人降钙素基因相关肽脂质体组合物及其制法

摘要

本发明提供了一种人降钙素基因相关肽药物组合物及其制备方法。该组合物含有天然大豆磷脂脂质体,其中该组合物中的人降钙素基因相关肽与所述的天然大豆磷脂脂质体的重量比为1—2∶100—8000。该组合物在体内的半衰期延长至72分钟,水溶液的稳定性也大大延长。所述的组合物以静脉、口腔、鼻腔、直肠粘膜给药的方式按相当于0.1—10pg/kg体重用于治疗高血压和充血性心力衰竭,生物利用度高达80%。

说明书

本发明涉及一种人降钙素基因相关肽脂质体组合物及其制备方法，特别是采用磷脂类与所述的人降钙素基因相关肽结合的方法获得的产品。

人降钙素基因相关肽(hCGRP)是人体内的神经调节递质，是已知的最强的血管扩张物质，它已经成为市售的产品。但是它在人体内的半衰期仅为9-12分钟，所以与其它多肽物质一样，这种物质在水溶液及体内很不稳定，临床使用受限制。

为了使hCGRP成为适合临床应用的药物，本发明的目的在于提供一种人降钙素基因相关肽脂质体组合物及其制备方法，特别是采用磷脂类与所述的人降钙素基因相关肽结合的方法获得稳定、有效的产品。采用本发明方法制得的人降钙素基因相关肽脂质体组合物产品，能够使得人降钙素基因相关肽的逐渐释放，达到长效作用，其半衰期可达72分钟。对心血管疾病有防治作用。

为了完成本发明之目的，本发明特别涉及一种人降钙素基因相关肽药物组合物，其特征在于该组合物含有天然大豆磷脂脂质体，其中该组合物中的人降钙素基因相关肽与所述的天然豆磷脂脂质体的重量比为1-2∶100-8000，优选为1.5-2∶2500-6000。

所述的人降钙素基因相关肽药物组合物中优选：每5ml该组合物中含有20-2000pg的人降钙素基因相关肽。

人降钙素基因相关肽药物组合物可包括药物学上可接受的赋形剂和溶媒添加剂，例如甘露糖醇、注射用水、生理盐水和葡萄糖溶液。

本发明还涉及人降钙素基因相关肽药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)向所述的经纯化干燥的大豆磷脂中按磷脂∶水＞1∶1000的重量比加入水，超声振荡得到小单层膜的大豆磷脂脂质体；

2)将人降钙素基因相关肽的水溶液与所述的大豆磷脂脂质体混合，使人降钙素基因相关肽与大豆磷脂脂质体的混合重量比为1-2∶100-8000，优选1.5-2∶2500-6000，在超声振荡与37℃下保温30-60分钟，得到稳定的人降钙素基因相关肽药物组合物，其中，所述人降钙素基因相关肽水溶液中人降钙素基因相关肽与水的重量比为1∶1000-25000。

上述的人降钙素基因相关肽药物组合物可进一步冻干溶解到水溶液中，使每5ml水溶液中含有20-2000pg的人降钙素基因相关肽。

本发明进一步涉及上述的人降钙素基因相关肽药物组合物对高血压和充血性心力衰竭的治疗方法。所述的方法包括静脉或经口腔、鼻腔、直肠粘膜给药，其中，静脉滴注的有效使用剂量相当于hCGRP含量为0.1-10pg hCGRP/kg体重，生物利用度为约80％。

以下对本发明进行详细说明。

制备人降钙素基因相关肽脂质体稳定组合物的依据：

hCGRP氨基酸组成具有两个显著特点：(1)37个氨基酸中极性氨基酸8个，疏水氨基酸16个，间隔分布，极性氨基酸之间分布6-8个非极性氨基酸。(2)8个极性氨基酸中碱性氨基酸4个，酸性氨基酸1个，在水溶液中呈碱性带有正电荷，其等电点pI＝10。每分子hCGRP含有2个精氨酸残基(Arg)、2个赖氨酸残基(Lys)和一个门冬氨酸(Asp)残基。在生理pH范围内，Lys和Arg带正电荷，而Asp带负电荷，正电荷总数与负电荷总数比例(∑Lys+∑Arg)/(∑Glu+∑Asp)代表着分子的酸碱性，比例大于1为碱性；否为酸性。hCGRP的电荷比值为4，是一种强碱性多肽分子，在水溶液中带有三个净剩的正电荷。这说明hCGRP是一种含有大量疏水氨基酸残基的强碱性的两性分子。

