因也被确认。而且，数据表明在不同质体型中有其它基因特异的机制调节NEP转录水平。

已确认了成熟的16SrRNA 5′末端上游约62个碱基处的一个NEP转录起始位点。起始位点周围的序列在众多研究的植物种类中高度保守，与PEP启动子共同序列无相似性。对核编码的聚合酶的识别和结合很重要的NEP启动子共同序列(与大肠杆菌型转录起始位点-10和-35序列类似)优选位于NEP转录起始位点任一方向约50个核苷酸以内。如实施例1中更详细的描述，存在一些不同的NEP启动子，有时发现NEP启动子与PEP启动子相连。

本发明的聚合酶可通过色谱用标准方法纯化。柱级分中的NEP聚合酶活性可用包括NEP启动子区的DNA部分作为模板在体外转录反应中进行测试。或者，NEP启动子部分可结合于可通过某些方法(如磁珠)分离的基质上。基质结合的DNA与植物提取物在核编码的聚合酶可与DNA结合的条件下温育。然后从植物提取物中分离基质/DNA/聚合酶复合物，结合的蛋白可被分离和鉴定。为了分离编码核编码的聚合酶的核基因或cDNA，通过以上述方法的任一种纯化的蛋白可用于产生抗体来探测表达库。

分离NEP聚合酶的另一个途径中，对启动子部分具有特异亲合性的蛋白可被分离，并通过微量测序测得N-末端的氨基酸序列。然后可利用氨基酸序列设计适当的，用于基因分离的PCR引物。

过去已知的质体编码的σ⁷⁰型转录系统的活性特征存在于光合作用活性组织，如叶中。而本发明的核编码的聚合酶转录系统还可指导根，种子和分生组织中的质体基因的表达。大多数植物中，包括玉米，棉花和小麦，植物的再生是通过体细胞的胚胎生成(也就是说涉及分生组织)完成的。通过使用的本发明的NEP质体转录系统，能使这些农作物中进行有效的质体转化，或大大促进之。

本发明的NEP启动子可插入现有的质体转化载体及其应用方法中，如美国专利No.5,451,513和未决的美国申请No.08/189,256中所述，及Svab&Maliga所述，美国国家科学院院刊90，913(1993)，这些在本文均穿插于文献中。为获得转基因植物，非光合作用组织的质体以NEP启动子表达的可选择的标记基因转化，以核编码的聚合酶转录。类似地，为表达感兴趣的蛋白，在非光合作用组织中用核编码的聚合酶转录的NEP启动子构建用于高水平表达的表达盒。通过使用双重NEP/PEP启动子，NEP转录系统还可与σ⁷⁰型系统相结合。在某些情况下，在光合作用组织中由NEP启动子表达转基因也是可以的。

以下实施例I-III中的详细描述阐明了制备和使用本发明的DNA构建物及实施本发明的方法的优选方法。任何未特殊指出的分子克隆和重组DNA技术均通过标准方法进行，如，Ausubel(编辑)，分子生物学现行方法.John Wiley&Sons，Inc.(1994)中通常提出的。

以下非限制性的实施例更详尽地描述了本发明。

                         实施例1

        通过rpoB的缺失论证另一个不同的质体转录系统

为在质体中建立非大肠杆菌样RNA聚合酶存在的模型，使大肠杆菌样酶的必需亚单位之一的基因从烟草质体基因组中缺失。然后测定突变质体中的mRNA水平。数据提示，缺少质体编码的大肠杆菌样酶时，一些光基因的表达显著降低。而编码基因表达器官的质体基因的转录水平却与野生型植物中类似。因此，非大肠杆菌样RNA聚合酶选择性地转录质体基因的一个分支。这一转录器官不从典型的大肠杆菌σ⁷⁰-启动子启动，而识别一个新的启动子序列。

实施例I的方法和材料

质粒的构建.质粒PLAA57是一个pBSKS+(Stratagene)衍生物，它将SacI带到ptDNA的Bam HI片段(核苷酸22658至29820)中。ptDNA嵌入物中，核苷酸24456与28192间的SacI至SmaI DNA片段，为嵌合的抗壮观霉素(aadA)基因取代。aadA基因除psbA 3′区较短并包含于所述(J.M.Staub和P.Maliga，植物学杂志6，547，1994)XbaI至DraI片段中外，与所述(Z.Svab和P.Maliga，美国国家科学院院刊90，913，1993)完全相同。

