公开/公告号CN1186501A
专利类型发明专利
公开/公告日1998-07-01
原文格式PDF
申请/专利权人 人类基因组科学公司;
申请/专利号CN95197892.6
申请日1995-06-23
分类号C07K16/24;C07K14/52;C12N1/20;C12N15/09;C12N15/19;C12N15/63;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人李瑛
地址 美国马里兰州
入库时间 2023-12-17 13:08:58
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2006-08-23
专利权的终止未缴年费专利权终止
专利权的终止未缴年费专利权终止
2003-10-22
授权
授权
1998-08-19
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1998-07-01
公开
公开
此申请是未决申请08/446,881(1995年5月5日在美国专利和商标局申请)的部分继续申请。
本发明涉及新近鉴定的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的产生。更具体地说，本发明的多肽已被推定性地鉴定为人类趋化因子β-8(Ckβ-8)、巨噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4)和趋化因子β-1(Ckβ-1)。本发明也涉及抑制这些多肽的作用的方法。
趋化因子，也称为intercrine细胞因子，是结构和功能相关的细胞因子的亚家族。这些分子的大小为8-10kd。一般来说，趋化因子在氨基酸水平上显示出20％至75％的同源性，以形成两个二硫键的四个保守的半胱氨酸残基为特征。以前两个半胱氨酸残基的排列为基础，将趋化因子分成两个亚家族，α和β。在α亚家族中，前两个半胱氨酸由一个氨基酸分开，因此称为″C-X-C″亚家族。在β亚家族中，这两个半胱氨酸在邻近的位置上，因此称为″C-C″亚家族。至此，在人类中已经鉴定了这个家族的至少8个不同的成员。
intercrine细胞因子显示出各种功能。一个标志特征是它们引起不同细胞类型(包括单核细胞、嗜中性细胞、T-淋巴细胞、嗜碱细胞和成纤维细胞)的趋化迁移的能力。许多趋化因子具有促炎活性并且与炎性反应的多个步骤有关。这些活性包括组胺释放、溶酶体酶和白细胞三烯释放的刺激作用，增加靶免疫细胞吸附到内皮细胞上，增强补体蛋白的结合，诱导粒细胞吸附分子和补体受体的表达及突发性呼吸。除了和炎症有关外，已表明某些趋化因子显示出其它活性。例如，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)能够抑制造血干细胞的增殖，血小板因子-4(PF-4)是有力的内皮细胞生长抑制物，白介素-8(IL-8)促进角化细胞的增殖，而GRO是黑素瘤细胞的自分泌生长因子。
根据多样化的生物活性，趋化因子和很多生理和疾病状态(包括淋巴细胞运输、创伤愈合、造血调节和免疫紊乱(如变态反应、气喘和关节炎))有关，这一点并不奇怪。造血谱系调节物的例子是MIP-1。原来将MIP-1鉴定为巨噬细胞产生的内毒素诱导的促炎细胞因子。后来的研究表明MIP-1由两种不同的，但是相关的蛋白质MIP-1α和MIP-1β组成。MIP-1α和MIP-1β都是巨噬细胞、单核细胞和T淋巴细胞的化学引诱物。有趣的是，多潜能干细胞抑制物(SCI)的生物化学纯化和接下来的序列分析表明SCI和MIP-1α相同。并且，已表明MIP-1β能抵消MIP-1α抑制造血干细胞增殖的能力。此发现导致了这样一个假说，即MIP-1的主要生理作用是调节骨髓的造血，而所提出的炎性功能是次要的。MIP-1α作为干细胞抑制物的作用方式与其在G1/S核分裂间期阻断细胞周期的能力有关。并且，MIP-1α的抑制作用似乎受未成熟的祖先细胞限制，而其在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSP)存在的情况下对晚期的祖先具有真正的刺激作用。 已经克隆了几组趋化因子，它们可能是MIP-1α和MIP-1β的人类同系物。在所有的情况下，从针对激活的T细胞RNA制备的文库中分离cDNA。 可以在早期的创伤炎症细胞中检测MIP-1蛋白，已表明MIP-1蛋白诱导创伤成纤维细胞产生IL-1和IL-6。此外，当或者皮下注射到小鼠的脚垫(footpad)上，或者脑池内注射到兔的脑脊髓液中时，天然的纯化MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起急性炎症(Wolpe和Cerami，1989，FASEB J.3：2565-73)。除了MIP-1的这些直接或间接的促炎性质外，在使用无菌伤口室的实验小鼠模型中，在伤口愈合的早期炎性阶段，重新获得MIP-1(Fahey，等，1990，细胞因子，2：92)。例如，PCT申请WO92/05198(由Chiron公司申请)公开了一种在酵母中作为产生哺乳动物巨噬细胞炎性蛋白(MIPS)模板的活性DNA分子。
鼠MIP-1α和MIP-1β是不同的但十分相关的细胞因子。这两种蛋白质的部分纯化混合物影响嗜中性功能并引起局部的炎症和发热。已在酵母细胞中表达了MIP-1α并将其纯化成同质性。结构分析确认了MIP-1α与PF-4和IL-8具有相似的二级和三级结构，并与它们共有限定的序列同源性。也证明了MIP-1α在体内是活性的，保护小鼠的干细胞，防止后来其在体外由氚化的胸苷杀死。也表明MIP-1α促进更多的定型祖先粒细胞巨噬细胞集落形成细胞在响应粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的增殖(Clemens.J.M.等，细胞因子，4：76-82(1992))。
原来在母专利申请中称为MIP-1γ的本发明的多肽(Ckβ-1)，基于氨基酸序列的同源性其为β趋化因子家族的新成员。原来在母专利申请中称为MIP-3的Ckβ-8多肽，基于氨基酸序列的同源性也是β趋化因子家族的新成员。
按照本发明的一个方面，其提供了新的成熟多肽，它们是人类Ckβ-8、人类MIP-4和人类Ckβ-1以及它们的具有生物学活性并且诊断或治疗上有用的片段、类似物及衍生物。
按照本发明的另一个方面，其提供了编码这些多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及它们具有生物学活性的和诊断或治疗上有用的片段、类似物及衍生物。
按照本发明的另一个方面，其提供了通过重组技术产生这些多肽的方法，这一方法包括在促进所说的蛋白表达的条件下培养包含核酸序列的重组原核生物和/或真核生物的宿主细胞，并回收所说的蛋白质。
按照本发明的另一个方面，其提供了这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如保护骨髓干细胞防止其在化疗期间受到化学治疗试剂的损害，除去白血病细胞，刺激免疫反应，调节造血和淋巴细胞的运输，治疗牛皮癣、固体肿瘤，促进宿主针对有抵抗力的慢性和急性感染的防御，和刺激创伤愈合。
按照本发明的另一个方面，其提供了抗这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面，其提供了这些多肽的拮抗剂，它们可用于抑制这些多肽的作用，例如抑制IL-1和TNF-α的产生，治疗再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征、哮喘、关节炎。
按照本发明的另一个方面，其提供了包含足够长度的核酸分子的核酸探针，以便特异性地和Ckβ-8、Ckβ-1和MIP-4核酸序列杂交。
按照本发明的另一个方面，其提供了检测与这些多肽表达不足和过量表达有关的疾病以及检测编码这些多肽的核酸序列的突变的诊断测定方法。
按照本发明的另一个方面，其提供了为了开发用于治疗人类疾病的治疗剂和诊断剂这一目的，将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸作为与科学研究、DNA合成和DNA载体制造有关的体外研究试剂的方法。
通过本文的教导，本领域的技术人员应该清楚本发明的这些和其它方面。
下列附图用来说明本发明的实施方案，而无意于用来限制权利要求所限定的本发明的范围。
图1是编码Ckβ-8的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的21个氨基酸代表推定的前导序列。所有的信号序列通过杆状病毒表达的蛋白质的N末端肽测序而确定。
图2是编码Ckβ-1的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的19个氨基酸代表前导序列。
图3是编码MIP-4的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的20个氨基酸代表前导序列。
图4显示了Ckβ-8(上面)和人类MIP-1α(下面)的氨基酸同源性。显示了所有趋化因子的四个半胱氨酸特征。
图5是两个氨基酸序列，其中上面的序列是人类MIP-4氨基酸序列，下面的序列是人类MIP-1α(人类扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白前体)。
图6显示了Ckβ-1(上面)和人类MIP-1α(下面)的氨基酸序列对比。
图7是凝胶照片，HA标记的Ckβ-1在COS细胞中表达后，将Ckβ-1在其上进行电泳。
图8是Ckβ-1在杆状病毒表达系统表达和纯化后的SDS-PAGE凝胶照片。
图9是Ckβ-8在杆状病毒表达系统表达和三步纯化后的SDS-PAGE凝胶照片。
图10.使用48孔的微室装置(Neuro Probe公司)通过趋药性测定确定了Ckβ-8的化学引诱物活性。实验方法如制造商手册所描述。对于每种实验的Ckβ-8浓度，在5个高倍视野(field)中检验了迁移。所得的结果表示两次独立实验的平均值。显示了对THP-1细胞(A)和PBMCs(B)的化学引诱物活性。
图11.使用Hitachi F-2000荧光分光光度计测定了响应Ckβ-8的胞内钙浓度的变化。将细菌表达的Ckβ-8加入到Indo-1荷载的THP-1细胞中至最终浓度为50nM，并监测钙浓度的胞内水平。
图12.以LPS(0.1-10ng/ml)或者Ckβ-8(至50ng/ml)处理单核细胞系THP-116个小时。把组织培养物的上清液进行ELISA分析以定量TNF-α的分泌。
图13.以用量不断增加的Ckβ-8(由杆状病毒产生)处理通过淘析法纯化的人类外周血单核细胞。将组织培养物的上清液进行ELISA分析以定量TNF-α、IL-6、IL-1、GM-CSF和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的分泌。
图14.将低密度的小鼠骨髓细胞群体接种(1,500个细胞/平皿)在含有琼脂，含有或不含有指示趋化因子(100ng/ml)，但含有IL-3(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)和M-CSF(5ng/ml)的培养基中。所示的数据表示从两次独立实验所获得的平均值(每一个实验都进行重复)。在接种后的14天计数集落。含有趋化因子时产生的集落数表示为不含有任何加入的趋化因子时产生的集落数的平均百分数。
图15说明了Ckβ-8和Ckβ-1对小鼠骨髓集落经HPP-CFC(A)和LPP-CFC(B)形成的作用。
图16说明了杆状病毒表达的Ckβ-1和Ckβ-8对M-CFS和SCF刺激的新分离的骨髓细胞集落形成的作用。
图17说明了Ckβ-8和Ckβ-1对IL-3和SCF刺激的骨髓细胞的lin群体的增值和分化的作用。
图18.Ckβ-8和Ckβ-1对骨髓细胞的lin群体的GR-1和Mac-1(表面标记)阳性细胞群体产生的作用。将lin细胞在添加了IL-3(5ng/ml)和SCF(100ng/ml)(单独(a))及Ckβ-8(50ng/ml)(b)或Ckβ-1(50ng/ml)的生长培养基中培养。然后将细胞用抗骨髓分化GR.1、Mac-1、Sca-1和CD45R表面抗原的单克隆抗体染色，并通过FACScan分析。所示的数据为阳性细胞占大(A)和小(B)细胞群体的百分数。
图19说明了Ckβ-8(+)的存在抑制了骨髓细胞响应IL-3、M-CSF和GM-CSF的集落形成。