分析磷脂结构，特别是大豆磷脂的组成特征，发明人发现大豆磷脂为天然磷脂，其组成和结构具有如下特点，(1)酸性磷脂，含量超过40％，在水溶液中呈酸性、头部基团带有负电荷；(2)不饱和脂肪酸含量超过70％，具有抗氧化、抗水解的保护能力；(3)当H2O和大豆磷脂比例(w/w)大于1000∶1时，形成的单层膜小脂质体(20-50nm)具有最大的热力学稳定性。

本发明采用酸性氯仿甲醇溶液系统和碱性较强的硅胶板(Merk公司，西德)，经单向薄层色谱(TLC)将制备脂质体的大豆磷脂分离，在同一条件下用标准磷脂进行校正，用薄层扫描进行定量分析，并通过单向薄层谱(TLC)对各种磷脂组份直接甲酯化后进行气相色谱分析，得到了大豆磷脂组分及其疏水侧链的组成。通常注射用大豆磷脂含44.9％酸性磷脂，包括磷脂酰丝氨酸(17.2％)、磷脂酰甘油(8.1％)、磷脂酰肌醇(15.2％)、及心磷脂(4.4％)，在水溶液中使脂质体膜表面带有丰富的负电荷。大豆磷脂总脂肪酸中有两个大的组分是亚油酸(58.31％)和棕榈酸(24.36％)，占总脂肪酸含量的82％以上。此外含少量的亚麻酸(7.32％)，油酸(5.9％)、硬脂酸(3.88％)。其中不饱和脂肪酸含量占71.53％，饱和脂肪酸含量占28.47％。各种不同的磷脂，特别是由动植物细胞膜抽提的天然磷脂，在水溶液中磷脂分子能够自动形成球囊状、内含水溶液的脂质体结构。英国专利1523965批露大豆磷脂经常被用于制备脂质体[British Patent 1523965 1977，1，Inperial Chemical Industrial Ltd.andNational Research Development corporation，]。超声扩散是制备小的、单层膜脂质体的常用方法[Huang C.H. Studies of phosphatidylcholine vesicles formation and physicalcharacteristics.Biochemistry 1969 8：344]。经超声制备的脂质体，其直径在200-500，由单一的磷脂双分子层形成了含水的内腔，并具有以下特点：(1)对渗透性不敏感(2)70％的磷脂分子定位于膜双分子层的外层(Gruler H.Microstructure and transportproperties of single shelled vesicles and monolayers of lipid mixtures andlipid/protein alloyes in Liposomes Drugs and immunocompetent Cell Functions.Edited by Claude Nicolau 1981.99 15-27)在大量的水环境中处于热力学最稳定的状态。(4)大单层膜脂质体(LUV)和多层膜脂质体(MLV)经静脉注入体内后能够被血循环网织内皮细胞迅速清除，而小单层脂质体(SUV)作为药物载体能够避开网织内皮细胞并很容易分布其它组织中。参考Gruller方法在本发明中限定的水溶注比例中大豆磷脂形成热力学稳定的单层小脂质体结构。脂质体(Liposome)作为生物膜的模型受到广泛注意和应用(杨福愉：脂质体(Liposome)在生物膜研究和药学方面的应用。生物化学与生理学进展1977(6)36)。大豆磷脂是制备脂质体的较好天然磷脂(中国科学院生物物理研究所三室生物膜组：蛋白质嵌入脂质体的研究：细胞色素C嵌入脂质体的研究。生物化学与生物物理学进展1978.4，1)。

在超声振荡的条件下，将hCGRP分子与磷脂分子充分均匀混合，创造两种分子充分接触的机会，然后经静态保温，相分离后将达到热力学最稳定的结构状态：带有电荷的极性基团与环境中水分子相互作用，极性基团的相反电荷将因离子引力的作用相互结合达到稳态；疏水部份将竭力排出水分子，借助疏水作用相互聚集到一起也形成稳态。所得到的人降钙素基因相关肽组合物体内半衰期由原料药的9-12分钟延长到72分钟；在水溶液当中保存时间延长，血管扩张活性及结构的稳定性由原料药的15天延长到二年；血管扩张有效剂量大大降低，hCGRP的使用剂量仅相当于原料药的十万分之一；而且易于被粘膜吸收，可经口腔、鼻腔、直肠粘膜外用，生物利用度达到80％左右；临床研究表明，对于200例高血压患者和充血性心力衰竭患者具有明显的疗效，至今未发现毒副作用。

实施例l大豆磷脂质体的制备

将25克注射用大豆磷脂膏(购自北京化学试剂公司(上海油脂厂生产))溶于1000ml分析纯氯仿-甲醇(2∶l，v/v)溶液中，用1000ml圆底烧瓶在旋转蒸发仪(XZ-6，中科院科龙公司生产)上减压蒸馏，最终在烧瓶下半部形成金黄色磷脂膜。