植物的转化.为进行质体转化，以pLAA57 DNA包被(Z.Svab和P.Maliga，美国国家科学院院刊  90，913，1993)钨粒，然后用DuPontPDS1000He Biolistic枪1100p.s.i.将后者引入烟草属植物叶中。在含500毫克/毫升壮观霉素二盐酸盐的RMOP培养基上无菌挑选转基因苗(Z.Svab，P.Hajdukiewicz，P.Maliga，美国国家科学院院刊87，8526，1990)。转基因的切割物植于并维持在包括琼脂糖固化的含3％蔗糖的MS盐(T.Murashinge和F.Skoog，植物生理学15，493，1962)的RM培养基上。

电子显微照像.用来自生长于含3％蔗糖RM培养基的无菌培养液中的野生型和ΔrpoB插条之完全展开的叶进行电子显微照像。组织在2％戊二醛，0.2％蔗糖，0.1M磷酸盐缓冲液(PH6.8)中室温混合2小时，以0.2％蔗糖，0.1M磷酸盐缓冲液洗三次。混合的组织在1％四氧化锇和0.2％蔗糖缓冲液中再混合，在乙醇中脱水，包埋于Spurr′s环氧树脂中(硬)，切片，乙酸双氧铀和枸缘酸铅染色以进行电子显微照像。

凝胶印迹.总叶DNA按所述方法(I.J.Mettler，植物分子生物学报告5，346，1987)制备，以限制性内切酶PstI消化，在0.7％琼脂糖凝胶上分离，用Posiblot转移工具(Stratagene)转移至Hybond N(Amersham)。在迅速杂交缓冲液(Amersham)中65℃与任意引物标记的片段过夜杂交。总叶RNA按生产厂商的方法，用TRIzol(GIBCOb BRL)制备。RNA在1％琼脂糖/甲醛胶上电泳，然后转移至尼龙膜上，按DNA印迹的方法探测。

探针的合成.psbA，atpI，和rp116的双链DNA探针以任意引物PCR产生的³²P标记的DNA片段来制备。用于PCR的引物序列及它们在烟草ptDNA中的位置(K.Shinozaki，等EMBO杂志5，2043，1986)如下：psbA 5′引物＝5′-CGCTTCTGTAACTGG-3′(互补于ptDNA的1550至1536位核苷酸)，3′引物＝5′-TGACTGTCAACTACAG-3′(667至682位核苷酸)，atpI，5′引物＝GTTCCATCAATACTG-3′(与核苷酸15985至15971互补)，3′引物＝5′-GCCGCGGCTAAAG TT-3′(核苷酸15292至15306)；rp116 5′引物＝5′-TCCCACGTTCAAGGT-3′(与核苷酸84244至84230互补)，3′引物＝5′-TGAGTTCGTATAGGC-3′(核苷酸83685至83699)。为产生rbcL，psbD/C和16SrRNA的探针，以下限制性DNA片段进行³²p标记：rbcL，Bam HI片段(ptDNA中核苷酸58047至59285)；psbD/C烟草psbD/C操纵子(核苷酸138447至140855)的Sav II至Hind II；16S RNA，E.co RI至E.co RV片段(ptDNA中核苷酸138447至140855)片段。

烟草25SrRNA的探针来自质粒pKDR1(D.Dempsey，K.W.Wobbe，D.F.Klessig，分子植物病理学83，1021，1993)包含一个来自在质粒pBR325中克隆的烟草25S/18S位点的3.75kb Eco RI片段。当与25S rRNA的凝胶印迹杂交时，³²P标记的双链DNA探针与未标记的质粒pKDR1混合，对应于存在于滤器上RNA量的2倍多。

质体基因组拷贝数校正DNA水平。为研究质体基因组拷贝数的改变是否对基因表达的估侧区别有贡献，总细胞DNA和RNA从来自野生型和ΔrpoB植物的等量的叶组织制备。为比较每一等量叶组织的质体基因组拷贝数，用等体积的每份DNA制备物进行DNA凝胶印迹，以放射标记的16S rDNA序列Eco RI至Eco RV片段探测(ptDNA的核苷酸138447至140845)(K.Shinozaki，等，EMBO杂志5，2043，1986)。PhosphorImage分析定量表明每个样品中有等量的质体基因组拷贝数。通过等体积的每份RNA制备物上进行RNA凝胶印迹测定表明，来自于等量组织样品的16S RNA的量，在ΔrpoB植物中降低了2.5倍。这一值与以胞浆25SrRNA信号校正时估侧的3倍降低(图3B)类似。

引物延伸反应.引物延伸反应用3微克(野生型)或10微克(ΔrpoB)的总叶RNA按所述(L.A.Allison和P.Maliga，EMBO杂志，正在印刷中)进行，利用以下引物：16S rRNA：5′-TTCATAGTTGCATTACTTATAGCTTC-3′(与核苷酸102757-102732互补)；rbcL：5′-ACTT GCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACAT(与核苷酸57616-57587互补)。序列梯以相同的引物利用Sequenase II kit(USB)产生。