图20.剂量反应的Ckβ-8抑制骨髓细胞集落的形成。如图19分离和处理细胞。在基于琼脂集落形成测定中将处理的细胞以1,000个细胞/平皿的密度，在IL-3、GM-CSF或M-CSF(5ng/ml)存在及有或没有Ckβ-8(1，10，50和100ng/ml)的情况下接种。所示的数据以特定因子单独存在时形成的集落数的百分比表示集落的形成。所说的数据是各重复平皿的平均值，误差条表明标准差。
图21.在造血生长因子存在或不存在的情况下，Ckβ-8和Ckβ-1对编程性细胞死亡的诱导。从股骨和胫骨中冲洗(flush)小鼠骨髓细胞，以ficol密度梯度分离小鼠骨髓细胞，通过塑料吸附除去单核细胞。将所得的细胞群体在以MEM为基础的添加了IL-3(5ng/ml)、GM-CSF(5ng/ml)、M-CSF(10ng/ml)和G-CSF(10ng/ml)，另外加入或不加入Ckβ-8(50ng/ml)或Ckβ-1(250ng/ml)的培养基中过夜培养。此外，在单独含有或不含有Ckβ-8和Ckβ-1的培养基中培养细胞。24小时后，收获细胞，使用boehringermannheim细胞死亡ELISA试剂盒诱导编程性细胞死亡。数据表示在背景基础上增加的百分比，所考虑的背景是在每一种生长因子存在的情况下培养的培养物中编程性细胞死亡发生的量。
图22.人类单核细胞中编码Ckβ-8的RNA的表达。从新淘析的单核细胞中分离总RNA，并经100U/ml hu rIFN-g或者100ng/ml LPS或者两者处理。在1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离每一个处理的RNA(8μg)，并转移到尼龙膜上。通过经32P标记的cDNA的探测定量Ckβ-8 mRNA，通过光密度计在得到的放射自显影照片上定量所说的带。
按照本发明的一个方面，其提供了分离的核酸(多核苷酸)，这些核酸编码具有图1，2和3推定的氨基酸序列的成熟多肽(分别为SEQ ID NO.2，4和6)，或者编码由以ATCC 75676(1994年2月9日保藏)保藏的克隆的cDNA编码的Ckβ-8多肽，和编码由以ATCC 75675(1994年2月9日保藏)保藏的克隆的cDNA编码的成熟MIP-4多肽，和编码由以ATCC 75572(1993年10月13日保藏)保藏的克隆的cDNA编码的Ckβ-1多肽。
编码本发明多肽的多核苷酸结构上与属于细胞因子或趋化因子家族的促炎超基因“intercrine”有关。Ckβ-8和MIP-4是MIP-1的同系物，并且对MIP-1α比对MIP-1β更同源。编码Ckβ-8的多核苷酸来源于主动脉内皮的cDNA文库，并含有一个编码120个氨基酸残基多肽的开放读框，这种多肽对许多趋化因子显示出明显的同源性。顶端匹配是对人类巨噬细胞炎性蛋白1α的匹配，显示出36％等同性和66％相似性(图4)。
编码MIP-4的多核苷酸来源于人类成熟的肺脏cDNA文库，并含有一个编码89个氨基酸残基多肽的开放读框，这种多肽对许多趋化因子显示出明显的同源性。顶端匹配是对人类扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白的匹配，显示出60％等同性和89％相似性(图5)。并且，在所有的趋化因子中以特征基元存在的四个半胱氨酸残基在两个克隆中都是保守的。在此基因中，前两个半胱氨酸残基在相邻位置上的事实将它们分为趋化因子的″C-C″或者β亚家族。在其它的亚家族(″CXC″或α亚家族)中，前两个半胱氨酸残基由一个氨基酸残基分开。
编码Ckβ-1的多核苷酸含有编码93个氨基酸多肽的开放读框，此多肽的前19个氨基酸是前导序列，这样所说的成熟多肽含有74个氨基酸残基。Ckβ-1对人类巨噬细胞炎性蛋白α显示出明显的同源性，在80个氨基酸的一段序列中，具有48％的等同性和72％的相似性。并且，包含特征基元的四个半胱氨酸残基是保守的。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链，如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1，2和3所示的(SEQ ID NO.1、3和5)或保藏的克隆的编码序列相同；由于遗传密码的丰余性或简并性，这种编码序列也可以是一种不同的编码序列，其能和图1，2和3的DNA(SEQ ID NO.1、3和5)或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1，2和3(SEQ ID NO.2，4和6)的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：仅仅是编码成熟多肽的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列，如前导或分泌序列或前蛋白序列；编码成熟多肽的编码序列(和有或无附加的编码序列)和非编码序列，如内含子或编码成熟多肽的编码序列的5′和/或3′端的非编码序列。
这样，“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体，这种变体编码具有图1，2和3(SEQ ID NO.2，4和6)的推定的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸的等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。
这样，本发明包括编码如图1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸，以及编码如图1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的片段、类似物和衍生物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或插入变体。
正如上文所表明的，这种多核苷酸可以具有图1、2和3(SEQ ID NO.1、3和5)中所示的或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体的编码序列。在本领域大家都知道等位变体是多核苷酸序列的另一种形式，其中多核苷酸序列可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，这不会从实质上改变编码多肽的功能。
本发明也包括这样的多核苷酸，其中所说的编码成熟多肽的序列可以在相同的阅读框架中融合进多核苷酸序列，这种多核苷酸序列有助于宿主细胞中多肽的表达和分泌，比如说具有分泌序列功能的前导序列控制细胞中多肽的转运。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，宿主细胞切除这种前导序列形成成熟的多肽形式。这种多核苷酸也编码原蛋白(proprotein)，这种原蛋白是5′端有附加的氨基酸残基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是原蛋白，是一种无活性的蛋白形式。切除原序列，留下的是有活性的成熟蛋白。
这样，本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白或有原序列的蛋白或既有原序列又有前序列(presequence)(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸也可以具有读框中融合进标记序列的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多肽。在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，其使得融合进标记的成熟多肽可以纯化，或者例如当使用哺乳动物宿主(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)。所说的血细胞凝集标记相应于源于流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(如果两个序列之间具有至少50％，优选的具有70％的等同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语″严格条件″指仅在序列间具有至少95％，优选的具有97％的同源性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，杂交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上与由图1、2和3(SEQ ID NO.1、3和5)的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽保持了相同的生物学功能或活性。
另外，所说的多核苷酸可以是具有至少20个碱基，优选的是30个碱基，更优选的是至少50个碱基，这些多核苷酸和本发明的多核苷酸杂交，如上文所述它们与本发明的多核苷酸具有等同性，但没有活性。例如，这些多核苷酸可以作为SEQ ID NOS：1、3和5的多核苷酸的探针，用于回收所说的多核苷酸，或者作为诊断探针或作为PCR引物。
本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保存。这些保藏物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35 U.S.Cζ112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的多肽的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造，使用或者销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。
本发明还涉及具有图1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的推定的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1多肽，以及这些多肽的片段，类似物和衍生物。
术语″片段″，″衍生物″和″类似物″，当提到图1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，指实质上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。这样，类似物包括原蛋白，这种蛋白通过切除原蛋白部分，产生有活性的成熟多肽而激活。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。
所说的图1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或者(ii)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(iii)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样一种，其中附加氨基酸融合进成熟多肽，如前导或分泌序列，或者用来纯化成熟多肽的序列，或者原蛋白序列。通过本文的阐述，这样的片段、衍生物以及类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
优选地是以分离的形式提供本发明的多肽，并且优选地是把多肽纯化至均质。
术语″基因″或者″顺反子″指和产生多肽链有关的DNA片段；其包括编码区前面和后面的序列(前导区和尾随序列)以及在各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语″分离的″意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍然是分离的，这是因为这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明的多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程产生的(转导、转化或转染)，所说的载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。所说的工程宿主细胞可以在改良的常规营养培养基中培养，所述的培养基改良得适于激活启动子，选择转化子或扩增Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因。培养条件，例如pH值和温度等，是以前用于选择表达宿主细胞的那些，对普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种表达载体的任何一种中，特别是表达多肽的载体或质粒。这样的载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它质粒或载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和存活。