在确认有机溶剂被除去之后经减压旋转蒸馏15分钟，然后用氮气再度干燥15分钟。在干燥的磷脂中加入250ml蒸馏水和20粒玻璃珠，先后在振荡器(HZS-D，哈尔滨东联公司)和超声仪(DF-6P3c，宁波新艺研究所生产)振荡30分钟。hCGRP与脂质体膜重组

10mg hCGRP(BACHEM，Swizerland)溶于250ml蒸馏水中，均匀搅拌5分钟后，与已制备的250ml脂质体溶液混合，搅拌5分钟。之后插入探头超声仪DF-6P3c(宁波新艺研究所)的超声仪探头，(超声强度为：20kHz)进行超声，超声2分钟歇3分钟，共三次，然后在水浴振荡器HZS-D(哈尔滨东联公司)中37℃保温40分钟。离心分离重组的脂质体

方法：由上述方法得到重组溶液冷却到4℃后，超速离心机VAC 602型(德国，WEB Lipzig)离心沉淀(400000×g，40分钟，4℃)，并用经6#除菌漏斗除菌过滤后的重蒸馏水洗涤3次。冻干和溶解

方法：沉淀后脂质体在冻干机冻干LGJ(军事医学科学院试验仪器厂生产)冻干。冻于后样品再用经6#漏斗除菌过滤后的重蒸馏水溶解(磷脂∶水＜1∶1000)。经过溶解的样品(5ml水溶液中含有20-2000pghCGRP)，100℃灭菌30分钟，并灭菌封瓶保存。实施例2

按照实施例1的方法制备本发明所述的组合物，不同的是比较磷脂与hCGRP的比例对重组效果的影响为了使hCGRP能够有效的在大豆磷脂脂质体膜上重组，减少游离的hCGRP的比例，增加重组后hCGRP的稳定性，我们比较了不同比例的多肽和磷脂的重组效果，观测了重组后hCGRP的血管扩张活性在保存24个月后的变化，正如表1所示。表1 hCGRP与大豆磷脂比例对重组效果及生物活性的影响  比例(w/w)          游离hCGRP    相对血管扩张活性  (hCGRP/脂质体)  1∶1               80.2±10.1     0.02±0.01％  1∶10              24.5±3.6％    1.2±0.3％  1∶100             15.7±1.9％    32.6±6.7％  1∶1000            0.1±0.02％    95.1±11.4％  1∶10000           0.1±0.03％    94.9±13.9％  1∶250000000       0±0％         100±0％

方法：按表中的比例将hCGRP与大豆磷脂脂质体重组。重组后脂质体超速离心沉淀，测定上清液中hCGRP含量作为游离的hCGRP测定指标。然后将每批样品分为两组，一组充氮熔封后保存在-70℃冰箱内作为对照样品，另一组悬浮于水溶液中(1∶1000，w/w)无菌处理后熔封常温保存。24个月后测定其活性并与对照样品比较以相对％表示。每个数据代表五次独立试验的平均值±SD。

由表的数据可见，当大豆磷脂重量与hCGRP比≥1000时，hCGRP完全能够重组到脂质体膜上，几乎没有游离的hCGRP存在。更重要的是，当hCGRP与磷脂的比例大(例如1∶10)时，磷脂的静电作用和疏水作用对hCGRP的保护作用远不及比例小(例如1∶1000〕的情况，24个月后hCGRP的相对活性分别为0.02％和95.1％，说明过量的磷脂对于hCGRP的重组和生物活性稳定性十分重量。实施例3

按照实施例1的方法制备本发明所述的组合物，不同的是观察溶液离子强度对hCGRP与大豆磷脂重组效果的影响。溶液的离子强度对脂质体的形成和重组十分重要。hCGRP在大豆磷脂脂质体上重组效果同样受到环境中的离子强度影响，表2例举了在不同浓度离子强度溶液中hCGRP重组效果的数据。表2溶液离子强度对hCGRP与大豆磷脂重组效果的影响NaCl Conc(mM)     0           10            50           100           150Free hCGRP    0.2±0.1％  11.6±1.8％   24.5±4.2％   35.5±7.9％  36.1±4.1％

方法：在不同浓度的NaCl水溶液中将hCGRP与大豆磷脂脂质体重组，然后离心将脂质体沉淀，测定上清液中游离的hCGRP含量以总量的％表示。hCGRP和大豆磷脂质的比例为1∶1000(w/w)。每个数据代表5次独立试验结果的平均值±SD。

由表的结果可以看到，离子强度增加不利于hCGRP与大豆磷脂脂质体的重组，说明hCGRP与大豆磷脂的重组很大程度上取决于它们之间的静电作用，环境中的离子能够减少它们之间的离子键的结合，因此在纯水(离子强度＝0)条件下它们之间的结合达到最佳状态。比较例1