体外加帽确认初级转录本.来自野生型和ΔrpoB植物的总叶RNA(20微克)在[α-³²p]GTP存在下加帽(J.C.Kennell和D.R.Pring，Mol.Gen.Genet.216，16，1989)。标记的16SrRNA通过核糖核酸酶保护(A.Vera和M.Sugiura，植物分子生物学19，309，1992)而用RPAII kit(Ambion)检测。为制备保护的互补RNA，16SrDNA上游区(ptDNA的核苷酸102526-102761)用下列引物进行PCR扩增：5′引物为5′-CCTCTAGACCCTAAGCCCAATGTG-3′其对应于ptDNA的核苷酸102526和102541(K.Shinozaki，等，EMBO杂志5，2043，1986)，下划线)加XbaI位点；3′引物为5′-CCGGTACCGAGATTCATAGTTGCATTAC-3′与ptDNA的核苷酸102761至102742互补(下划线)加Kpn I位点。扩增产物作为Xba I至Kpn I片段克隆到Xba至Kpn I限制的pBSKS+载体(Stratagene)。为产生与16SrRNA5′末端互补的未标记RNA，所得质粒与Xba I排成线性，在Megascript(Ambion)反应中用T3 RNA聚合酶转录。标记物(100，200，300，400和500核苷酸)用RNA Century Markers TemplateSet(Ambion)，按生产厂商的方法制备。72核苷酸标记物是来自质粒trnV基因的成熟的加工后转录本，通过RNA酶保护产生。

结果与讨论

破坏烟草质体中的大肠杆菌样RNA聚合酶活性导致色素缺乏的表型。为避免破坏其它功能的质体基因，缺失定靶于ΔrpoB基因，因为它是唯一编码大肠杆菌样质体聚合酶亚单位的操纵子的第一个阅读框架(K.Shinozaki，等，EMBO杂志5，2043，1986)。通过一个克隆的质体DNA(ptDNA)片段中的嵌合的，抗壮观霉素(aadA)基因(Z.Svab和P.Maliga美国国家科学院院刊90，913，1993)取代rpoB编码区的大部分(3212个碱基对的3015个)和上游非编码序列的691bp来完成缺失。所得质粒通过粒子轰击引入烟草叶绿体中，在此aadA基因通过质体DNA侧翼序列整合入质体基因组，如图1A所示。由于质体基因系统为高度多倍体，每个叶细胞包含完全相同的ptDNA拷贝达10,000个，转化的基因组的选择性扩增通过使被轰击的组织在含有壮观霉素的培养基上生长来进行。

挑选的第一轮可得到许多表现部分白色叶组织的抗壮观霉素植物(图2A)。对三个独立转化株的白色和绿色部分的DNA凝胶印迹分析提示色素缺乏与rpoB的缺失相关(图1B)。大部分的色素缺乏组织，如图1B的第四列，包含野生型和转化基因组拷贝的混合物。野生型ptDNA的缺失对于这些数据的解释很重要。因此，为获得只含转化质体基因组的植物，从白色部分再生幼苗。根据DNA凝胶印迹分析判断(图1C)，这一过程产生了一致的不含野生型ptDNA的白色植物(图2A)。在无壮观霉素的培养基上从这些白色叶再生，全部得到色素缺乏幼苗，证实了所有叶层和细胞型中完全缺失野生型质体基因组。

从生长于无菌培养液中的烟草植物很难得到种子。偶然地，植物由原代转化物再生期间，我们得到了一个周缘嵌合体(S.Poethig，基因学趋势5，273，1989)，与L2叶层的质体突变同质(图2A)。此株嫁接于野生型烟草，温室中长至成熟(图2B)。自传粉的花所得的种子产生一律的白色籽苗，其DNA凝胶印迹分析检测不到任何野生型质体基因组(图1C)。

ΔrpoB植物的叶的质体中缺乏类囊体膜.色素缺乏的ΔrpoB植物不能光能自养地生长。然而，如果保持在含蔗糖的培养基上来补偿其缺乏的光合作用，它们生长正常，但与野生型植物相比，速度降低，没有表现明显的器官形态学变化。而且，ΔrpoB籽苗高效率地发芽，长成植物。这些观察提示植物生长和分化所必须的非光合成的质体功能的维持不需要大肠杆菌样质体RNA聚合酶。

ΔrpoB植物叶肉细胞的质体超微结构研究表明突变质体比野生型叶绿体小和圆，长约2-5微米，而野生型叶绿体长度约5-9微米。因此，ΔrpoB质体较未分化的原质体大，后者平均大小为1微米(M.R.Thomas和R.J.Rose，植物学158，329，1983)。另外，ΔrpoB质体通常含有不规则大小和形状的多种囊泡，缺乏堆积的类囊体膜排列，后者为具光合作用活性的叶绿体的特征(图3)。