可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
在表达载体中的所说的DNA序列可有效连接到适当的表达控制序列(启动子)上，以指导mRNA合成。这样的启动子的代表性例子可以提到的是：LTR或猿猴病毒40启动子，大肠杆菌、lac或trp、噬菌体λPL启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。
此外，表达载体优选地包含一个基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇属(Drosophila)S2和Sf9；腺病毒；动物细胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，其中已正向或反向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包括可有效连接到所述序列上的调节序列，包括，例如，启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制和存活，都可以使用。
可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或者其它带有选择性际记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法(1986))。
宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式产生由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成仪合成产生。
成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞，酵母，细菌，或适当的启动子的控制之下的其它细胞中表达。采用得自本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来产生这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
插入到载体中的增强子序列增强了高等真核生物编码本发明的多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点后侧100至270bp的猿猴病毒40增强子，细胞肥大病毒早期启动子增强子，复制起点后侧上的多形瘤增强子和腺病毒增强子。
一般地，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌和酿酒酵母TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列装配，优选地，与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白，包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定化或简单的纯化。
通过与具有功能性启动子的可操作阅读相(operable reading phase)中的合适的翻译起始和终止信号一起插入编码所需蛋白质的结构DNA序列构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以保证载体的保持和在合适时在宿主内提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，和假单胞菌属，链霉菌属，葡萄球菌属的各个种，虽然其它的也可以选择来使用。
作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322″骨架″部分与适当的启动子和待表达的结构序列组合。在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。
典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保持所形成的粗提取物用于进一步的纯化。
可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻结-解冻循环，声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员知道的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组体蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman(细胞，23：175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物的表达载体包括复制起点，适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5′侧翼非转录序列。得自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供所需的非转录遗传元件。Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和性色谱、羟基磷灰石色谱和植物凝集素色谱。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)作为最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌，酵母，高等植物，培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是由哺乳动物或其它真核细胞的碳水化合物糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
本发明的多肽可以用于各种免疫调节和炎症功能，也可以用于各种疾病中。Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1属于趋化因子家族，因此它们是白细胞(如单核细胞，嗜中性细胞、T淋巴细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞等)的化学引诱物。
Northern印迹分析表明Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1优选在造血器官的组织中表达。
Ckβ-8在调节免疫反应和炎症方面起重要作用。图22表明脂多糖诱导人类单核细胞表达Ckβ-8。因此，作为响应内毒素的存在，单核细胞表达Ckβ-8，所以Ckβ-8的使用可用于调节宿主的免疫反应。
如图10所示，在THP-1细胞(A)和PBMCs(B)中化学引诱物的活性是明显的。Ckβ-8在THP-1细胞中诱导明显的钙运动(图11)，这表明Ckβ-8对单核细胞具有生物作用。并且，Ckβ-8在人类单核细胞中产生依赖剂量的趋化性和钙运动反应。
因此，使用Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1有利于通过控制靶免疫细胞向伤口区的渗透促进伤口愈合。以类似的方式，本发明的多肽能提高宿主通过它们对杀微生物的白细胞的吸引和激活而防御慢性感染(例如，分枝杆菌感染)。
因为有证据表明将表达趋化因子的细胞注入到肿瘤中，能造成肿瘤的退化(例如，在Karposi肉瘤治疗中)，所以本发明的多肽还可以用于肿瘤的治疗中。图12和13的分析表明Ckβ-8诱导TPH-1细胞分泌TNF-α，TNF-α是已知用于消退肿瘤的试剂。250ng/ml的Ckβ-8诱导1200微微克/毫升TNF-α的产生和分泌。Ckβ-8也明显地诱导人类单核细胞分泌其它肿瘤和癌症抑制剂，如IL-6、IL-1和G-CSF。另外，Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通过它们的趋化性活性刺激宿主防御(破坏肿瘤细胞的)细胞(如细胞毒性T细胞和巨噬细胞)的侵入和激活，并以此方式也可用于治疗固体癌症。
所说的多肽也可用于抑制生血细胞的增殖和分化，因此可用于保护骨髓干细胞，防治其在化疗期间遭受化疗试剂的伤害。图14和15表明Ckβ-8和Ckβ-1抑制低增殖潜力集落形成细胞的集落形成，并且表明Ckβ-8是LPP-CFC集落生长的有力的和特异性的抑制物。图16表明Ckβ-1特异性地抑制M-CSF刺激的集落形成，而Ckβ-8则不能。然而，也表明Ckβ-8和Ckβ-1明显地抑制骨髓细胞的生长或分化。这种抗增殖作用允许更广泛地暴露在化疗试剂中，因此化疗更有效。
可以在治疗上使用Ckβ-1和Ckβ-8多肽在定型祖先细胞的亚群(例如粒细胞、巨噬细胞/单核细胞)中的抑制作用以抑制白血病细胞的增殖。
在图17、18和19中，除去所用的细胞谱系的定型细胞，使得到的细胞群体和Ckβ-1和Ckβ-8接触。Ckβ-1在Mac-1阳性细胞群体中引起接近50％的降低，此结果和图16表明的Ckβ-1诱导对响应M-CSF的集落形成细胞的抑制作用的结果一致。如图19所示，Ckβ-8抑制定型祖先细胞响应IL-3、GM-CSF和M-CSF的形成集落的能力。并且，如图20所示，表明了Ckβ-8抑制集落形成的剂量反应。这一抑制作用可能是由于这些因子介导的分化信号的特异封阻，或者是由于祖先细胞中细胞毒素的作用。
所说的多肽的另一个作用是，例如在自身免疫疾病和淋巴细胞的白血病中，通过抑制IL-2的生物合成而抑制T细胞的增殖。
因为已发现皮肤中的朗格罕氏细胞产生MIP-1α，所以可以使用Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1抑制牛皮癣的表皮角质形成细胞的增殖(角质形成细胞过度增殖)。
可以使用Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通过募集切除碎片及促进结缔组织的炎性细胞和通过控制过量TGFβ介导的纤维变性而防止伤痕的出现。此外，因为Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1增加血管的渗透性，所以可以使用这些多肽治疗中风、血小板增多、肺栓塞和骨髓增殖紊乱。
Ckβ-8可以通过诱导编程性细胞死亡而用于治疗白血病和不正常增殖的细胞(例如肿瘤细胞)。如图21所示，Ckβ-8在造血祖先细胞群体中诱导编程性细胞死亡。
本发明的多肽和编码这些多肽的多核苷酸可以用作与科学研究有关的体外研究试剂、DNA合成和DNA载体的产生，并可用于发展治疗学和诊断学，目的是治疗人类疾病。例如，Ckβ-1和Ckβ-8可以通过暂时地防止未成熟的造血祖先细胞(如粒细胞、巨噬细胞和单核细胞)的分化而用于扩展它们。这些骨髓细胞可以在体外培养。
可以使用全长的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1基因片段作为cDNA文库的杂交探针，以便分离此全长的基因和分离与此基因具有高度序列相似性或相似生物学活性的其它基因。然而，优选的是此探针具有至少30个碱基，例如可以含有50或更多的碱基。所说的探针也可以用于鉴别相应于全长转录物的cDNA克隆、基因组克隆或包含调节和启动子区、外显子和内含子在内的完整基因克隆。筛选的实施例包括利用已知DNA序列分离此基因的编码区，以合成寡核苷酸探针。具有与本发明的基因序列互补的序列的标记的寡核苷酸可以用来筛选人类cDNA文库、基因组DNA或mRNA，以确定探针和哪些文库成员杂交。
本发明也涉及Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因作为部分诊断剂的用途，检测与所说的核酸序列突变的存在有关的疾病和对此疾病的易感性。这些疾病和趋化因子多肽的表达不足有关。