按照实施例1的方法制备本发明所述的组合物，不同的是用两种不带电荷的磷脂代替大豆磷脂分别进行实验。

由表3可以看到，hCGRP与过量的三种不同的磷脂重组能力明显不同，与大豆磷脂的结合能力达到99.9％，几乎无游离的hCGRP存在。相反，卵磷脂(磷脂酰胆碱，PC〕和脑磷脂(磷脂酰乙醇胺，PE)与hCGRP的结合仅达到总量的21.2％和30.3％，大部分hCGRP处在游离状态。这是由于后者的极性头部不带有任何电荷的中性磷脂，而大豆磷脂头部含有40％的负电荷与hCGRP碱性氨基酸残基的正电荷形成的稳定的静电结合。表3 hCGRP与大豆磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和脑磷脂(磷脂酰乙醇胺)重组能力(％)的比较样品            Kd      ％      Kd      ％hCGRP           0.52    100％   0.04    0％hCGRP+PC        0.52    79.8％  0.04    21.2％hCGRP+PE        0.52    69.3％  0.04    30.3％hCGRP+大豆磷脂  0.52    0.1％   0.04    99.9％比较例2

在三种磷脂脂质体上重组的hCGRP在保存期间结构稳定性研究-反相HPLC定量分析完整的hGGRP含量(％)的变化。表4

                                 时间(月)

       0      3       6      9      12     15     18     21    24大豆磷脂  98.4   98.4    99.0   98.0   97.8   97.8   97.1   97.1  97.0％面积    ±2.4  ±2.1   ±1.9  ±2.4  ±2.1  ±2.0  ±1.8  ±1.9 ±1.7PC        99.2   90.2    83.3   76.4   70.1   68.2   66.1   65.8  65.1％面积    ±3.3  ±2.9   ±3.4  ±3.1  ±2.6  ±2.5  ±1.9  ±2.0 ±1.9PE        98.9   94.5    89.2   85.3   82.1   76.6   70.3   68.5  64.4％面积    ±2.9  ±3.1   ±2.2  ±3.3  ±1.9  ±1.7  ±1.6  ±2.1 ±2.2

方法：样品中hCGRP使用酸抽取方法和反相HPLC分析方法进行分析，每次层析均经计算机计算出hCGRP峰值保留时间(retention time)和在该时间点的峰面积。每个数据为5次独立数据平均值±SD。每次分析均用hCGRP标准品进行反相层析校正，确证hCGRP滞留时间在21.5-23.0分钟之间。峰面积百分数表示hCGRP纯度，即完整hCGRP的相对含量。

结果证明了重组在大豆磷脂脂质体膜上的hCGRP纯度在24个月保存期间几乎没有变化。用标准品hCGRP来校正层析的滞留时间，确认hCGRP峰出现位置，在此基础上得到的峰面积百分数是hCGRP纯度在不同保存时间的变化值。在24个月保存期间，hCGRP纯度仅降低了1.4％，说明重组在大豆磷脂脂质体膜上的hCGRP是非常稳定的。相反在PC和PE上重组的hCGRP不稳定，完整的hCGRP在24个月后仅保存65.1％和64.4％，可能是由于hCGRP与膜不能形成稳定的结合，在保存期间由膜上脱落下来被氧化水解成片段。比较例3

在三种脂质体膜上重组的hCGRP在水溶液保存24个月期间血管扩张活性(ED50，×10^-18mghCGRP/ml〕的比较表5

                            贮存时间(月)样品  0        3      6      9      12     15    18    21    24对照：冻干(at-70℃，n＝5)平均  4.7      4.9    5.2    5.1    5.3    5.2   5.1   5.2   5.3±SD  ±0.6    ±0.5  ±0.7  ±0.8  ±0.5  ±0.7 ±0.6 ±0.6 ±0.7在水中大豆磷脂(at 25℃，n＝5)平均   5.1    4.9    4.9    5.3    5.5    5.2    5.5    5.6    5.9±SD   ±0.7  ±0.8  ±0.9  ±0.7  ±0.6  ±0.7  ±0.8  ±0.6  ±0.8在水中PC(at 25℃，n＝5)平均   4.19   15.2   50.6   151    451    865    1133  1566    1923±S    ±0.8  ±3.2  ±10.3 ±21.2 ±99.3 ±153  ±333 ±439   ±544在水中PE(at 25℃，n＝5)平均   5.2    10.3   33.4   99.1   329    634    903   1234    1633±S    ±0.7  ±2.4  ±6.5  ±15.8 ±82.8 ±101  ±125 ±289   ±345