ΔrpoB质体中质体基因的转化得以维持.无β亚单位时，质体σ⁷⁰型无法转录。为测定ΔrpoB质体中是否有转录活性维持，用RNA凝胶印迹分析了RNA累积。研究了两类不同质体基因的转录(K.Shinozaki，等，EMBO杂志5，2043，1986)。第一组包括编码光合作用器官亚单位的基因：psbD/C操纵子，编码光系统II的亚单位D2和CP43；rbcL，编码核酮糖-1，5-二磷酸酯羧酸酶的大亚单位；及psbA，编码光系统II反应中心的D1亚单位。第二组包括基因表达器官组分的编码基因：rp116，编码核糖体蛋白亚单位和16S rDNA基因。所用质体RNA的量校正至胞浆25S核糖体RNA水平。

奇怪的是，检测到了所有测试基因的mRNA累积。然而，两类基因的ΔrpoB缺失对转录累积的影响则显著不同。光合成基因psbD/C，rbcL，和psbA的稳态mRNA水平与野生型相比降低了40-100倍(图4A；长时间暴露所有ΔrpoB列均可见信号)。而核编码的聚合酶基因的转录水平所受影响则小得多。测得16SrRNA有3倍降低，来自于包含rp116基因的多顺反子操纵子的多重转录本还观察到了确实的升高(图4B)。这些数据表明，尽管ΔrpoB植物中编码光合作用器官的基因的表达缺损，涉及看家功能的RNA仍能累积至约野生型，或更高水平。

ΔrpoB植物中16SrDNA基因为一新的启动子转录.质体RNA的累积证实了缺乏大肠杆菌样酶β亚单位的质体中有RNA聚合酶活性。已有证明质体基因迁移至核(S.L.Baldauf和J.D.Palmer，自然334，262，1990；J.S.Gantt，S.L.Baldauf，P.J.Calie，N.F.Weeden，J.D.PaImer，EMBO杂志10，3073，1991；M.W.Gray，基因学发展的当前观点3，884，1993)。因此，可以想象如果存在ΔrpoB的核拷贝，其产品能被转入质体，组装成功能化的大肠杆菌样酶，质体的转录仍能从σ⁷⁰型启动子启动。为确立ΔrpoB植物中发现的质体转录本是否源于σ⁷⁰型启动子转录的产物，定位了四个基因的5′转录末端，rbcL(K.Shinozaki和M.Sugiura，基因20，91，1982)，16S rDNA(A.Vera和M.Sugiura，当前基因学27，280，1995)，psbA(M.Sugita和M.Sugiura，Mol.Gen.Genet.195，308，1984)及psbD(W.B.Yao，B.Y.Meng，M.Tanaka，M.Sugiura，核酸研究17，9583，1989)，它们的转录起始位点过去已确定。没有一个5′末端定位在σ⁷⁰型启动子起始位点(图5A中，未显示rbcL和16S rDNA的数据)。因此可得出结论，ΔrpoB质体中残余的RNA聚合酶活性并不归因于大肠杆菌样酶，而代表另一个独特的质体转录系统。这一不同的RNA聚合酶被命名为核编码的质体RNA聚合酶(NEP)，以区别于我们命名为质体编码的质体RNA聚合酶(PEP)的大肠杆菌样酶。既然烟草质体基因组的序列已全部测出，且极少数未确认的阅读骨架与已知的RNA聚合酶亚单位没有序列相似性(K.Shinozaki，等，EMBO杂志5，2043，1986)，通过核编码的RNA聚合酶的转录依赖于核基因产物。

在ΔrpoB植物的来自σ⁷⁰型启动子转录的缺乏中，问题仍然存在：什么启动子是质体RNA来源。ΔrpoB植物中发现的16SrRNA 5′未端定位于成熟的16SrRNA 5′末端上游62核苷酸(图5A)。体外定位测得这一5′末端为一初级转录本(图5B)。最近有报道在异养培养的烟草细胞的原质体中存在具有类似5′末端的一个重要的初级转录本，被命名为P2(A.Vera和M.Sugiura，当前基因学27，280，1995)；这个转录本在野生型叶细胞中也低水平的存在(A.Vera和M.Sugiura，当前基因学27，280，1995；图5A，长时间暴露，未显示)。起始位点周围的序列在所测的所有植物种类中高度保守，与σ⁷⁰共同序列无任何相似性(A.Vera和M.Sugiura，当前基因学27，280，1995)。基于ΔrpoB植物中其重要的用途，可得出结论，这一独特的启动子为NEP转录器官使用。