可以用各种技术在DNA水平上检测具有Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因突变的个体。可以从患者的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子，可以用和编码Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1的核酸互补的PCR引物鉴别和分析Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1突变。例如，可以通过与正常遗传型比较扩增产物大小的变化检测缺失或者插入。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1 RNA或者放射性标记的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化，或者从熔点温度的不同辨别完美配对的序列和错配双螺旋。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分融化温度而停滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。
也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护或化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。
这样，可以由以下方法检测特定DNA序列，所述方法例如杂交，核糖核酸酶保护，化学裂解，直接DNA测序，或使用限制酶(例如，限制片段长度多形性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法。
除较常规的凝胶-电泳和DNA测序法之外，也可用原位分析检测突变。
因为相对于正常对照组织样品所说的蛋白质的过量表达能检测某种疾病(例如，肿瘤)的存在或对某种疾病的易感性，因此，本发明也涉及用于检测各种组织中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白的变化的水平的诊断分析方法。用于检测来自宿主的样品中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白水平的分析方法对本领域的技术人员是公知的，所说的方法包括：放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、ELISA测定和“夹层”测定。ELISA测定(Coligan等，免疫学最新草案，1(2)，第6章，(1991))最初包括制备Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白之抗原的特异性抗体，优选的是单克隆抗体。此外，制备单克隆抗体的受体抗体。将可检测的试剂和受体抗体结合，所说的试剂如放射性、荧光或者在这个实施例中是辣根过氧化物酶。由宿主中获得样品，并将其在和样品中蛋白质结合的固体支持物(如聚苯乙烯皿)上培养。通过和非特异性蛋白质(如BSA)一起培养，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来，在单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白结合期间，将单克隆抗体在皿中培养。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。现在，将和辣根过氧化物酶连接的受体抗体放入皿中，结果导致受体抗体和任何结合到Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白上的单克隆抗体结合。然后将未结合的单克隆抗体洗掉。然后向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白的量。
可以使用竞争测定，其中对Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1特异的抗体吸附在固体支持物上，标记的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1和衍生于宿主的样品通过固体支持物，例如通过液体闪烁色谱检测的标记的量和样品中蛋白的量有关。
“夹层”测定类似于ELISA测定。在“夹层”测定中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通过固体支持物，并与吸附在固体支持物上的抗体结合。然后，第二个抗体结合到Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1上。然后标记的且对第二个抗体特异的第三个抗体通过固体支持物并与第二个抗体结合，然后进行定量。
本发明提供了用于鉴别趋化因子多肽的受体的方法。可以用本领域技术人员已知的许多方法来鉴别编码所说受体的基因，如配体淘选和FACS分类法(Coligan等免疫学最新草案，1(2)，第5章，(1991))。优选使用的是表达克隆，其中的聚腺苷酸RNA由对所说的多肽响应的细胞制备，把由所说的RNA建立的cDNA文库划分成不同的库，用来转染COS细胞或对所说的多肽不响应的其它细胞。生长在载玻片上的转染细胞暴露在所说的标记的多肽中。所说的多肽可以用包括位点特异性蛋白激酶识别部位碘化或其包含体在内的各种手段标记。固定和培养后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性库，同时利用重复子库集(iterative sub-pooling)和再筛选(rescreen)方法制备和再转染子库，最终产生编码推定受体的单克隆。
作为另一种受体鉴别方法，标记的多肽可以是光亲和性的，可以和能表达受体分子的细胞膜或提取物制剂连接。用PAGE分辨交叉连接的物质并把其暴光在X光胶片上。可以把包含所说的多肽的受体的标记复合物切断、分解成蛋白质片段并进行蛋白微测序。从微测序中获得的氨基酸序列可以用来设计一套简并寡核苷酸探针以筛选用来鉴别编码推定的受体基因的cDNA文库。
本发明也涉及筛选化合物以鉴别本发明趋化因子多肽的兴奋剂和拮抗剂的方法。兴奋剂是含有所说的多肽相似生物功能的化合物，而拮抗剂则阻断这些功能。可以通过在带有孔的过滤器(所说的孔具有足够的直径(大约5μm)，允许细胞通过)的顶部放置细胞而测定趋化性，所说的细胞受任何一种本发明的多肽的趋化。将潜在的兴奋剂溶液放置在室的底部，上面的隔室中是合适的对照培养基，这样，经计数随时间迁入到或通过孔膜的细胞而测定兴奋剂的浓度梯度。
当测定拮抗剂时，将本发明的趋化因子多肽放置在下面的室中，加入潜在的拮抗剂以确定所说细胞的趋化性是否受到阻止。
另外，在这一化合物存在的情况下，将表达所说的多肽受体的哺乳动物细胞或膜制剂与标记的趋化因子多肽(如放射活性)一道培养。然后，可以测定此化合物阻止这一相互作用的能力。当以这种方式测定兴奋剂时，不加入趋化因子，测定兴奋剂本身和所说的受体的相互作用的能力。
潜在的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1拮抗剂的例子包括抗体，或在某些情况下为和这种多肽结合的寡核苷酸。潜在的拮抗剂的另一个例子是所说的多肽的负显性突变体。负显性突变体是与所说的野生型多肽的受体结合的多肽，但没有保持生物学活性。
采用反义技术制备的反义构建体也是潜在的拮抗剂。反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或者RNA来控制基因的表达，这两种方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的结合。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5′编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一种与转录所涉及的基因区互补的DNA寡核苷酸(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456，(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，进而阻止趋化因子多肽的转录和产生。反义RNA寡核苷酸体内杂交到mRNA上，并阻断mRNA分子翻译成为所说的多肽(反义-Okano，J. Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA或DNA，来抑制趋化因子多肽的产生。
另一种潜在的趋化因子的拮抗剂是所说的多肽的肽衍生物，这种肽通过天然或合成的方式修饰成所说的多肽的类似物，其已经失去了生物学活性，但仍能识别并结合所说的多肽的受体，因此有效地抑制受体。多肽衍生物的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
可以使用这些拮抗剂治疗MIP诱导的或促进的紊乱，例如自身免疫、慢性炎症和传染性疾病。自身免疫疾病的例子包括多发性硬化和胰岛素依赖性糖尿病。
这些拮抗剂也可以用于通过阻止单核噬细胞的募集和激活而治疗传染病，所说的传染病包括矽肺、内样瘤病、自发的肺部纤维变性。通过阻止嗜曙红细胞的产生和迁移，这些化合物也可用于治疗自发的过多嗜曙红综合症。这些拮抗剂也可以通过阻止巨噬细胞的迁移和产生本发明的趋化因子多肽而治疗内毒素休克。
通过阻止动脉壁中单核细胞的渗透，这些拮抗剂也可用于治疗动脉粥样硬化。
通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱的脱粒及组胺的释放，这些拮抗剂也可用于治疗组胺介导的过敏反应和免疫紊乱(包括晚期过敏反应、慢性荨麻疹特应性皮炎)。也可以治疗IgE介导的过敏反应，如过敏性哮喘、鼻炎和湿疹。
通过阻止伤口区对单核细胞的吸引，这些拮抗剂也可用于治疗慢性和急性炎症。因为慢性和急性的炎症性肺部疾病和肺部单核噬细胞的汇集有关，所以这些拮抗剂可用于调节正常的肺部巨噬细胞群体。
通过阻止患者关节中的滑液对单核细胞的吸引，拮抗剂也可用于治疗风湿性关节炎。单核细胞的流入和激活在退化和炎性关节病的致病中起重要的作用。
这些拮抗剂也可用于干扰重要源于IL-1和TNF的有害的级联反应。以这种方式，拮抗剂可用于阻止炎症。拮抗剂也可用于抑制趋化因子诱导的依赖前列腺素的发热。
这些拮抗剂也可用于治疗骨髓的无能，如再生障碍性贫血和脊髓发育不良综合症。
通过阻止肺部中嗜曙红细胞的积累，这些拮抗剂也可用于治疗哮喘和变应性变态反应。这些拮抗剂也可用于治疗上皮下的基底膜纤维变性，其是哮喘肺的显著特征。
拮抗剂可用来与药学上可接受的载体一起组合成组合物，例如，下文描述的。
所说的趋化因子多肽、兴奋剂和拮抗剂可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包含治疗有效量的所说的多肽和药学上可接受的载体或者赋形剂。 这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它们的组合物。其配方应该适宜于施用的方式。
本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。与这种容器相关联的可以是管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构所规定形式的告示，这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品的政府机构的准许。此外，所说的多肽、兴奋剂和拮抗剂可以与其它治疗化合物结合使用。
所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如局部、静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，考虑用药途径和病症等因素，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。
趋化因子多肽和多肽形式的兴奋剂或拮抗剂，可以依据本发明通过体内表达这样的多肽而使用，这常被称作″基因治疗″。