方法：样品的血管扩张活性检测使用微循环系统进行分析，冻干(Lyophilized)的重组后hCGRP在-70℃冰箱内保存，作为对照样品。在水溶液保存的重组后hCGRP，经灭菌封瓶后在25℃保存，Lipid∶H₂O＝1000∶1每三个月分别取样进行检测。麻醉后家兔眼球结膜血管被用于hCGRP活性检测。浓度累积性由低(10^-22mghCGRP/ml)到高(10^-15mg hCGRP/ml)增加，在量效半对数曲线上求出相应的ED50值。ED50的单位为hCGRP的含量＝×10^-18mg hCGRP/ml.。

表5列出了不同保存时间，冻干低温保存样品与溶液中常温保存样品的血管扩张作用的半数有效剂量的变化。大豆磷脂重组样品的ED50几乎没有改变，说明在大豆磷脂膜上重组后的hCGRP具有很好的生物学稳定性。相反PC和PE重组的hCGRP血管扩张活性随着保存时间增加明显下降，24个月后活性降低100-1000倍。上述结果说明，脂质体膜的负电性头部对重组的hCGRP生物学稳定性十分重要。实验例1 hCGRP脂质体结合的检测

试验参考Berk的方法(Berk D.and Marcinka K.Gel chromatography in separationMethods.Deyl z et.1984.271.)进行。将磷脂重组前和后的hCGRP样品溶解在0.1MTris-HCl，pH8.8溶液中。取1ml样品应用于1.5×46cm SephadexG-50 fine凝胶柱上，凝胶柱事先已用样品液平衡过。A206和A700分别用于对hCGRP和dextran 2000进行监测。所有样品均含有dextran 2000和³²PO₄作为柱胶外体积及凝胶空隙洗脱体积的标记物。

当无磷脂存在时，hCGRP洗脱分配系数出现在Kd＝0.52，当有磷脂存在时，Kd＝0.04，接近胶外体积(void volume)，分配系数Kd值能够反映被层析分子或颗粒的大小。未重组的hCGRP在Sephadex G-50fine柱层析中Kd值为0.52，而重组后hCGRP Kd值为0.04。说明hCGRP与磷脂分子结合成分子分子量很大的复合物，大小接近了葡聚糖(blue dextran 2000，Pharmacia)。表6是凝胶过滤分析重组前后hCGRP在层析过程中的分配系数数据。

表6、hCGRP与大豆磷脂结合的证据-Sephadex G-50凝胶层析分析

样品            Kd(G-50)

hCGRP           0.52     0.54  0.51

hCGRP+磷脂      0.04     0.04  0.05

蓝葡聚糖2000    0

³²PO₄        1每个数据代表一次独立检测结果。

由表6数据可以看到，hCGRP与大豆磷脂脂质体重组后形成了分子量接近葡聚糖2000的组合物，证明hCGRP与大豆磷脂形成了一种组合物可能适用于作为临床药物。实验例2 hCGRP重组的脂质体物理、化学稳定性研究

脂质体作为药物载体的一个重要条件是它在保存期间具有足够的稳定性。大豆磷脂脂质体正如前文所述，脂质体外表面大量的负电荷能够有效防止脂质体在保存期间的融合导致的脂质体大小的变化。在大量水环境中这种带负电的颗粒处在热力学最稳的游离状态。疏水尾部大量的不饱和键存在减少了膜的流动性，从而使环境中的水分子很少有机会进入膜内的疏水区，防止因水解和氧化作用导致的结构的破裂。

溶血磷脂是磷脂分子水解产物，是化学稳定性的重要指标。本发明使用TLC方法监测脂质体在保存期间溶血磷脂的含量变化，使用柱层析方法观测脂质体在保存期间洗脱体积的变化，作为物理稳定性的指标[Szoka.F.et al.Comparative propertiesand methods of preparation of lipid vesicles(liposomes).Ann.Rev.Biophys.Bioeng.1980 9：467.5]。溶血磷脂含量分析

大豆磷脂脂质体在保存期间溶血磷脂酰胆硷(LPC)含量(％)的变化。保存条件：25℃，磷脂在水中的含量为1∶1000(磷脂∶水，w/w)，并经100℃灭菌30分钟后封闭保存。

TLC方法分析溶血磷脂酰胆硷(LPC)在脂质体中的含量，硅胶板H，Type60来自Merk公司(西德)，展开溶剂系统及展开条件如前所述。溶血磷脂标准品购自Sigma公司，作为脂质体和hCGRP重组脂质体磷脂分析的对照。

在所述展开条件下，LPC的Rf值是0.04。两种经灭菌处理样品在保存期间，进行TLC分析，每个数据代表5个独立检测结果的平均值±SD。样品与标准品LPC混合后点样经TCL单向及双向分析，展开后均为一个斑点。