与16SrRNA不同，光合作用基因rbcL，和psbD/C的主要转录本定位于先前定义的加工末端(rbcL的数据见图5：L.hanley-Bowdoin，E.M.Orozco，N.H.Chua，分子细胞生物学5，2733，1985；S.Reinbothe，C.Reinbothe，C.Heintzen，C.Seidenbecher，B.Parthier，EMBO杂志12，1505，1993)。其它的少数转录本末端定位在加工末端的上游。因此，这些光合作用基因转录本累积的低水平是上游启动子活性和随后的通读RNA剪切以产生适当大小转录本的结果。

两个质体转录系统的推测功能.ΔrpoB植物中存在NEP系统转录的RNA的累积。这提示核编码的RNA聚合酶在维持质体看家基因的表达中的作用。显然这些表达水平足够支持非光能自养植物的生长和分化。而为光合作用活性叶绿体的发育提供高水平的质体基因转录本则需要大肠杆菌样PEP RNA聚合酶。推测的核编码的RNA聚合酶的功能暗示在叶绿体发展的早期，PEP RNA聚合酶活化前，对其功能的高度需求(J.E.Mullet，植物生理学103，309，1993)。核编码的RNA聚合酶对发育的调控还被16SrDNA的核编码的聚合酶P2启动子在培养的烟草细胞原质体中比在叶绿体中更活泼这一观察结果支持(A.Vera和M/Sugiura，当前基因学27，280，1995)。

                       实施例II

高等植物中两个不同的RNA聚合酶进行转录是基因表达的普遍调

                       控机制

如实施例I所述，缺乏PEP聚合酶的植物中转录本的累积导致质体核糖体RNA操纵子NEP启动子的确认(Allison等，1996，EMBO杂志14：3721-3730)。为便于其它的NEP启动子的定位，研究了ΔrpoB植物中大多数质体基因的mRNA累积。本文所述这一新的启动子序列可扩大适于进行质体转化的物种范围，并促进感兴趣的外源基因组织特异地的表达。

实施例II的材料和方法

RNA凝胶印迹根据生产厂商的方法，用TRIzol(GIBCO BRL)制备总叶RNA.RNA在1％琼脂糖/甲醛胶上电泳，然后用Posiblot转移工具(Stratagene)转移至Hybond N(Amersham)。在迅速杂交缓冲液(Amersham)中65℃与任意引物标记的片段过夜杂交。双链DNA探针以任意引物PCR产生的³²P标记的DNA片段来制备。用于PCR的引物序列及它们在烟草ptDNA中的位置(K.Shinozaki，等1986，见上)如下：

  基因质体DNA中5′核苷酸位置    序列accD            60221               GGATTTAGGGGCGAA

            60875               GTGATTTTCTCTCCGatpB            56370(C)            AGATCTGCGCCCGCC

            55623               CCTCACCAACGATCCatpI            15985(C)            GTTCCATCAATACTC

            15292               GCCGCGGCTAAAGTTclpP            73621(C)            GACTTTATCGAGAAAG

            73340               GAGGGAATGCTAGACGndhA                    122115(C)              GATATAGTGGAAGCG

                    121602                 GTGAAAGAAGTTGGGndhB                    97792(C)               CAGTCGTTGCTTTTC

                    97057                  CTATCCTGAGCAATTndhF                    113366(C)              CTCGGCTTCTTCCTC

                    112749                 CTCCGTTTTTACCCCORF1901                 129496(C)              GTGACTATCAAGAGG

                    128895                 GACTAACATACGCCCGORF2280                 92881                  GCTCGGGAGTTCCTC

                    93552                  TGCTCCCGGTTGTTCpetB                    78221                  GGTTCGAAGAACGTC

                    78842                  GGCCCAGAAATACCTpsaA                    43467(C)               TTCGTTCGCCGGAACC

                    42743                  GATCTCGATTCAAGATpsbB                    75241                  GGAGCACATATTGTG

                    75905                  GGATTATTGCCGATGpsbE                    66772(C)               CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC

                    66452                  GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCCrps14                   38621                  CACGAAGTATGTGTCCGGATAGTCCrp133/rp118             70133                  GGAAAGATGTCCGAG

                    70636                  GTTCACTAATAAATCGAC

rps16 mRNA用分离自包含烟草ptDNA序列的核苷酸4938至5363和6149至6656的质粒pJS40的EcoRI片段探测(Shinozaki等，见上)。烟草25SrRNA的探针来自质粒pKDR1(Dempsey等，分子植物病理学83；1021，1993)，包含在质粒pBR325中克隆的烟草25S/18S位点的3.75kb的EcoRI片段。当与25SrRNA的凝胶印迹杂交时，³²P标记的双链DNA探针与未标记的质粒pKDR1混合，对应于存在于滤器上RNA量的2倍多。