这样，例如，可以对患者细胞用体外编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，然后向欲用此多肽治疗的患者提供所说的工程细胞。这样的方法是本领域公知的。例如，可以经本领域公知的方法用包括编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。
同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，可以将产生包括编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞施用给患者，以便体内对细胞进行基因工程处理和体内表达多肽。通过本发明的阐述，由这种方式经施用本发明的多肽的这些和其它方法对本领域技术人员是显而易见的。例如，工程化细胞的表达载体可以不是逆转录病毒载体，如，在与合适的运送载体结合后，腺病毒可以用于体内工程化细胞。
逆转录病毒质粒载体可以是来自逆转录病毒，这些病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠肉瘤病毒、莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳氏肉瘤病毒和Harvey肉瘤病毒。
在一个优选的实施方案中，逆转录病毒表达载体(pMV-7)的两侧是莫洛尼氏鼠肉瘤病毒的长末端重复(LTRs)，并包含疱疹单纯性病毒(HSV)胸苷激酶(tk)启动子调节下的可选择的药物抗性基因neo。唯一的EcoRI和HindIII位点有利于编码序列的引入(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))。
所说的载体包含一种或多种合适的启动子，这些启动子包括但不限于：逆转录病毒LTR；猿猴病毒40启动子；和Miller等(生物技术，vol.7，No.9，980-990(1989))描述的人类细胞肥大病毒(CMV)启动子或其它的启动子，例如如真核细胞启动子的细胞启动子(这样的启动子包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。通过本文的阐述，合适的启动子的选择对本领域的技术人员是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制之下，这些启动子包括但不限于：病毒胸苷激酶启动子，如疱疹单纯性胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs；β-肌动蛋白启动子；和控制编码所说多肽的基因的天然启动子。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可以转染的包装细胞的例子包括但不限于：PE501、PA317和GP+am12。所说的载体可以通过本领域任何已知的方法转导这些包装细胞。这些方法包括但不限于：电穿孔法、使用脂质体和CaPO4沉淀。
生产者细胞系产生包含编码所说的多肽的核酸序列的传染性逆转录病毒载体颗粒。可以使用这些逆转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所说的多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。
本发明的序列对染色体鉴别也有价值。所说的序列特异性地导向单个人染色体的特定位置，并与之杂交。此外，当前也需要鉴别染色体上的特定位点。极少的基于实际序列数据(重复多形性)的染色体标记试剂现在可用来标记染色体位置。在关联与疾病有关基因的那些序列中，按照本发明的染色体的DNA作图是重要的第一步。
简言之，可以通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)对序列作图到染色体上。使用cDNA的计算机分析迅速选择引物，该引物不跨越一个以上的基因组DNA中的外显子，这样使扩增方法复杂化。然后，这些引物用于PCR筛选包含单独的人染色体的体细胞杂种。仅包含相应于引物的人基因的那些杂种产生扩增片段。
体细胞杂种的PCR作图是指定特定DNA到特定染色体的快速方法。利用本发明及相同的寡核苷酸引物，可以由一组特定染色体的片段或一组大的基因组克隆以类似的方式获得亚定位。可以以类似的方式使用其它用于对染色体作图的作图策略，所述策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和经杂交预选择构建染色体特异性-cDNA文库。
在一个步骤中，中期染色体扩散的cDNA克隆的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的染色体位置。这一技术可以与短至500或600碱基的cDNA一起使用。这一技术的综述，参见Verma等，人染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列对精确的染色体位置作图，染色体上的序列的物理位置就可以与遗传图数据关联。这样的数据可以在例如V.McKusick，在人中的孟德尔式遗传(可联机到Johns Hopkins大学Welch医学文库上使用)中找到。然后，基因和已作图到相同的染色体区的疾病之间的相互关系经连锁分析(物理邻近基因的共遗传)鉴别。
接着，有必要确定感染和未感染个体之间cDNA或者基因组序列中的不同。如果在某些或全部感染个体中观察到突变，但在任何正常个体中观察不到，则所述的突变很可能是疾病的病因。
采用现有分辨率的物理作图和遗传作图技术，精确定位到与疾病相关的染色体区上的cDNA是50和500之间的潜在致病性基因的一个(这假定1兆碱基作图分辨率，每20kb一个基因)。
所说的多肽，其片段或其它衍生物或其类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原由此产生抗体。这些抗体可以是例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域中已知的各种方法可以用于产生这样的抗体和片段。
可以通过对动物直接注射所说的多肽或者对动物(优选的是非人动物)施用这种多肽获得产生来抗相应于本发明的序列的多肽的抗体。然后如此获得的抗体结合多肽本身。按这种方式，即使是编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合全部天然多肽的的抗体。用这种抗体从表达多肽的组织中分离多肽。
对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供由传代细胞系培养物产生的抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体和癌疗法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
有关产生单链抗体描述的技术(美国专利4,946,778)可以采用来产生抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。也可以利用转基因小鼠表达抗本发明的免疫原性多肽产物的人化的抗体。
将参照以下实施例进一步描述本发明。然而应该清楚本发明不限于这些实施例。除非特别指明，所有份数或数量均指重量。
为了有利于理解下列实施例，以下描述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”由前面的小写p和/或后续的大写字母和/或数字标示。本文的起始质粒是市售的、无限制的公众可获得的或者是可以按已出版的方法从可获得的质粒构建的。此外，所描述的质粒的等同质粒在本领域中是已知的，对普通技术人员是显而易见的。
DNA的″消化″指以限制性内切酶催化切割DNA，这种限制性内切酶仅作用在DNA一定的序列上。本文所用的各种限制酶是市售的，使用它们的反应条件，辅助因子和其它需要是作为普通技术人员应了解的知识。为了分析的目的，一般地是在约20微升缓冲液中使用1微克质粒或DNA片段以及约2单位的酶。为了分离DNA片段进行质粒构建的目的，一般地是在较大体积中用20至250单位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的缓冲液和底物的量由制造者规定。通常使用37℃约1小时的培养时间，但可以按照供应者的说明变化。在消化之后，反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，8：4057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行切割片段的大小分离。
″寡核苷酸″指单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的。这样合成的寡核苷酸没有5′磷酸基，同时在激酶存在下不添加带有ATP的磷酸盐时，其不连接另一个寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接没有去磷酸化的片段。
″连接″指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，Id.，p.146)。除非提供其它方式，可以采用已知缓冲液和条件用每0.5微克大约等摩尔量的待连接的DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。
除非有其它说明，按Graham，F.和van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)的描述进行转化。
实施例1
Ckβ-8的细菌表达和纯化
用相应于加工过的Ckβ-8蛋白质(减去信号肽序列)的5′和3′末端序列的PCR寡核苷酸引物和Ckβ-8基因3′载体序列起始扩增编码Ckβ-8的DNA序列，ATCC#75676。把相应于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分别加入到5′和3′的序列中。具有5′TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA 3′(SEQ ID NO.7)序列的5′寡核苷酸引物包含一个BamHI限制性内切酶位点，其后是从假定加工过的蛋白质的末端氨基酸密码子起的Ckβ-8编码序列的18个核苷酸。3′端的序列5′CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT3′(SEQ ID NO.8)包含与XbaI位点互补的序列。所说的限制性内切酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen公司，Chat sworth，CA)的限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-调节启动子操纵子(P/0)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。用BamHI和Xba I消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9上，并插入到带有编码组氨酸标记和RBS之序列的框架中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(可从Qiagen得到)。M15/rep4包含多拷贝的质粒pREP4，这种质粒表达lacI抑制子并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生长能力来鉴别这种转化体同时选择抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA，并且通过限制分析确认。在补充Amp(100 ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培养基的液体培养中过夜(O/N)培养包含所需构建体的克隆。所说的O/N培养物用来以1∶100到1∶250的比率接种大量培养物。使细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(0.D.600)。添加IPTG(异丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至终浓度1mM。IPTG通过灭活lacI抑制子，清除导致增加的基因表达的P/O诱导。将细胞另外培养3至4小时。然后由离心收获细胞。在离液剂(6摩尔的盐酸胍)中溶解得到的细胞沉淀。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下从此溶液中经镍螯合物柱层析纯化溶解的Ckβ-8(Hochuli，E.等，层析杂志411：177-184(1984))。从此柱中以6摩尔的盐酸胍(pH5.0)洗脱Ckβ-8(95％纯度)，为了变性将洗脱液调至3摩尔的盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔的谷胱甘肽(还原型的)和2毫摩尔的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中温育12小时后，用10毫摩尔的磷酸钠透析所说的蛋白质。