实验结果是，在24个月保存期间，大豆磷脂脂质体LPC含量逐渐增加，由2.1±0.34％增加到24个月后的4.7±0.51％(p＜0.01)，hCGRP重组后的脂质体中LPC含量由1.9±0.22％增加到3.4±0.46％p＜0.01)。换句话说，在单纯脂质体膜中，在24个月保存期间LPC增加了2.6％，而在重组hCGRP的脂质体膜中，LPC仅增加了1.5％，可能是由于hCGRP嵌入膜内之后，其亲水氨基酸残基的正电荷增加了，带负电荷的磷脂膜表面的稳定性，其中正负离子间的作用起到了主要作用。

另外，hCGRP重组的和不重组的大豆磷脂脂质体样品，经24个月的保存时间，脂质体均无大小变化，说明在1000∶1的水和磷脂(w/w)条件下，经超声制备的单层膜小脂质体处于热力学稳定状态，未发生融合与脂质体大小的变化。重组hCGRP的脂质体大小也同样未发现明显的改变。实验例3  脂质体膜重组的hCGRP稳定性的分析

本发明从三个方面检测了在保存期间重组在大豆磷脂脂质体膜上hCGRP稳定性并与游离的hCGRP进行了比较：

A.hCGRP与脂质体膜结合稳定性：

Sephadex G-50柱层析检测保存期间由脂质体膜脱落下来的hCGRP含量；

B.hCGRP生物学活性变化：微循环系统检测血管扩张活性。A.hCGRP与脂质体膜结合稳定性分析

将hCGRP与大豆磷脂脂质体重组的样品经100℃，30分钟灭菌后封瓶保存，每隔3个月进行凝胶过滤检测在Kd＝0.04和Kd＝0.52的吸收值，并用标准品hCGRP在同样层析条件下进行较正。Kd＝0.04是新鲜制备的hCGRP脂质体的分配常数，Kd＝0.52为hCGRP标准品在溶液中游离状态下的分配常数。比较保存期间hCGRP重组后脂质体的Kd值，可以证明hCGRP是否由脂质体膜上脱成为游离的hCGRP。Sephadex G-50fime柱层析方法详见图2中的介绍。每个数据为3次独立柱层析的结果平均值±SD值。

hCGRP与大豆磷脂脂质体重组后，在保存期间hCGRP是否会脱落下来，通过凝胶过滤进行检测，并用hCGRP标准品进行校正。结果表明，在24个月的保存期间hCGRP没有由脂质膜上脱落下来。正如前所述，hCGRP结构特点(含有正电荷和大量疏水氨基酸残基)及大豆磷脂的结构特征(含有负电荷和强疏水的不饱和键的尾部)使两者的重组脂质体处在热力学最稳定的状态。

hCGRP重组脂质体保存条件：25℃，灭菌封瓶保存。B.hCGRP血管扩张活性分析

本发明比较了在大豆磷脂脂质体膜上重组的hCGRP和未重组的hCGRP在水溶液中保存和在人血浆中保温过程中血管扩张活性的变化。

根据Faraci方法[Faraci F.M.et al.Circulation Research.1993 72：476-480.]进行眼球结膜血管直径测量。白色新西兰家兔。体重2.5-3.5，用戌巴比妥钠麻醉(30mg/kg，i.v.)后，固定头部。眼球结膜血管使用显微镜(江南光学仪器厂)、联结摄像头，微机、录像机的微循环系统(中国大恒公司)进行测量。局部血管图像存入计算机，然后用图分析程序测量血管直径。10ml经过稀释的样品及空白对照样品(H2O)滴人眼内，记录用药前后血管直径变化。在不同保存时间的每组样品(重组的或未重组的hCGRP)均经相同倍数的稀释后进行活性测定，稀释倍数以保存前(时间＝0)获得最大血管扩张活性的浓度为标准。

在水溶液中保存的在脂质体上重组的和未重组的hCGRP样品在0、30、60、90天分别检测他们的血管扩张活性，得以下结果。

表7、在大豆磷脂脂质体膜上重组的hCGRP和未重组的hCGRP血管扩张活性的比较

A.水中，25℃

               hCGRP                     脂质体-hCGRP

天     0     30     60     90     0      30     60     90

1      +189  +142   +94    +82    +191   +189   +192   +201

2      +191  +133   +99    +79    +193   +194   +190   +191

3      +181  +152   +84    +63    +184   +186   +188   +181

4      +192  +161   +99    +88    +199   +202   +198   +200

5      +179  +165   +114   +102   +221   +219   +221   +209

平均   +187  +151   +98    +83    +198   +198   +198   +196

(±SD) (8.9) (14.2) (9.2)  (12.4) (16.4) (13.2) (12.7) (14.3)