引物延伸反应.引物延伸反应用10微克(野生型)或10微克(ΔrpoB)的总叶RNA按所述(Allison和Maliga，EMBO杂志，15：2802-2809)进行。引物列于下。下划线的寡核苷酸也被用于产生加帽构建物。

  基因质体DNA中5′核苷酸位置    序列

accD           59758            CCGAGCTCTTATTTCCTATCAGACTAAGC

atpB           56736            CCCCAGAACCAGAAGTAGTAGGATTGA

atpI           15973            GTATTGATGGAACATGATAGAACAT

clpP#1         74479            GGGACTTTTGGAACACCAATAGGCAT

clpP#2         74947            GGGAGCTCCATGGGTTTGCCTTGG

ORF1901        31451            CTTCATGCATAAGGATACTAGATTACC

ORF2280        87419            GGGAGCTCTACATGAAGAACATAAGCC

rps2           16921            CCAATATCTTCTTGTCATTTCTCTC

rps16          6185             CATCGTTTCAAACGAAGTTTTACCAT

序列梯以相同的引物利用Sequenase II kit(USB)产生。

体外加帽确认初级转录本.来自野生型和ΔrpoB植物的总叶RNA(20微克)在[α-³²P]GTP存在下加帽(Kennell和Pring，1989，Mol.Gen.Genet.216：16-24)。标记的RNA被核糖核酸酶保护(Vera和Sugiura，1992，见上)用RPAII kit(Ambion)检测。为制备保护的互补RNA，16SrDNA上游区(ptDNA的核苷酸102526-102761)用下列引物进行PCR扩增。设计5′引物以在扩增片段的上游加入一个XbaI位点(下划线)。设计3′引物以在扩增片段的下游加入一个Kpn I位点(下划线)。扩增产物如Xba I至Kpn I片段克隆到Xba至Kpn I限制的pBSKS+载体(Stratagene)。为产生与16SrRNA5′末端互补的未标记RNA，所得质粒与Xba I排成线性，在Megascript(Ambion)反应中用T3 RNA聚合酶转录。标记物(100，200，300，400和500核苷酸)用RNA Century MarkersTemplate Set(Ambion)，按生产厂商的方法制备。

  基因质体DNA中5′核苷酸位置    序列

accD          59758              CCGAGCTCTTATTTCCTATCAGACTAAGC

              59576              CCGGTACCATAGGAGAAGCCGCCC

atpB          56750              CCGAGCTCGTAGTAGGATTGATTCTCA

              57131(C)           CCGGTACCGGAGCCAATTAGATACAAA

atpI          15895              CCGAGCTCTGACTTGGAAACCCCC

              16277(C)           CCGAATTCTAGTATTCGCAATTTGT

clpP          74462              GGGAGCTCCAGGACTTCGGAAAGG

             74752(C)                       GGGGTACCAATACGCAATGGGG

             74947                          GGGAGCTCCATGGGTTTGCCTTGG

             75080(C)                       GGGGTACCGCTAATTCATACAGAG

ORF1901      31424                          GGGAGCTCCGACCACAACGACCG

             31724(C)                       GGGGTACCCTTACATGCCTCATTTC

ORF2280      87419                          GGGAGCTCTACATGAAGAACATAAGCC

             87154                          GGGGTACCGTGCCTAAGGGCATATCGG

DNA序列分析利用Wisconsin序列分析软件包(基因学计算机小组，INC.)进行DNA序列分析。

结果与讨论

基于野生型和ΔrpoB叶中mRNA的累积，质体基因可分为三类。第一类包括那些基因，其mRNA在野生型叶中累积至高水平，而在ΔrpoB植物的叶中累积至很低水平(图6A)。属于这类的基因有psaA(光系统I基因)，psbB和psbE(光系统II基因)，petB(细胞色素b6/f复合物基因)，ndhA(呼吸链NADH脱氢酶同系物；Matsubayashi等，1987Mol.Gen.Genet.210：385：393)及rps14(核糖体蛋白基因)。第二类包括质体基因，它们的mRNA在野生型和ΔrpoB叶中累积至几乎相等水平(图6B)。这类基因包括atpB(ATP合成酶基因)，ndhF(呼吸链NADH脱氢酶同系物基因；Matsubayashi等，1987，见上)，rps16(核糖体蛋白基因)及ORF1901(未知功能的一个基因；Wolfe等，1992，分子生物学杂志223：95-104)。第三类包括在中mRNA累积显著多于野生型植物的叶中的基因(图6C)。这类的典型基因为rp133和rp118(核糖体蛋白基因)，accD(编码乙酰辅酶A羧化酶的一个亚单位；Sasaki等，1993，植物生理学108：445-449)和ORF2280(推测为ATP酶，功能未知；Wolfe，1994，当前基因学，25：379-383)。这类的另外两个基因，ndhB(呼吸链NADH脱氢酶同系物；Matsubayashi等，1987，见上)，及clpP(编码Clp ATP-依赖的蛋白酶蛋白水解亚单位；Maurizi等，1990，生物化学杂志265：12546-12552；Gray等，1990，植物分子生物学15：947-950)组成这类的一个亚组，其野生型叶中有相当的mRNA水平。

