肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及其应用

摘要

肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及其应用。以PGEM-3zf(+)质粒为载体，用内切酶切开该环状质粒。将直接以病人血清作为分析样品，以扩增片段为390Bp-430Bp的PCR产物用酶补平其末端，用连接酶把它连接到已酶切的质粒上成为环状的重组质粒，重组质粒可作为出血热病毒基因检测盒中的阳性参照物，用以对出血热病人的确诊。基因检测法灵敏度高，特异性强，该阳性参照物易于保存，用于电泳鉴定，易于判断，且可用于试剂盒的质量及操作正确与否的检验。

说明书

肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及应用，涉及基因工程生物技术，特别涉及分子生物学中的病毒基因克隆技术。

肾综合征出血热(HFRS)是由肯尼亚病毒汉坦病毒属(HantaVirus)中某些病毒引起的人类急性传染病。近年来迅猛发展的基因检测法(PCR法)是从核酸水平上检测病毒。此法灵敏度高，特异性强，能在早期的临床标本中直接检测病原体，如肺炎杆菌、结核杆菌、幽门螺杆菌、各型肝炎病等，其基因诊断试剂盒已进入了临床实验室。然而迄今为止，尚未有以病人血清为标本，用PCR法直接检测肾综合征出血热病毒的技术。

由上海市南汇县南华医院即我院申请的申请号为96116395.x、发明名称为肾综合征出血热病毒的基因检测方法及检测试剂盒的发明专利所提供的方法是直接以病人血清为分析样品，提取出血热病毒的RNA，经过逆转录(RT)、CDNA的合成，PCR扩增，然后对PCR的扩增产物进行电泳鉴定，如果标本扩增带与阳性参照物扩增带同一位置上出现光带，则可判定标本为阳性，显示出血液中存在出血热病毒，反之则无。该发明专利中所提供的检测试剂盒中的阳性参照物是采用(1)已确诊患有出血热病的病人血清，(2)市售的PCR marker。用病人血清作为阳性参照物，存在着如下问题：1、来源较困 难，固出血热病毒血症期短，不易得到早期标本；2、病人血清，不易较长时间保存；3、采用病人血清经PCR扩增后，电泳鉴定时可能会出现杂带而给结果的判断带来困难。而用市售PCR marker作为阳性参照物价格又很昂贵。出血热病毒的克隆当然是很好的阳性参照物，然而迄今为止尚无有此种技术。

本发明的目的在于提供一种肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆，它是采用由我院申请的申请号为96116395.x发明专利所提供的方法，对所获得的汉坦病毒基因的PCR扩增产物进行克隆，这种克隆可放在肾综合征出血热病毒的检测试剂盒中作为检测的阳性参照物。

本发明的目的通过如下技术实现。

克隆是选择一种质粒为载体，用内切酶切开环状的质粒载体，所需插入于被切开的质粒的插入物用酶补平其末端，再用连接酶把经酶切的质粒载体和插入物重新连接成环状得到重组质粒，再把它转化到宿主菌，通过细菌培养获得大量的重组质粒，可用于PCR阳性对照。本发明的技术特征在于，连接到已酶切的质粒载体中的连接物(或称插入物)即PCR产物是直接以病人血清为分析样品，以异硫氰酸胍为裂解液、醋酸钠作为RNA沉淀剂，提取肾综合征出血热病毒的RNA，经过逆转录、合成CDNA，做第一次PCR扩增，再做巢式PCR，进行第二次扩增，然后以电泳检测后(可以PCR marker对照)，确定为具有出血热病毒基因的扩增片断在390Bp-430Bp的PCR扩增产物。

做第一次PCR扩增的扩增引物采用：    

    核苷酸位置       引物序列primer1  30-49    CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2  648-631  AAT ATC AAA GAT CCC ATG

第一次PCR扩增需在扩增仪中循环35次，扩增片段为618Bp，将第一次PCR扩增产物做巢成PCR。进行第二次PCR扩增，第二次PCR扩增的扩增引物是：

      核苷酸位置       引物序列primer1    30-49    CAA TCA  GCA ACA TGG GGA TAprimer3   460-443   GGC TTG  CAG TAA GTG CT取得扩增片段为430Bp的PCR产物。

在做第二次PCR扩增时，扩增引物也可以

    核苷酸位置       引物序列primer4  70-89    GCC AGT TTA GTA TGG GCTprimer3  460-443  GGC TTG CAG TAA GTG CT组成一对引物，则得到扩增片段为390Bp的PCR产物。

克隆时选用双链环状的PGEM-3zf(+)质粒作为载体，用内切酶smaI切开环状载体，直接从肾综合征出血热病人血清中获得的汉坦病毒的PCR产物用klenow修饰酶补平其末端，再用T4DNA连接酶把已酶切的载体和根据上述方法制备的PCR产物重新连接成环状，得到重组质粒，将它转化至宿主菌，宿主菌采用大肠杆菌JM109感受态细胞，通过细菌培养获得大量重组质粒。所述的大量重组质粒是否确已获得可通过以未克隆的PGEM-3zf(+)质粒为对照走琼脂糖电泳来鉴定。该大量重组质粒即可用作为肾综合征出血热汉坦病毒检测试剂盒的阳性参照物，将它与应用申请号为96116395.x所提供的PCR方法获得PCR产物，共同走电泳，可用于出血热病的诊断。