B.血浆中，37℃

            hCGRP                 脂质体-hCGRP

小时 0     12    24     48    0     12    24    48

1    +213  +102  +52    +29   +197  +191  +193  +190

2    +191  +93   +49    +33   +223  +190  +194  +189

3    +187  +114  +79    +22   +186  +187  +185  +181

4      1+94  +90    +82    +19   +187   +185   +186  +179

5      +188  +87    +51    +24   +195   +192   +193  +183

平均   +195  +97    +63    +25   +198   +189   +190  +184

(±SD)(16.9) (14.4) (16.7) (6.8) (19.2) (12.3) (7.2) (6.1)

由此可见，未重组hCGRP的活性随着保存时间延长而明显降低，到第90天，其活性由最初的+187±8.9％降低到+83±12.4％(p＜0.001，n＝5)；而重组后的hCGRP活性却没有明显变化.在人血浆中，未重组的hCGRP的血管扩张活性由最初的+195±16.9％到48小时后降低到+25±6.8％，而重组的hCGRP仅由+198±19.2％降低到+184±6.1％，(p＝0.5，n＝5)。

这些结果说明，在大豆磷脂脂质体膜上重组的hCGRP在保存期间或在血浆中比未重组的hCGRP具有更高的生物学稳定性。

另外，在24个月保存期内无明显差异，而且在统计学分析中未见明显差异性，说明在大豆磷脂膜上重组后的hCGRP具有很好的生物学稳定性。治疗例1人降钙素基因相关肽大豆磷脂脂体膜  重组物治疗充血性心力衰竭的作用1、临床资料

病例选择CHF病人16例，男性7例、女性9例、年龄54-75岁，平均66.3岁。病程5-13年。，平均6，8年。心功能分级按照NYHA标准，IV级6例、III级7例、II级3例，右心功能不全5例，左心功能不全11例。所有病例停用其它抗心衰药物(如洋地黄类)三天以上。

药物：选用实施例制备的药物组合物，其中每5ml水溶液中含20pg hCGRP。

用药方法：针剂2000BU/5ml.

粘膜用药：在口腔或鼻腔滴入40-80BU(1-3滴)，也可肛门注入2000BU，每日3次。

静脉用药：2000-8000BU(2-4支)，加人5％GS或0.9％NS100-250ml，每日1次静点。

观察指标：观察用药前、用药后每日呼吸次数、肺部罗音、心律、心率、肝脏大小、浮肿、体重、尿量、心功能变化及心动超声排血指数等改变2、结果

应用Liposomal hCGRP治疗CHF16例。显效9例、有效6例、无效1例。见表8。

观察病人治疗过程中未出现头晕、头痛、低血压、肝肾损害等副作用。

       表8、脂质体hCGRP治疗CHF的疗效观察编号    用药前心功能    给药        疗效(心功能)

                            显效  有效   无效1 CO中毒   III级    鼻粘膜一次        II级2 肺心病   IV级     鼻粘膜一次        III级3 CO中毒   III级    鼻粘膜一次        II级4 冠心病   II级     鼻粘膜七天               II级5 高血病   II级     鼻粘膜七天        I级6 高心病   IV级     静脉七天    I级7 陈旧心梗 IV级     静脉七天          II级8 心肌病   III级    静脉七天    I级9 心肌病   III级    静脉七天    I级10心肌病   IV级     静脉七天          III级11心肌病   III级    静脉七天    I级12高心病   III级    静脉七天    I级13高心病   IV级     静脉七天    II级14高心病   III级    静脉七天          II级15高心病   IV级     静脉七天    II级16高心病   III级    静脉七天    I级3、讨论

充血性心力衰竭(CHF)是由于心肌收缩力损害导致心输出量降低所致。改善心肌收缩力是治疗CHF的主要课题。动物实验证实CGRP具有血管扩张和正性肌力作用。提示其对CHF有治疗作用。有学者给予CHF病人(9例)静脉输入CGRP(8.0ng/kg/min)8小时，使患者右心房压、肺动脉楔压及平均动脉压明显降低、心输出量、心搏量增加、肾血流和肾小球滤过率显著增加。而采用本发明的组合物临床治疗CHF16例，效果十分显著。脂质体hCGRP具有以下特点：(1)脂质体hCGRP具有缓释长效特点，疗效维持平均10小时，为国外文献报导的五倍。(2)易于被粘膜吸收，因而可以经鼻腔、肛门粘膜外用。(3)生物利用度提高，用药剂量较国外文献报导减少约10⁶倍。治疗例2人降钙素基因相关肽大豆磷脂脂质体膜重组物对高血压的治疗作用一、资料与方法1、一般临床资料