atpB和atpI ATP合成酶基因既有NEP，又有PEP启动子

RNA凝胶印迹分析确认了许多基因和操纵子，它们在ΔrpoB叶中保持了高的转录水平。为识别别的NEP启动子，许多转录本的5′末端通过引物延伸分析加以定位。5′末端可能是确认启动子的初级转录本，或由RNA加工产生。由于初级质体转录本的5′末端保留了三磷酸酯基，特异的[³²P]GMP被鸟苷转移酶转移至这些RNA分子，使准确地区分初级转录本和加工的末端成为可能。烟草atpB操纵子，转录本5′末端已被Orozco等确认(1990，当前基因学17：65-71)在翻译起始密码的上游，核苷酸位置-611，-502，-488，-289，和-255(图7C)。5′末端相对于翻译起始密码(ATG)计数，当核苷酸直接在A的上游，即在位置-1。引物延伸分析在我们的野生型植物中确认了这些5′末端的每一个(图7A)。在ΔrpoB样品中，只存在-289 RNA，其5′末端是鸟苷转移酶的底物(图7B)。因此，-289 RNA由一NEP启动子，PatpB-289转录。有趣的是，-289转录本存在于野生型叶中，尽管不如ΔrpoB植物中丰富。ΔrpoB植物中没有-255，-488和-611转录本(图7A)。含这些启动子(但无PatpB-289)的DNA片段为大肠杆菌RNA聚合酶识别(Orozco等，1990，见上)，被质体中的PEP转录。atpA操纵子包括atpI，-atpH-atpF-atpA基因(图8C)。野生型烟草叶中，mRNA5′末端已被定位于atpI上游的三个区：-209区，5′末端定位于核苷酸-212，-209和-207，及位于核苷酸-130和-85的5′末端。在ΔrpoB叶中，只有-207转录本可检测到(图8A)。这个转录本可在ΔrpoB RNA样品中加帽(图8B)，因此，它由NEP启动子转录。在野生型RNA样品的体外加帽反应中也获得了这一位置的信号。-209和-212转录本可能归因于一个重叠的PEP启动子的活性，或野生型植物中NEP启动子多重转录本的形成。只存在于野生型叶RNA中的-130转录本也可被加帽(图8A，8B)。由于该5′末端上游有适当间隔的类似于-10/-35序列，它是由一个PEP聚合酶转录的。

clpP NEP启动子在叶绿体中高度表达。

clpP蛋白酶亚单位基因亦属于既含NEP又含PEP启动子的一类。野生型植物的引物延伸分析确认了在核苷酸-53，-95和-173位置的RNA5′末端，而在ΔrpoB植物中，5′末端定位于-53，-173和-511核苷酸位置(图9A)。体外加帽反应证明这些都是初级转录本(图9B)。其中的三个转录本由NEP启动子得到。PclpP-53在野生型和ΔrpoB植物中均高度表达，因此代表了一类不同的NEP启动子，具有在不同的组织型中高水平表达的能力。PclpP-53在菠菜中高度保守(Westhoff，1985，Mol.Gen.Genet.201：115-123)。另外的NEP clpP启动子为PclpP-173和PclpP-511。由于PclpP-511转录本只在ΔrpoB植物中累积(图9A)，它可作为调节NEP启动子的候选。还要注意，PclpP-511位于psbB密码区以内，其表达可能受趋同的psbB PEP启动子影响(图9C)。

直接位于clpP上游的唯一PEP启动子是PclpP-95。由这一启动子得到的RNA仅在野生型叶中累积，PclpP-95具有使人想起-10-/-35保守区的上游序列(未显示)。

accD基因仅由NEP启动子转录。

就磷脂生物合成基因accD而言，mRNA只在ΔrpoB植物中累积至高水平。主要转录本启动于核苷酸位置-129(图10A)，它可在体外加帽(图10B)。因此，这个RNA是由NEP启动子转录的。由于PaccD-129在具光合作用活性的叶肉细胞中没有显著活性，它可以作为具有不同的，组织特异的表达方式的调节NEP启动子的候选。