实施例2
MIP-4的细菌表达和纯化
用相应于加工过的MIP-4蛋白质(减去信号肽序列)的5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物起始扩增编码MIP-4的DNA序列，ATCC#75675。把相应于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分别加入到5′和3′末端序列中。具有5′TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC 3′(SEQ ID NO.9)序列的5′寡核苷酸引物包含一个BamHI限制性内切酶位点，其后是从假定加工过的蛋白质的末端氨基酸密码子起的MIP-4编码序列的18个核苷酸；3′端的序列5′CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT 3′(SEQ ID NO.10)包含与Xba I位点互补的序列。所说的限制性内切酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen公司，Chat sworth，CA)的限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。用BamHI和Xba I消化pQE-9，将扩增的序列连接到pQE-9上，并插入到带有编码组氨酸标记和RBS之序列的框架中。然后用连接混合物转化大肠杆菌菌株(可从Qiagen得到)。M15/rep4包含多拷贝的质粒pREP4，这种质粒表达lacI抑制子并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生长能力来鉴别这种转化体同时选择抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA，并且通过限制分析确认。在补充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培养基的液体培养中过夜(O/N)培养包含所需构建体的克隆。所说的O/N培养物用来以1∶100到1∶250的比率接种大量培养物。使细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(异丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至终浓度1mM。IPTG通过灭活lacI抑制子，清除导致增加的基因表达的P/O诱导。将细胞另外培养3至4小时。然后由离心收获细胞。在离液剂(6摩尔的盐酸胍)中溶解得到的细胞沉淀。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下从此溶液中经镍螯合物柱层析纯化溶解的MIP-4(Hochuli，E.等，层析杂志411：177-184(1984))。从此柱中以6摩尔的盐酸胍(pH5.0)洗脱MIP-4(95％纯度)，为了变性将洗脱液调至3摩尔的盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔的谷胱甘肽(还原型的)和2毫摩尔的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中温育12小时后，用10毫摩尔的磷酸钠透析所说的蛋白质。
实施例3
Ckβ-1的细菌表达和纯化
用相应于加工过的Ckβ-1蛋白质(减去信号肽序列)的5′和3′末端序列的PCR寡核苷酸引物起始扩增编码Ckβ-1的DNA序列，ATCC#75572，并把相应于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分别加入到5′和3′的序列中。具有5′GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC3′(SEQ ID NO.11)序列的5′寡核苷酸引物包含一个BamHI限制性内切酶位点，其后是从假定加工过的蛋白质的末端氨基酸密码子起的Ckβ-1编码序列的15个核苷酸；3′端的序列5′GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG 3′(SEQ ID NO.1 2)包含与Xba I位点互补的序列，翻译终止密码子和Ckβ-1编码序列的最后20个核苷酸。所说的限制性内切酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的限制性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-调节启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9，将扩增的序列连接到pQE-9上，并插入到带有编码组氨酸标记和RBS之序列的框架中。然后用连接混合物转化大肠杆菌菌株(可从Qiagen的M15/rep 4商标中得到)。M15/rep4包含多拷贝的质粒pREP4，这种质粒表达lacI抑制子并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生长能力来鉴别转化体同时选择抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA，并且通过限制分析确认。在补充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培养基的液体培养中过夜(O/N)培养包含所需构建体的克隆。所说的O/N培养物用来以1∶100到1∶250的比率接种大量培养物。使细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(异丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至终浓度1mM。IPTG通过灭活lacI抑制子，清除导致增加的基因表达的P/O诱导。将细胞另外培养3至4小时。然后由离心收获细胞。在离液剂(6摩尔的盐酸胍)中溶解得到的细胞沉淀。澄清后，在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下从此溶液中经镍螯合物柱层析纯化溶解的Ckβ-1(Hochuli，E.等，层析杂志411：177-184(1984))。从此柱中以6摩尔的盐酸胍(pH5.0)洗脱Ckβ-1(95％纯度)，为了变性将洗脱液调至3摩尔的盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔的谷胱甘肽(还原型的)和2毫摩尔的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中温育12小时后，用10毫摩尔的磷酸钠透析所说的蛋白质。
实施例4
重组Ckβ-8在COS细胞中的表达
质粒CMV-Ckβ-8 HA的表达来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含：1)猿猴病毒40的复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌的复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区、猿猴病毒40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码全长Ckβ-8前体的DNA片段和融合到其3′末端框架中的HA标记克隆到所说的载体的多接头区，因此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相当于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，等，细胞37：767(1984))。HA标记向靶细胞蛋白的灌输，使带有抗体(其识别HA表位)的重组蛋白质很容易测定。
质粒构建策略描述如下：
经PCR使用两个引物构建编码Ckβ-8的DNA序列(ATCC#75676)，所说的引物：5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT3′(SEQ ID NO：13)包含HindIII位点，之后是由起始密码子开始的Ckβ-8编码序列的18个核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC3′(SEQ ID NO：14)包含Xba I位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标记和Ckβ-8编码序列的最后20个核苷酸(不包含终止密码子)。因此，PCR产物包含HindIII位点，Ckβ-8编码序列，之后是融合在框架中的HA标记，HA标记后是翻译终止密码子和Xba I位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化和连接PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)，将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组体Ckβ-8，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测Ckβ-8-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1988))。将细胞在转染后的两天用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37：767(1984))。用HA的特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基。在15％的SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例5
重组MIP-4在COS细胞中的表达
质粒CMV-MIP-4 HA的表达来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含：1)猿猴病毒40的复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌的复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区、猿猴病毒40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码全长MIP-4前体的DNA片段和在读框中融合进其3′末端的HA标记克隆到所说的载体的多接头区，因此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相当于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，等，细胞37：767(1984))。HA标记向靶细胞蛋白的灌输，使带有抗体(其识别HA表位)的重组蛋白质很容易测定。
质粒构建策略描述如下：