本组21例。除1例原发性醛固酮增多症(手术后病理诊断双侧肾上腺皮质增生)外，其余全部为缓进型高血压病。其中男性10例，女性11例，平均年龄62.2(45-73)岁。高血压病史3-37年，全部为住院病人，临床资料齐全。诊断明确，按照WHO/ISH 1993年联合提出的高血病分期标准分类[陈灏珠主编等医药院校教材内科学第四版。人民卫生出版社。北京。1996.9.4版，第15印刷：227-228.].II期11例，III期10例。2、方法

16例受检者用药前停用其它降压药物2周以上，5例使用心痛定、卡托普历和/或β受体阻滞剂，降压效果不满意而改用本药。

药物：本发明实施例1制备的药物组合物水溶液，其中每5ml水溶液中含20pghCGRP。

a、粘膜用药：口腔或鼻腔滴注40-80BU(2-4支)，每日3次；肛门注入2000BU，每日3次。

b、静脉用药：2000-8000加5％葡萄糖(或0.9％氯化钠)溶液100-250ml，每日1次静点。

c、第一天用药后15、30、60、120、180分钟测量血压，之后每天测量六次。

d、用药前后观察记录病人的脉搏、心脏听诊、尿量、肝脏触诊、水肿情况并检查：心电图、心动超声图，胸部X线、肝功、肾功、血脂、血糖及血浆钾、钠、氯。3、疗效标准判定

参照1979年心血管流行病学及人群防治汇报讨论会(河南郑洲)纪要的判定标准[《中华心血管病》杂志  1979.7：(2)：18]。

显效：舒张压下降≥10mmHg并降至正常或下降20mmHg以上。

有效：舒张压下降＜10mmHg，但降至正常或下降10-19mmHg。

无效：未达上述标准。

目前已注意到收缩压升高的重要性[陈灏珠主编等医药院校教材内科学第四版。人民卫生出版社。北京。1996.9.4版，第15印刷：227-228.]，对于单纯收缩压升高的病人参照上述标准，但收缩压需相应地下降大于20mmHg。二、结果

本组用脂质体hCGRP治疗高血压病人21例，单纯鼻粘膜用药4例；单纯静脉用药4例；其余粘膜和静脉联合用药13例，其中肛门和口腔用药各2例。治疗结果

21例病人收缩压下降20-105mmHg，平均46mmHg；舒张压下降5-25mmHg。平均17mmHg，(t值分别为9.46、10.49，p＜0.001)显效13例，有效7例，无效1例。用药后发挥降压作用不迟于5分钟，疗效维持平均10小时。毒副作用

2例慢性鼻炎病人，用药后出现轻度鼻塞，改用其它途径用药后，症状自行消失。治疗过程中未发生头晕、头痛及肝肾损伤等副作用。三、讨论

1、CGRP是存在于人体内的降钙素相关基因肽。由沃华公司生产的人降钙素基因相关肽大豆磷脂脂质体膜重组物Liposomal hCGRP，避免了该药在体内被迅速降解失效的过程，起到缓释、长效作用，且更易为组织细胞所吸收。该药治疗高血压具有起效快、效果理想、安全可靠、用药方法简便易行等特点。本组21例，显效率为61.9％，总有效率为95.2％，仅1例无效。粘膜用药与静脉用药对降压效果无明显差别。

2、文献报告在动物实验中，CGRP注射剂量越大，降压作用越明显，具有剂量相关效应[9]。而本组临床应用中，口腔和鼻粘膜用药的最佳剂量为每次40-80BU剂量加大降压效果反而不好，此种差异是否由于其对心肌的正性肌力作用，增加了心输出量，有待于进一步研究。

3、Shekgar YC.等报告[Shekhar YC.et al.Effects of Prolonged Infusion ofHuman Alpha Calcitonin Gene-Related Peptide on Hemodynamics，Renal Blood Folw andHormone Levels in Congestive Heart Failure Am J Cardiol 1991；67：733.]，使用CGRP8.0ng/kg/min连续静脉输注8小时，(总剂量为3840ng/kg)，停药30分钟后体循环动脉压下降18％(p＜0.05)。本组病人静点最大剂量为8000BU/每日，相当于-780pg。按100公斤体重计算为0.8pg/kg，仅为上述hCGRP剂量的2.0×10^-7倍，同样取得满意的降压效果。

4、毒副作用少。仅2例鼻腔滴注后出现鼻塞，可能与鼻粘膜血管充血、扩张有关，停药后自形消失。因此，鼻粘膜充血、水肿、鼻塞病人应改用其它途径用药。