NEP启动子具有邻接转录起始位点的不严格共同序列

校准转录起始位点侧翼序列以确定保守的NEP启动子元件(图11)。包括在此序列校准中的有本研究确认的九个启动子和Prnn-62，Allison等所述的NEP启动子(1996，见上)。还包括通过体外带帽证明其5′末端为初级转录本的PORF2280-1577及PORF1901-41(未显示数据)。这些启动子均在ΔrpoB叶中有活性，而在野生型叶中无活性。假定的NEP启动子rps2和rps16也包含在此序列校准中，它们在ΔrpoB叶中有更多的mRNA。这些转录本的5′末端通过引物延伸分析定位。体外加帽实验由于mRNA的低含量失败(未显示数据)。紧邻NEP5′末端侧翼区多个序列的校准，证实了转录起始位点周围10个核苷酸不严格共同序列(图11)。上游和下游其它核苷酸的保守也很明显。令人吃惊的是PclpP-53和其它的在叶绿体中高度活性的唯一的NEP启动子间缺乏序列保守性。由于缺乏序列相似性，这一序列不包括在序列校准中。PclpP-53转录起始位点周围的序列在图11底部单独列出。

通过识别不同的启动子，NEP和PEP聚合酶，提供了质体基因选择性转录的机制(图12)。本文提供的数据论证了仅含PEP启动子或NEP启动子的一些基因，而其它含有PEP和NEP的调节序列。

                   实施例III

       用于选择性标记基因表达的NEP启动子

考虑到通用性和广泛应用，很希望在各种组织类型中高水平地表达可选择的用于质体转化的标记基因。目前应用的质体转化载体中的可选择标记基因都是由质体编码的RNA聚合酶识别的PEP启动子表达。PEP聚合酶转录光合作用基因和一些看家基因，故而似乎是光合作用活性叶组织中主要的RNA聚合酶。基于叶细胞中叶绿体的转化，实现了烟草中有效的质体转化。而植物从大多数农学上重要的谷类作物，包括玉米，水稻，小麦和棉花的叶中的再生却不可行，或者说不实际。这些农作物中，转基因植物通常通过转化胚胎生长组织培养细胞或籽苗组织来得到。由于这些组织是非光合作用的，由在非绿色组织中有活性的NEP启动子表达标记基因显得尤其优越，将便于在所有非光合作用组织类型中质体的转化。

一个尤其合适的驱动标记基因表达的启动子是PclpP-53启动子。这个启动子在ΔrpoB植物的原质体中高度表达，因此它可能在产生转基因谷类植物的胚胎生成细胞培养液的原质体中亦高度表达。由于发现启动子在叶绿体中有活性，由这些启动子表达标记基因也将适合于在轰击的叶培养物中挑选质体转化体。由这些启动子，如PclpP-53启动子表达的标记基因将在获得转化质体中具有广泛应用。

可选择的标记基因将用美国专利No.5,451,513中列出的规则构建，其主题在本文插入在参考文献中。图13中列出了一个转化的DNA构建物。更特异地，PclpP-53启动子将克隆在编码质体可选择的标记物的DNA部分上游。通过在启动子片段和可选择的标记物密码区间插入适当的DNA序列来提供翻译的信号。用于提供转录终止信号和稳定嵌合mRNA的质体基因的3′非翻译部分将被克隆在可选择的标记物的下游。既然对NEP和PEP聚合酶的转录终止的要求可能不同，优选利用NEP启动子表达的基因的3′非翻译区。

PclpP-53是一个尤其强的NEP启动子。而具有转化质体的植物也可通过弱的启动子得到。前面的实施例中有一些这样的弱启动子，例如PclpP-173。

NEP启动子驱动的组织特异的质体转基因的表达

有组织特异的质体转基因的表达可望用于许多应用。一种使植物组织对根线虫排斥或有毒的蛋白的组织特异地表达对根来说是理想的。而同样的蛋白在叶中的表达将可能使植物资源流失，并影响空中植物部分的利用。由于多数情况下在非绿色组织中表达，本发明所述的NEP启动子，及通常由NEP聚合酶表达的启动子，是转基因表达的组织特异启动子的一个丰富来源。

一些NEP启动子，如PclpP-511，在ΔrpoB植物的原质体中高度表达。原质体存在于花椰菜的食用部分。因此，在花椰菜中外源基因的高水平表达预期由位于植物的食用部分的该启动子驱动。

质体基因accD编码原核生物的乙酰辅酶A羧化酶的一个亚单位，乙酰辅酶A羧化酶参与磷脂的生物合成。有趣的是，野生型叶中accDmRNA水平很低，而ΔrpoB植物的原质体中，其水平很高。这一观察表明PaccD-129活泼参与磷脂生物合成的组织，如富含油的生长中的种子质体，的非绿色质体中有活性。