本发明的优点在于：1、以经克隆的重组质粒作为阳性参照物易于保存，用于电泳鉴定时易于判断。2、克隆得到的重组质粒还可用来检验试剂盒的质量及操作是否正确。因为重组质粒克隆了汉坦病毒的基因扩增产物，它的电泳结果应该肯定呈阳性，如果呈阴性则可判定为试剂盒的试剂质量或操作有问题。

下面提供详细的实施例以对本发明的技术方案作进一步说明。

1、质粒载体酶切：

选用PGEM-3zf(+)质粒，用smaI酶切    

取PGEM-3zf(+)  (2ug/ul)(ug为微克、ul为微升)   2ul

SmaI         (lou/ul)         1ul

BufferI                       2ul

蒸馏水                        15ul

共20ul混和液在25℃温度下保温1小时后置70℃保温10分钟以灭活SmaI。取出4ul上述混和液走琼脂糖电泳，以未切过的PGEM-3zf(+)质粒为对照，判断是否酶切完全，然后于-20C保存。

2、PCR产物处理：    

采用由我院申请的申请号为96116395.x、发明专利所提供的方法，出血热汉坦病毒基因扩增产物即PCR产物用klenow酶补平其末端。

取PCR产物40ul klenow(5u/ul)(u为单位)在37℃下保温30分钟，加4ul、3mol(摩尔)、PH为5.2的醋酸纳，再加入80ul无水乙醇，置于-70℃保温15分钟，以转速为10000rpm，离心15min(分钟)，用70％乙醇洗涤，经真空干燥，溶于5ul无菌水，于-20℃保存。

3、连接：

取酶切过的PGEM-3zf(+)1ul

处理过的PCR产物      5ul

T4DNA连接酶(3u/ul)   2ul        

10×连接酶缓冲液     1ul

无菌H2O              1ul

共10ul混和液在22℃保温3hrs(小时)后于-20℃保存。    

4、转化：

应该说至上述步骤已完成了克隆过程，但为了验证PCR产物已克隆到了质粒载体，取得了重组质粒，需要将其转化到宿主菌，经细胞培养，以获得大量的重组质粒，再进行鉴定。

把已连接了PCR产物的质粒载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。从-20℃取出JM10g感受态细胞，置于冰上5min至融化。取100ulJM109感受细胞至预冷的载菌玻璃试管。加入10ul已连接了PCR产物的质粒载体，轻轻敲打混匀后置于冰上10min，于42℃保温45-50sec(秒)，立即置于冰上2min，加入900ul∠B(培养液)，于37℃，225rpm振荡培养1hr，取100ul涂布于含100ug/ml氨苄青霉素、0.5MIPTG(指示剂)，40ug/ml×-gal的∠B平板，37℃培养过夜。

5、鉴定：    

挑出白色菌落进行酶切鉴定。已连接了PCR扩增片段的重组质粒是呈白色的菌落，而呈蓝色的菌落则是未连接PCR扩增片段的质粒。挑出白色菌落，接种于21ul含100ug/ml氨苄青霉素的∠B培养液，37℃、225rpm振荡培养过夜。留出一点菌种后其余用promga(上海普洛麦格生物产品有限公司)生产的Wizand Minipreps DNA纯化系统抽提质粒。取一部分走琼脂糖电泳，以未克隆的PGEM-3zf(+)质粒作对照看分子量是否变大，可初步确定重组质粒。

为了进一步确定是否已取得了重组质粒还可以双酶切鉴定。

小量抽取重组质粒10ul(-1ug)，以ECORI(12u/ul)1ul、HindIII(10u/ul)1ul二个内切酶双酶切，加Muticore Buffer 2ul，无菌水6ul共20ul于37℃下保温1-2小时，走电泳，同时以PCR产物为对照，看有否比PCR产物分子量大51Bp的片段。该片段比PCR产物分子量究竟大多少，取决于所选择的二个内切酶，该二个内切酶决定了质粒被酶切的位置。最后，以重组质粒为模板，进行PCR扩增，产生的片段与血清PCR产物比较(对照市售的PCRmark)，二者的分子量应相一致。

上述的重组质粒可作为出血热病毒基因检测试剂盒中的阳性参照物，用以对出血热病人的确诊。其电泳鉴定的方法如下：

吸第二次肾出血热病毒PCR扩增产物的下层水相10ul和3ul溴酚兰染色液混匀，在2％琼脂糖凝胶上点样(凝胶含0.5ug/ul溴乙锭)，以肾综合性出血热病毒PCR产物的克隆为阳性参照物经TAE电泳缓冲液电泳20-30分钟，电压为5V/cm，在暗室中用紫外透视仪检测结果，如果标本扩增带与阳性参照物扩增带同一位置上出现光带，可判定标本为阳性，显示血液中有出血热病毒，反之则无。