经PCR使用两个引物构建编码MIP-4的DNA序列(ATCC#75675)，所说的引物：5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTGCAGCTGCC3′(SEQ ID NO：15)包含HindIII位点，之后是由起始密码子开始的MIP-4编码序列的20个核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC3′(SEQ ID NO：16)包含Xba I位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标记和MIP-4编码序列的最后19个核苷酸(不包含终止密码子)。因此，PCR产物包含HindIII位点，MIP-4编码序列，之后是融合在框架中的HA标记，HA标记后是翻译终止密码子和XbaI位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化和连接PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)，将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组体MIP-4，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测MIP-4-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1988))。将细胞在转染后的两天用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37：767(1984))。用HA的特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基。在15％的SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例6
重组Ckβ-1在COS细胞中的表达
质粒CMV-Ckβ-1 HA的表达来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含：1)猿猴病毒40的复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌的复制起点，4)CMV启动子，其后为多接头区、猿猴病毒40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码全长Ckβ-1前体的DNA片段和融合到其3′末端框架中的HA标记克隆到所说的载体的多接头区，因此，重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相当于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位，这一点以前已经描述过(I.Wilson，等，细胞37：767(1984))。HA标记向靶细胞蛋白的灌输，使带有抗体(其识别HA表位)的重组蛋白质很容易测定。
质粒构建策略描述如下：
经PCR使用两个引物构建编码Ckβ-1的DNA序列(ATCC#75572)，所说的引物：5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC3′(SEQ ID NO：17)包含HindIII位点，之后是由起始密码子开始的Ckβ-1编码序列的20个核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG3′(SEQ ID NO：18)包含Xba I位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标记和Ckβ-1编码序列的最后19个核苷酸(不包含终止密码子)。因此，PCR产物包含HindIII位点，Ckβ-8编码序列，之后是融合在框架中的HA标记，HA标记后是翻译终止密码子和XbaI位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化和连接PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)，将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA，并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组体Ckβ-1，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测Ckβ-8-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，抗体：实验手册，冷泉港实验室出版社，(1988))。将细胞在转染后的两天用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150 mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37：767(1984))。用HA的特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基。在15％的SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例7
Ckβ-8在人类组织中的表达模式
进行Northern印迹分析以检测Ckβ-8在人类组织中的表达水平。使用RNAzolTMB系统分离总细胞RNA样品(Biotecx实验室，公司，Houston，TX77033)。将从每一种特定的人类组织中分离的大约10μg的总RNA在1％的琼脂糖凝胶上分离并在印迹尼龙滤器上(Sambrook，Fritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港实验室出版社，(1989))。根据带有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It试剂盒进行标记反应。以Select-G-50柱纯化标记的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射标记的全长Ckβ-8基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下过夜杂交所说的滤器。用O.5×SSC和0.1％SDS在室温下洗涤两次，在60℃下洗涤两次，然后在-70℃下，将此滤器过夜露置在增强屏上。
实施例8
MIP-4在人类细胞中的表达模式
进行Northern印迹分析以检测MIP-4在人类细胞中的表达水平。使用RNAzolTMB系统分离总细胞RNA样品(Biotecx实验室，公司，Houstonl TX77033)。将从每一种特定的人类组织中分离的大约10μg的总RNA在1％的琼脂糖凝胶上分离并印迹在尼龙滤器上(Sambrook，Fritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港实验室出版社，(1989))。根据带有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It试剂盒进行标记反应。以Select-G-50柱纯化标记的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射标记的全长MIP-4基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下过夜杂交所说的滤器。用0.5×SSC和0.1％SDS在室温下洗涤两次，在60℃下洗涤两次，然后在-70℃下，将此滤器过夜露置在增强屏上。
实施例9
Ckβ-1在人类组织中的表达模式
进行Northern印迹分析以检测Ckβ-8在人类组织中的表达水平。使用RNAzolTMB系统分离总细胞RNA样品(Biotecx实验室，公司，Houstonl TX77033)。将从每一种特定的人类组织中分离的大约10μg的总RNA在1％的琼脂糖凝胶上分离并印迹在尼龙滤器上(Sambrook，Fritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港实验室出版社，(1989))。根据带有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It试剂盒进行标记反应。以Select-G-50柱纯化标记的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射标记的全长Ckβ-8基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下过夜杂交所说的滤器。用0.5×SSC和0.1％SDS在室温下洗涤两次，在60℃下洗涤两次，然后在-70℃下，将此滤器过夜露置在增强屏上。脾中存在丰富的Ckβ-1的信使RNA。
实施例10
使用杆状病毒表达系统表达和纯化趋化因子Ckβ-8
使用重组杆状病毒(设计这种病毒是为了表达Ckβ-8 cDNA)感染SF9细胞。以2个MOT感染细胞，并在28℃下培养72-96小时。通过低速离心从感染的培养物中除去细胞碎片。向上清液中加入蛋白酶抑制物混合物，最终浓度为20μg/ml Pefabloc SC，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/mlE-64和1mM乙二胺四乙酸。通过只将20-30μl的上清液加样到15％SDS-PAGE凝胶上监测上清液中的Ckβ-8水平。检测Ckβ-8，其可见的9Kd的带相当于每升几毫克的表达水平。另外通过三步纯化方法纯化Ckβ-8：肝素结合亲和层析。将杆状病毒培养物的上清液和1/3体积的含有100mMHEPES/MES/NaOAc(pH6)的缓冲液混合，并通过0.22μm的膜过滤。然后将此样品加样到肝素结合柱上(HE1 poros 20，生物感知系统公司)。在大约300 mM NaCl中以50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的50至500 mM NaCl溶液的线性梯度洗脱Ckβ-08；阳离子交换色谱。将从肝素层析中富集的Ckβ-8用含有50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的缓冲液稀释5倍。将得到的混合物加样到阳离子交换柱中(S/M poros 20，生物感知系统公司)。在250 mM NaCl中以50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的25至300 mM NaCl溶液的线性梯度洗脱Ckβ-8；筛析色谱。在阳离子交换层析后，通过将Ckβ-8加样到筛析柱(HW50，TOSO HAAS，1.4×45cm)上进一步纯化Ckβ-8。在靠近分子量为13.7Kd标准物(Rnase A)的位置上分级分离的Ckβ-8，相当于所说的蛋白的二聚物形式。
在以上描述的三步纯化后，通过SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色而判定得到的Ckβ-8的纯度是否超过90％(图9)。
也检验了纯化的Ckβ-8的内毒素/LPS的污染。按照LAL测定，LPS的含量少于0.1ng/ml(BioWhittaker)。
实施例11杆状病毒表达的Ckβ-1和Ckβ-8对M-CSF和SCF刺激的新分离的骨髓细胞的集落形成的作用
在37℃下，将小鼠骨髓细胞的低密度群体培养在处理的组织培养盘中1小时以除去单核细胞、巨噬细胞和其它吸附在塑料表面的细胞。然后在图16所示的因子存在或不存在的情况下，将没有吸附的细胞群体接种(10,000个细胞/盘)在含有生长培养基的琼脂中。在37℃下将这些培养物培养10天(88％N2，5％CO2和7％O2)，并在倒置显微镜下计数集落数。以平均数表示集落数，并由进行的三次重复测定获得。
实施例12Ckβ-8和Ckβ-1对IL-3和SCF刺激的骨髓细胞lin群体的增值和分化的作用
使用阴性选择方法获得富含在原始造血祖先中的小鼠骨髓细胞群，其中使用一组单克隆抗体(抗cd11b，CD4，CD8，CD45R和Gr-1抗原)和磁性的小珠除去大部分此谱系中已定型的细胞。在指示趋化因子(50 ng/ml)存在或不存在的情况下，将得到的细胞群(lin细胞)接种(5×104细胞/ml)在添加了IL-3(50 ng/ml)+SCF(100 ng/ml)的生长培养基中。37℃下在潮湿的保温箱(5％CO2，7％O2，和88％N2环境)中培养7天后，收获细胞并测定HPP-CFC和未成熟的祖先。另外，通过FACScan分析细胞的某些分化抗原的表达。以平均数+/-SD表示集落数，并由对每群细胞进行的6个盘的实验获得集落数据(图17)。
