保持发酵培养基中低的氨和脲水平发酵制备氧氮双环庚酮衍生物的方法

摘要

改良的在合适的培养基中由可产生氧氮双环庚酮的生物体通过发酵制备氧氮双环庚酮类化合物的方法，其中氨的水平保持较低以避免对酶如脲酶的阻遏。

说明书

本发明涉及增加棒酸和其它氧氮双环庚酮类化合物(clavam)的产量的方法，包括那些来自具有合适的生物合成路径的生物体的有很强的β-内酰胺酶阻遏活性的氧氮双环庚酮类化合物。

微生物，特别是链霉菌产生多种抗生素，包括棒酸和其它氧氮双环庚酮类化合物，头孢菌素和青霉素类化合物。

棒酸是一种重要的β-内酰胺酶阻遏剂，它是以沃格孟汀(AUGMENTIN)(Smithkline Beecham Plc的商标名)的名义出售的抗生素的一个关键成分。生产棒酸的商业方法是带棒链霉菌发酵。在英国专利说明书1,508,977中描述了生产棒酸的合适的发酵培养基。

尽管可由已有的方法以可接受量产生棒酸和其它氧氮双环庚酮类化合物，但仍需要提高发酵肉汤中棒酸的效价，从而可更经济地生产产物。可提到的解决问题的一条途径是筛选带棒链霉菌ATCC 27064或其它的产棒酸的微生物的有更高效价的突变菌株。至今，有关通过改变发酵罐中的反应条件而得到更高效价的棒酸的方法改良相对少量地公开了。

通常在氮源中包含氨，因为发酵的氮输入操作对棒酸产率是至关重要的。但是我们发现产生棒酸的发酵方法对系统中氨的浓度特别敏感。

根据本发明，提供了通过在合适的培养基中由产氧氮双环庚酮生物体发酵制备氧氮双环庚酮类化合物的方法，其特征在于在发酵中氨的水平保持较低，以便防止氨对一种或多种关键酶的阻遏。

低水平，指小于50μg/ml。氨的水平必须保持在低于50μg/ml足够的时间，合适地为1到10小时；以便容许关键的氨可阻遏酶类的去阻遏和生物合成。已发现在常规的发酵条件下(氨水平大于100μg/ml)，氨阻遏多种氮代谢中的酶，包括催化脲向氨和二氧化碳转化的脲酶(参见V.Bascaran等，普通微生物学杂志，1989，135卷2465-2467页)。但是后者的研究与抗生素效价不相关并且任何具体的与氧氮双环庚酮或棒酸生产的改进相关的提示。

工作中一个令人惊奇的发现导致了本发明，即脲在棒酸发酵肉汤中积聚。脲产自棒酸生物合成过程，但肯定还有其它的脲的来源。

根据本发明的另一方面已经发现，如果致使在棒酸生产期间积聚的脲与脲酶反应，则棒酸的效价可得到相当的提高，例如10％级别的。

因此，本发明的另一方面提供了在合适的培养基中通过产氧氮双环庚酮的微生物的发酵制备氧氮双环庚酮类化合物的方法，其特征在于致使在发酵过程中得到的脲与脲酶反应。

脲酶可以是内在的(内源性的)或者外在的(外源性的)，也就是说可由产棒酸微生物产生(内在脲酶)或加入到系统中(外在脲酶)。

如果需要外在脲酶，该酶可从任何合适的来源得到并被加入到发酵反应中。在本发明的一个方面中，如果脲酶是内在的，其可通过产棒酸生物体脲酶的去阻遏表达而被释放。

此类去阻遏可由，如用氨之外的其它任何合适的碱调节pH值而实现。在该方法中，优选发酵时氨的浓度低至可发生去阻遏。此类去阻遏可通过研究反应培养基中pH曲线(profile)的变化而被很好的监测(参见下文实施例)。

在上面的方法中，pH控制剂可以是氨之外任何合适的碱，例如碱金属氢氧化物，如氢氧化钠。一旦发生了去阻遏并且尿酶被表达，最好是用常规的控制pH值的方式，以保证充足的氮供应。但是可任选地，氨之外的pH调节剂可在整个发酵中使用。

通常优选氨作为典型发酵中的添料(feed)，因为它有双重作用，即调节pH值和向发酵中引入氮的作用。它也可以作为棒酸盐(clavulanate)累积的离子抗衡而起作用。尽管由去阻遏氨可阻遏酶而获得的益处亦可通过在发酵的部分阶段使用替代的pH调节剂而达到，这样的优点也可这样达到：使用替代的pH调节剂，然后分批加入(batch)向发酵中引入所需的氮或通过添加铵盐。

在另外的脲酶去阻遏的方法中，可对分批加入或添加到发酵中的复合氮源的量进行调整。由复合氮源的脱氨反应释放的氨将会阻遏脲酶。因此，发酵中其量的调整或其释放特征将会影响脲酶去阻遏。

另外的提高棒酸效价的方法是向发酵反应中添加任何合适的化合物，该化合物可直接或间接影响发酵对氨或脲的浓度。

一种实施方式是加入一种，例如能够吸附氨从而降低其浓度的沸石的化合物。合适的氨吸附剂包括那些可将氨作为复盐沉淀的试剂，例如磷酸镁氨。

另一种降低脲浓度的方法是向发酵培养基中加入一种化合物，其可直接或间接增加产棒酸生物体中脲酶的表达。

还可使用遗传操作或菌株改良方法以增加产棒酸微生物所产生的内在脲酶的水平。例如可用菌株改良〔例如通过突变和随后在含如甲铵的特异培养基上筛选而得到(微生物学综述；1989；53，85-108)〕以制备可组成性表达脲酶的产棒酸微生物，即在存在氨时，脲酶不受到显著阻遏。类似的结果可由定向基因操作技术获得，包括对脲酶基因的操作以影响其调控，例如引起同一种棒酸生物合成路径中的酶相一致的表达。

上述方法的优点是可达到棒酸效价的相当大的增加。可用常规技术分离和纯化棒酸。

下面的实施例将说明本发明。在实施例中，除非特别指出，所用的方法和标准技术都如在Sambrook等(1989)分子克隆：实验指南，第2版中所给出的那样。实施例1-pH调节剂对棒酸效价的调节作用

在1000升规模的带棒链霉菌发酵中(5％种子发酵接种，20至60g/l大豆粉蛋白，1至3％糊精，1％到5％植物油，加上微量元素混合物，pH维持在6-8)，通过pH调节剂的调节，棒酸的产量可增加8％。

如果用2.5N NaOH代替氨以维持在发酵开始时其pH为6-8，则可在pH值曲线上观察到两个峰。第一个峰对应于大豆蛋白(Soyprotein)的脱氨作用，其释放氨从而使pH值增加。第二个峰是由于脲酶的去阻遏，它也释放氨。在观察到第二个峰之后(这可由比色法检测不到脲的存在确证)，将pH调节剂再转变为氨以保证反应培养基中充足的氮供应。实施例2-组成性脲酶生物体的制备

可产生带棒链霉菌的突变菌株，其组成性表达脲酶。将已用诱变剂(如紫外照射或亚硝基胍处理)处理的孢子接种到含甲铵和脲的琼脂上。在琼脂中，脲是唯一的碳源和氮源。甲铵不能被代谢，但可被生物体识别为铵从而对脲酶表达起阻遏作用。

选择能在该培养基中生长的突变孢子，并且证明其在发酵时组成性表达脲酶并且棒酸产量丰富。