实施例13
Ckβ-8抑制响应IL-3，M-CSF和GM-CSF的集落的形成
从股骨和胫骨中冲洗小鼠骨髓细胞，在ficol密度梯度上分离，并通过塑料吸附除去单核细胞。将得到的细胞群体在以MEM为基础的添加了IL-3(5ng/ml)，GM-CSF(5ng/ml)，M-CSF(10ng/ml)和G-CSF(10ng/ml)的培养基中过夜培养。在IL-3(5ng/ml)，GM-CSF(5ng/ml)或M-CSF(5ng/ml)及有或没有Ckβ-8(50ng/ml)存在的情况下，将这些细胞以1,000个细胞/盘的密度接种在以琼脂为基础的集落形成测定培养基中。表示集落形成的数据为特定因子单独存在时形成的集落数的百分数。以如各重复盘的平均数所描述的数据表示两个实验，误差条表示每个实验的标准差(图19)。
实施例14
经基因治疗的表达
从患者中经皮肤活组织检查获得成纤维细胞。将得到的组织放置在组织培养基中并将其分成小块。将小组织块放置在湿组织培养瓶的表面，每瓶放置大约10块。将瓶倒转，紧密靠近，在室温下过夜。在室温下放置24小时后，将瓶旋转过来，组织块仍然固着在瓶底部，加入新鲜培养基(如Ham′s F12培养基，其中含有10％FBS、青霉素和链霉素)。然后，在37℃下培养大约1周。此时，加入新鲜培养基，以后每隔几天换一次培养基。又培养2周之后，出现单层的成纤维细胞。将单层细胞用胰蛋白酶消化，并按重量均等地分装到更大的瓶中。
将pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))(其两侧是Moloney鼠肉瘤病毒的长末端重复区)用EcoRI和HindIII消化，之后用牛犊肠磷酸酶处理。在琼脂糖凝胶上分级分离线性载体，并用玻璃珠纯化。
利用PCR引物扩增编码本发明的多肽的cDNA，所说的引物分别相当于5′和3′末端序列。包含EcoRI位点和3′引物的5′引物还包含HindIII位点。在T4 DNA连接酶存在的情况下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒线性主链和EcoRI和HindIII片段一起加入。在适于这两种片段连接的条件下，保存得到的反应混合物。用连接混合物转化细菌HB101，然后将细菌HB101接种在包含卡那霉素的琼脂中，以确认载体中是否含有正确插入的兴趣基因。
将兼嗜性pA317或者GP+am12包装细胞在组织培养物中培养，至其在Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)(含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素)中为铺满密度。然后将含有所说的基因的载体加入到培养基中，并用载体转导包装细胞。此时，包装细胞产生含有所说的基因的传染性病毒颗粒(此时，包装细胞称为生产者细胞)。
将新鲜培养基加入到转导的生产者细胞中，随后，在铺满生产者细胞的10cm平板上收获培养基。将含有传染性病毒颗粒的用过的培养基通过微孔滤器过滤，以除去分离的生产者细胞，然后用这种培养基感染成纤维细胞。从未铺满成纤维细胞的平板中除去培养基，并迅速地用生产者细胞的培养基替换。将此培养基除去，代替以新鲜培养基。如果病毒的滴度很高，事实上所有的成纤维细胞都将被感染，则不需要选择。如果病毒的滴度很低，有必要利用具有可选择性的标记(如neo或者his)的反转录病毒载体。
然后将工程化的成纤维细胞注射到宿主中，或者单独或者在cytodex 3微载体珠上生长至铺满。此时，成纤维细胞产生所说的蛋白质产物。
按照上文的描述本发明的许多改进和变化是可能的，因此，在附属的权利要求范围内，可以另外非如上文的特定描述实施本发明。
序列表(1)一般信息： (i)申请人：LI等 (ii)发明名称：人类趋化因子β-8，趋化因子β-1和巨噬细胞炎性
蛋白-4 (iii)序列数：18 (iv)通讯地址：
(A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，
CECCHI，STEWART和OLSTEIN
(B)街道：6 BECKER FARM ROAD
(C)城市：ROSELAND
(D)州：NEW JERSEY
(E)国家：美国
(F)ZIP： 07068 (v)计算机可读形式：
(A)介质类型：3.5英寸磁盘
(B)计算机：IBM PS/2
(c)操作系统：MS-DOS
(D)软件：WORD PERFECT 5.1 (Vi)当前申请的数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号： (Vii)在先申请的数据
(A)申请号：08/173,209
(B)申请日：1993年12月22日 (Viii)在先申请的数据
(A)申请号：08/208,339
(B)申请日：1994年3月8日 (ix)在先申请的数据
(A)申请号：PCT/US94/07256
(B)申请日：1994年6月28日 (ix)律师/代理人信息：
(A)姓名：FERRARO，GREGORY D.
(B)登记号：36，134
(c)证书/文档号：325800-289 (x)电信信息：
(A)电话：201-994-1700
(B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息： (i)序列特征：
(A)长度：363个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：1ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTG TTACTGCCCT TGGATCCCAG 60GCCCGGGTCA CAAAAGATGC AGAGACAGAG TTCATGATGT CAAAGCTTCC ATTGGAAAAT 120CCAGTACTTC TGGACAGATT CCATGCTACT AGTGCTGACT GCTGCATCTC CTACACCCCA 180CGAAGCATCC CGTGTTCACT CCTGGAGAGT TACTTTGAAA CGAACAGCGA GTGCTCCAAG 240CCGGGTGTCA TCTTCCTCAC CAAGAAGGGG CGACGTTTCT GTGCCAACCC CAGTGATAAG 300CAAGTTCAGG TTTGCATGAG AATGCTGAAG CTGGACACAC GGATCAAGAC CAGGAAGAAT 360TGA 363(2)SEQ ID NO：2的信息： (i)序列特征：
(A)长度：120个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Lys Val Thr
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-5 1 5Phe Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp10 15 20Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro25 30 35Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn40 45 50Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly55 60 65Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys70 75 80Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn85 90 95(2)SEQ ID NO：3的信息： (i)序列特征：
(A)长度：282个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：3ATGAAGATCT CCGTGGCTGC AATTCCCTTC TTCCTCCTCA TCACCATCGC CCTAGGGACC 60AAGACTGAAT CCTCCTCACG GGGACCTTAC CACCCCTCAG AGTGCTGCTT CACCTACACT 120ACCTACAAGA TCCCGCGTCA GCGGATTATG GATTACTATG AGACCAACAG CCAGTGCTCC 180AAGCCCGGAA TTGTCTTCAT CACCAAAAGG GGCCATTCCG TCTGTACCAA CCCCAGTGAC 240AAGTGGGTCC AGGACTATAT CAAGGACATG AAGGAGAACT GA 282(2)SEQ ID NO：4的信息： (i)序列特征：
(A)长度：93个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr
-15 -10 -5Ile Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr
1 5 10His Pro Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro
15 20 25Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser
30 35 40Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys
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60 65 70Lys Glu Asn(3)SEQ ID NO：5的信息： (i)序列特征：
(A)长度：270个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：89个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：6Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met-20 -15 -10Ala Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys-5 1 5 10Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val
15 20 25Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile
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60 65(2)SEQ ID NO：7的信息： (i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
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(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
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(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
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(B)类型：核酸
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(B)类型：核酸
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：寡核苷酸 (xi)序列描述：SEQ ID NO：18CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG TTCTCCTTCA TGTCCTTG 58
机译： 人趋化因子beta-8，趋化因子beta-1和巨噬细胞炎性蛋白4
机译： 人趋化因子beta-8，趋化因子beta-1和巨噬细胞炎性蛋白4
机译： 人kemokin beta-8，趋化因子beta-1和巨噬细胞炎性蛋白4
